Summary
Aquí presentamos un protocolo para cultivar subtipos específicos de células hipotalámicas en cultivo. Las células pueden seleccionarse en función de marcadores de membrana oportunos/únicos y utilizarse en muchas aplicaciones, como inmunofluorescencia, ensayos electrofisiológicos y bioquímicos.
Abstract
El hipotálamo regula los procesos metabólicos fundamentales controlando funciones tan variadas como la ingesta de alimentos, la temperatura corporal y la liberación de hormonas. Dado que las funciones del hipotálamo están controladas por subconjuntos específicos de poblaciones neuronales, la capacidad de aislarlas proporciona una herramienta importante para estudiar los mecanismos metabólicos. En este sentido, la complejidad neuronal del hipotálamo plantea desafíos excepcionales.
Por estas razones, se han explorado nuevas técnicas, como la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). Este artículo describe una nueva aplicación de la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) utilizando tecnología de microperlas para aislar una población neuronal objetivo de cerebros de ratones prenatales. La técnica es sencilla y garantiza un cultivo de neuronas hipotalámicas primarias de alta pureza y viabilidad con alta reproducibilidad. El hipotálamo se disocia suavemente, las neuronas se aíslan selectivamente y se separan de las células gliales y, finalmente, utilizando un anticuerpo específico para un marcador de superficie celular, se selecciona la población de interés.
Una vez aisladas, las neuronas objetivo pueden utilizarse para investigar sus características morfológicas, eléctricas y endocrinas y sus respuestas en condiciones normales o patológicas. Además, dadas las variadas funciones del hipotálamo en la regulación de la alimentación, el metabolismo, el estrés, el sueño y la motivación, una mirada más cercana a las neuronas específicas y específicas de la región puede proporcionar información sobre sus tareas en este entorno complejo.
Introduction
El hipotálamo es un área múltiple del cerebro que media las funciones endocrinas, autonómicas, viscerales y conductuales, incluida la alimentación, el metabolismo, el sueño, la temperatura corporal, el comportamiento social y el deseo sexual 1,2,3,4,5. La heterogeneidad funcional se logra mediante una combinación sinérgica de mecanismos bioquímicos y eléctricos: las neuronas hipotalámicas disparan potenciales de acción y secretan y liberan hormonas y neuropéptidos para modular las regiones cerebrales y los órganos del cuerpo. Finalmente, las neuronas hipotalámicas traducen los mensajes homeostáticos del cuerpo, respondiendo con retroalimentación a largo y corto plazo y regulaciones de retroalimentación6.
El complejo entorno neuronal del hipotálamo incluye neuronas endocrinas magnocelulares, que liberan oxitocina y vasopresina; neuronas parvocelulares, involucradas principalmente en la regulación hormonal sistémica, liberando, por ejemplo, la hormona liberadora de tirotropina (TRH) y la hormona liberadora de corticotropina (CRH) a la glándula pituitaria; grandes neuronas de proyección peptidérgica, que liberan orexina y hormona concentradora de melanina (MCH); y neuronas peptidérgicas parvocelulares del Núcleo Arqueado (ARC) que liberan POMC (proopiomelanocortina) y AgRP (proteína relacionada con agutí), denominadas ARCPOMC y ARCAgRP, respectivamente. Junto con las células secretoras, otras neuronas excitadoras e inhibidoras, incluidas las neuronas dopaminérgicas, glutaminérgicas y GABAérgicas 7, están involucradas en la formación de circuitos intrahipotalámicos y extrahipotalámicos, creando así redes coordinadas a gran escala de considerable heterogeneidad celular8.
La diversidad hipotalámica ha sido un desafío que los investigadores han estado tratando de superar durante los últimos 50 años. Para estudiar esta heterogeneidad en los hipotalami en desarrollo, maduros y envejecidos, los investigadores, por un lado, han estado empleando la secuenciación de ARN de una sola célula para explorar la organización neuronal, así como las firmas moleculares y transcriptómicas. Este esfuerzo ha proporcionado una mirada perspicaz a las variadas funciones de las neuronas hipotalámicas y ha abordado las conexiones entre la identidad celular y su posible papel en el sistema fisiológico 8,9,10. Por otro lado, las funciones neuronales han sido investigadas mediante manipulaciones optogenéticas y enfoques conductuales de fotometría de fibras, lo que permite una mirada cercana a la estructura de los circuitos. En las últimas dos décadas, la tecnología Cre-recombinasa ha permitido a los investigadores estimular o inhibir ontogenéticamente un grupo específico de neuronas mientras observan cambios en los comportamientos y las respuestas corporales 6,11,12.
Sin embargo, estos enfoques examinan las funciones hipotalámicas desde una perspectiva general sin profundizar en los mecanismos celulares específicos o en la base biológica de su papel dentro del complejo entorno hipotalámico. Para abordar esto, muy pocos estudios se han centrado en investigar las propiedades moleculares, bioquímicas y eléctricas utilizando cultivos hipotalámicos primarios heterogéneos. Estos estudios buscaron diseccionar procesos neuronales específicos en un ambiente complejo y generaron modelos integradores de mecanismos fisiológicos13,14,15. Sin embargo, las culturas no específicas plantean desafíos significativos. Por ejemplo, la conectividad fisiológica y la distribución anatómica de las neuronas se ven interrumpidas por la colocación de neuronas de diferentes regiones hipotalámicas que normalmente no interactuarían, creando efectos de confusión. Además, cada región tiene diferentes roles y poblaciones neuronales variadas, lo que dificulta el estudio de procesos biológicos simples.
Para hacer frente a estos desafíos, en la última década, se han implementado nuevos enfoques para aislar neuronas de interés, como el inmunopanning, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). El inmunopanning es una estrategia empleada para purificar células diana utilizando placas recubiertas de anticuerpos para una serie de selecciones no neuronales (negativas) y neuronales (positivas). Si bien esta técnica podría, en principio, generar cultivos celulares purificados de alto rendimiento, en la práctica, se utiliza principalmente para astrocitos y oligodendrocitos, ya que estas células pueden resistir horas de manipulación16,17. La tecnología FACS es una poderosa herramienta para clasificar células en función de marcadores fluorescentes y características celulares mediante citometría de flujo18,19,20. Sin embargo, muy pocos estudios utilizaron este método para aislar células para cultivos celulares. La técnica es costosa y requiere personal altamente calificado para su uso y mantenimiento; Además, es difícil mantener células viables y estériles al final del procedimiento de clasificación21. En general, MACS parece ser una técnica simple y no costosa para obtener cultivos altamente puros y viables de neuronas primarias hipotalámicas. El método utiliza perlas magnéticas unidas a las células a través de un anticuerpo. Esto permite aislar las células utilizando el campo magnético de la columna.
Aquí describimos un método basado en la tecnología MACS, que se utiliza típicamente con neuronas corticales. Este protocolo permite aislar, en principio, neuronas hipotalámicas viables y de alta pureza. En este estudio, preparamos cultivos primarios de neuronas que expresan el receptor de leptina (LepR), como las neuronas ARCPOMC y ARCAgRP , que están presentes solo en el núcleo arqueado. Estas neuronas responden a la leptina, una hormona anorexígena secretada por el tejido adiposo, de forma bioquímica y eléctrica. Por lo tanto, el aislamiento de este grupo de neuronas en cultivo permite estudiar in vitro sus propiedades hormonales, metabólicas y eléctricas.
Protocol
NOTA: En la Figura 1A se ilustra gráficamente una vista general del procedimiento experimental. Todos los experimentos con ratones realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de nuestra institución. Utilizamos ratones C57BL6/J de 3 meses de edad, que se alojaron en un vivero aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidados de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC), bajo el cuidado de un veterinario. Los ratones vivieron en jaulas grandes, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, y fueron alimentados ad libitum.
1. Verificación de la concepción y el embarazo
- Coloque ratones de cualquier origen y genotipo de interés para la cría. Registra la fecha y el peso de la hembra antes de la concepción.
- Después de 6 h, inspeccione a la hembra en busca de una placa con una sonda. Si la placa está presente, separe a la hembra del macho. Si la placa no está presente, mantenga a la hembra en la jaula hasta el día siguiente, luego separe a los ratones.
- En los días 7, 10 y 14 después de la concepción, pesar a la hembra para confirmar el embarazo.
2. Preparación de medios, placa de 24 pocillos y material
- El día del aislamiento celular, coloque cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-D-lisina listos para usar (consulte la Tabla de materiales) en una placa de 24 pocillos de la siguiente manera:
- Bajo una campana biológica, esterilizar un solo paquete que contenga 15 cubreobjetos con etanol al 70% y dejar secar. Abra el paquete y coloque los cubreobjetos en una placa de 60 mm. Agite la placa horizontalmente para separar los cubreobjetos. Luego, invierta la placa para recoger cubreobjetos individuales que se colocarán en los pocillos de una placa de 24 pocillos.
- Lave los cubreobjetos una vez con 1.0 ml de solución salina balanceada de Hank estéril (HBSS) durante 5 min.
- Mientras tanto, prepare 20,0 ml de medios de siembra de la siguiente manera: a 18,31 ml de BME (Basal Medium Eagle, + Earle's Salts), suplementado con 1,0 ml de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, agregue 200 μL de piruvato de sodio (de un stock 100x), 200 μL de glutamina (de un stock de 200 nM) y 100 μL de penicilina/estreptomicina (de un stock 200x).
- Sustituya el HBSS de los pocillos por 1,0 ml de medio de siembra y coloque la placa en la incubadora a 37 °C.
- Con un quemador Bunsen, pula al fuego tres pipetas Pasteur en diámetros decrecientes. Sosteniendo la pipeta con una mano, inserte la punta en la llama y retírela rápidamente. Repita el proceso hasta que la punta se alise y el diámetro se reduzca al diámetro deseado (evaluado a ojo).
3. Preparación de reactivos para la disociación del tejido neural, siguiendo las instrucciones del kit de disociación neural
- Después de calentar el tampón de digestión 1 a temperatura ambiente, prepare la mezcla de enzimas 1 mezclando 50 μl de la enzima 1 con 1,91 ml de tampón 1 y la mezcla de enzimas 2 mezclando 15 μl de la enzima 2 con 30 μl de tampón de digestión 2. Las mezclas son suficientes para ser utilizadas en el tejido cerebral de todos los embriones.
- Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% en HBSS, por ejemplo, 0,25 g en 50,0 mL de HBSS.
4. Extracción embrionaria
- Esteriliza en autoclave dos pinzas finas rectas, una pinza de punta curva y un par de tijeras quirúrgicas finas y esterilízalas con etanol al 70% antes de usarlas. Luego, llene las placas de Petri con HBSS.
- Sacrificar a una madre embarazada E14-E16 en la cámara de CO2 y realizar la luxación cervical.
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse bajo la campana en condiciones estériles: - Esterilizar el abdomen con etanol al 70%. Abra la cavidad abdominal desde la sínfisis púbica hasta la apófisis xifoides de la caja torácica con tijeras quirúrgicas y fórceps.
- Extraiga el cuerno uterino y colóquelo en un plato de 100 mm lleno de HBSS helado y lávelo bien.
- Extraer y separar todos los embriones del útero con pinzas finas. Decapitar rápidamente los embriones con tijeras quirúrgicas finas y/o fórceps. Coloque las cabezas en la placa de Petri de 60 mm llena de HBSS.
5. Extracción, recolección y disociación tisular del hipotálamo
- Coloque una pinza fina en la cavidad ocular para sujetar el cerebro. Con las otras pinzas finas, retire la piel y el cráneo pelando hasta que el cerebro sea visible. Distinguir el cerebro de otros tejidos en función de su apariencia blanca. La piel y el cráneo son rosados y ricos en vasculatura.
- Retire el cerebro del cráneo usando las pinzas de punta curva y saque el cerebro de los bulbos olfatorios, volteándolo.
- Ahora bien, la corteza es ventral y el hipotálamo es visible dorsalmente en la superficie superior (Figura 1B). Con las pinzas curvas, retire la capa de meninges y vasos sanguíneos hasta que el cerebro se vea blanco y claro.
- Con las pinzas curvas, separe el área hipotalámica del resto del cerebro.
- Corta el hipotálamo en 3-4 trozos pequeños y con una pipeta, transfiere los trozos a un tubo de 15 ml.
- Repita los pasos para los otros embriones mientras la trompa está en hielo.
- Llene el tubo con 6.0 ml de HBSS y deje que el tejido se asiente, retire el sobrenadante y agregue la mezcla de enzimas 1. Mezcle y agite suavemente el tubo para evitar que se acumule el tejido.
- Incubar el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 15 min y agitar el tejido cada 5 min para resuspender el tejido.
- Después de 15 minutos, agregue 30 μL de mezcla de enzimas 2. Disociar el tejido cerebral utilizando la pipeta Pasteur de mayor diámetro (<1 mm). Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces sin formar burbujas.
- Incubar durante 10 min a 37 °C en el baño maría. Agite suavemente el tubo para volver a suspender el tejido cada 5 minutos.
- Después de 10 minutos, agregue los 15 μL restantes de la mezcla enzimática 2. Disociar el tejido 10x con las otras dos pipetas pulidas al fuego de diámetro decreciente, hacia arriba y hacia abajo sin formar burbujas.
- Al tubo con el tejido disociado, añadir inmediatamente 10,0 ml de HBSS-0,5% BSA y centrifugar a 300 × g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 1,0 ml de HBS-0,5% BSA.
6. Recuento de células
- Diluir la suspensión celular 1:5 usando HBSS-0.5% BSA.
- Coloque 10 μL de la suspensión celular diluida en una cámara de recuento de Neubauer.
- Bajo un microscopio de campo claro, cuente solo las células que están en los cuadrados de las esquinas de las cuatro cámaras. Calcula el promedio y multiplícalo por 5 × 104.
NOTA: Asegúrese de que haya >106 celdas para proceder al aislamiento celular; El número óptimo de celdas es 107.
7. Selección negativa
NOTA: La selección negativa permite a los usuarios obtener un cultivo de neuronas primarias puras mediante la separación de células neuronales y no neuronales. Utilice soluciones preenfriadas.
- Centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 3 min (la centrifugación se puede extender hasta 10 min). Aspirar suavemente el sobrenadante y volver a suspender el gránulo a una concentración de 107 células en 80 μL de BSA HBSS-0,5%.
- Añadir 20 μL de cóctel de biotina-anticuerpo de células no neuronales e incubar durante 5 min a 4 °C.
- Lavar las células para eliminar el anticuerpo libre con 2,0 ml de BSA de HBSS-0,5% y centrifugar a 300 × g durante 3 min.
- Aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el gránulo en 80 μL de BSA HBSS-0,5%. Añadir 20 μL de microperlas antibiotina, mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 °C.
- Agregue 0.5 mL de HBSS-0.5% BSA para un máximo de 107 celdas y espere hasta que la columna magnética esté lista.
8. Separación magnética, selección negativa
NOTA: La separación magnética es un paso crucial que permite la separación de las células no neuronales de las células neuronales. La muestra que contiene células neuronales y no neuronales pasa a través del campo magnético y las células no neuronales, que están unidas a un complejo biotina-anticuerpo-perla magnética, quedan atrapadas en la columna (Figura 1C). Las células neuronales libres se eluyen a través de la columna y se recogen en un tubo de 15 ml.
- Prepare el soporte (incluido en el kit) con el separador y la columna MS como se muestra en la Figura 1C.
- Abra la columna y configure el soporte solo cuando las celdas estén listas para separarse.
- Enjuague la columna con 0,5 ml de HBSS-0,5% BSA. Espere hasta que la solución deje de gotear.
- Para recolectar células neuronales, coloque un tubo de 15 ml debajo de la columna y pase 0,5 ml de la suspensión celular a través de la columna. Recoja el eluido en el tubo hasta que deje de gotear. Para capturar las células neuronales residuales, lavar la columna 3 x 0,5 ml de HBSS-0,5% BSA.
- Para recolectar células no neuronales, retire la columna del imán y colóquela dentro de un nuevo tubo de 15 ml. Agregue 1.0 mL de HBSS--0.5% BSA a la columna y use el émbolo para recolectar las células no neuronales marcadas magnéticamente.
- Centrifugar las células neuronales y no neuronales a 300 × g durante 3 min. Aspire suavemente el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1,0 ml de BSA HBSS-0,5%. Cuente las celdas como se describió anteriormente en la sección 6.
- Si es necesario, coloque las células no neuronales en una placa de 24 pocillos; de lo contrario, deséchelos.
9. Selección positiva
NOTA: Una vez que se obtiene una suspensión celular neuronal pura, se lleva a cabo una selección positiva para aislar las células diana. Las células se pueden aislar mediante el uso de un anticuerpo conjugado con biotina específico para un antígeno de superficie. El anticuerpo es reconocido por perlas magnéticas anti-biotina. Al hacer fluir la suspensión celular a través de la columna, solo las células de interés quedan atrapadas en el campo magnético.
- Centrifugar la suspensión de células neuronales puras a 300 × g durante 3 min. Aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el gránulo en 80 μL de BSA HBSS-0,5%. Añadir el anticuerpo específico siguiendo las instrucciones del fabricante e incubar a 4 °C durante 10 min.
NOTA: Si se buscan células que expresen la LepR, sugerimos un anticuerpo biotinilado de leptina R de ratón (ver Tabla de materiales) a una concentración de 0,50 μg/106 células. - Lavar el exceso de anticuerpos con 2,0 ml de HBSS-0,5% BSA y centrifugar a 300 × g durante 3 min.
- Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 80 μL de HBSS-0.5% BSA y agregue 20 μL de microesferas antibiotina. Incubar a 4 °C durante 10 min.
- Por cada 107 células, agregue 0,5 ml de HBSS-0,5% BSA y espere hasta que la columna magnética esté lista.
10. Separación magnética, selección positiva
- Prepare el soporte con el separador y la columna MS. Enjuague la columna de MS con 0,5 ml de HBSS-0,5% BSA. Espere hasta que deje de gotear.
- Coloque un tubo de 15 ml debajo de la columna, pase 0,5 ml de la suspensión celular a través de la columna y recoja el eluido que comprende las células neuronales inespecíficas. Para limpiar la columna de células neuronales residuales no específicas, lavar con 3 x 0,5 ml de HBSS-0,5% BSA.
- Retire la columna del imán, colóquela en un nuevo tubo de 15 ml y agregue 1,0 ml de HBSS-0,5 % BSA. Utilice el émbolo para eliminar las células objetivo.
- Centrifugar ambos tubos a 300 × g durante 3 min. Retire suavemente el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en 0,5 ml de medio de siembra.
- Cuente las celdas como se describió anteriormente en la sección 6.
- Placar tanto las células objetivo como control positivo como células inespecíficas como control negativo a una densidad de 120.000-200.000 células/mm3 en la placa de 24 pocillos previamente preparada como se describe en la sección 2 e incubar a 37 °C con 5% de CO2, 9% de O2 y 95% de humedad durante12 h.
11. Mantenimiento de cultivos celulares
- Prepare 20 ml de medio de cultivo con 19,2 ml de medio de cultivo neuronal, 400 μl de suplemento de B27 (de un stock de 50x), 200 μl de glutamina (de un stock de 200 μM) y 100 μl de penicilina/estreptomicina (de un stock de 200x).
- Reemplace el medio de recubrimiento de la placa de 24 pocillos que contiene células neuronales o no neuronales.
- Lavar con 2 x 1,0 ml de HBSS.
- Añadir 1,0 ml de medio de cultivo.
- Actualice el medio cada 2/3 días reemplazando 0,5 ml de medios antiguos por 0,5 ml de medios nuevos.
NOTA: Las células pueden mantenerse en cultivo y utilizarse hasta 21 días in vitro (DIV21).
12. Tinción de inmunofluorescencia neuronal
- Doce horas antes de la tinción, preparar una solución compuesta por metanol 50/50 y acetona y enfriarla a -20 °C durante la noche.
- Lave las neuronas en la placa de 24 pocillos con 2 x 1.0 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min.
- Reemplace la solución de PBS con 1.0 ml de la solución 50/50 e incube en hielo durante 20 minutos.
- Lavar con 1x PBS durante 3 x 5 min.
- Bloquee las neuronas con BSA al 3% en 1x PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Prepare la solución de anticuerpos primarios en BSA al 3% en 1x PBS, utilizando la concentración de anticuerpos mencionada en las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos y las concentraciones utilizadas se enumeran en la Tabla de Materiales.
- Sustituir la solución de bloqueo por la solución de anticuerpos primarios e incubar a 4 °C durante la noche.
- Lave las celdas durante 3 x 10 min con 1x PBS.
- Preparar la solución de anticuerpos secundarios con BSA al 3% en 1x PBS, utilizando las concentraciones de los anticuerpos siguiendo las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos secundarios utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
- Incubar las células con la solución de anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave las celdas durante 3 x 10 min con 1x PBS.
- Deje las neuronas en 1x PBS durante el procedimiento de montaje. Coloque una pequeña gota de medio de montaje (con o sin 4',6-diamidino-2-fenilindol para la identificación nuclear) en el portaobjetos del microscopio. Extraiga un cubreobjetos de vidrio que contenga neuronas con fórceps y golpee el costado del cubreobjetos en un pañuelo de papel para secar el exceso de PBS. Voltee el cubreobjetos sobre el medio de montaje, asegurándose de que las neuronas estén orientadas hacia los portaobjetos del microscopio; Presione suavemente y retire el exceso de medios de montaje con papel de seda.
- Los portaobjetos del microscopio están listos para ser analizados con un microscopio de campo claro o confocal.
Representative Results
En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de neuronas diana del hipotálamo (Figura 1). El objetivo del método es estudiar características neuronales específicas en un contexto controlado y aislado. Así, se extrajeron embriones de ratón de las madres preñadas en E14-E16. Se extirparon las meninges y se aisló el hipotálamo del resto del cerebro. El tejido se disoció suavemente con dos mezclas de enzimas recién preparadas utilizando el kit de disociación de referencia. En primer lugar, las células no neuronales se separaron de las células neuronales: glía, microglía y neuronas se recogieron en la misma suspensión unicelular. Para ello, las células no neuronales se marcaron mediante un cóctel de anticuerpos que reconocían los epítopos de la superficie no neuronal. Después de la incubación, el complejo anticuerpo-célula se conjugó con microesferas magnéticas y posteriormente se pasó a través de una columna magnética para atrapar las células no neuronales.
Este paso produjo dos suspensiones celulares, una que contenía células no neuronales y la otra que contenía células neuronales. Ambas suspensiones podrían ser plateadas de inmediato. Alternativamente, la suspensión de la célula neuronal podría manipularse aún más para separar una subpoblación neuronal (suspensión dirigida) del resto utilizando la misma estrategia. Según el experimento de interés, las células neuronales pueden ser sembradas de 125.000 a 200.000 células/mm3. Los cultivos menos densos se pueden utilizar para analizar neuronas con resolución de una sola célula: desde el desarrollo axonal, la formación sináptica y la transmisión hasta la electrofisiología. Los cultivos más densos se pueden utilizar para análisis bioquímicos, incluida la extracción de ADN y ARN, Western blot, Southern blot, Northern blot, PCR en tiempo real y secuenciación de ARN.
En este estudio, LepR se dirigió a aislar las neuronas involucradas en el sistema de melanocortina, como las neuronas ARCPOMC y ARCAgRP . Las células se sembraron en densidades que oscilaban entre 120.000 células/mm3, para las neuronas LepR+, y 200.000 células/mm3 para las poblaciones neuronales genéricas. Después de 48 h, las neuronas LepR+ comenzaron a formar neuritas (Figura 2). En DIV4, las extensiones axonales mostraron avances, mientras que los procesos dendríticos comenzaron a aparecer. En DIV6, las neuronas estaban suficientemente desarrolladas y, por lo tanto, estaban listas para ser analizadas. Los experimentos de inmunofluorescencia en neuronas LepR+ mostraron una expresión del 99% de LepR (verde, Figura 3A). No se observaron células gliales ni otras células no neuronales, lo que confirma la pureza del cultivo neuronal primario. La naturaleza neuronal de las células se confirmó mediante la tinción de la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2), con la identificación de axones y protuberancias dendríticas (Figura 3B). En DIV10, el 30% de las células LepR+ expresaron POMC (rojo). Esto es de esperar, ya que la mayoría de las células LepR+ expresan POMC o AgRP. La Figura 3C, D ilustra la colocalización entre las señales POMC y LepR. Obsérvese que la colocalización fue prominente en y alrededor del núcleo, como se esperaba.
Para el control se utilizaron cultivos generales que contenían poblaciones neuronales hipotalámicas heterogéneas. La inmunofluorescencia demostró conectividad y funcionalidad sináptica, según lo evaluado por la co-tinción de sinapsina-1 (verde) y PSD 95 (rojo) (Figura 4A, B). El número de neuronas LepR+ presentes en el cultivo general fue de ~5%, un porcentaje consistente con la noción de que la mayoría de las neuronas que expresan LepR habían sido seleccionadas durante el proceso de separación magnética (las células representativas de LepR+ se ilustran en la Figura 4C, D). Todos los datos generados o analizados durante este estudio están disponibles en https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c.
Figura 1: Diagrama de flujo experimental y configuración . (A) Representación gráfica del procedimiento experimental. Go-no-go: ≥106 celdas son necesarias para proceder al aislamiento celular; El número óptimo de celdas es 107. (B) Imagen representativa de un cerebro embrionario E16. El hipotálamo y las meninges están indicados. (C) Configuración MACS utilizada para la separación y aislamiento de células objetivo. Se indican el soporte magnético, el separador magnético y la columna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cultivo neuronal entre DIV2 y DIV6. (A) Las células LepR+ obtenidas de la selección positiva muestran una densidad celular y conectividad reducidas, pero un desarrollo normal de neuritas (flechas rojas), axones (flechas azules) y dendritas (flechas verdes). Las células se sembraron a una densidad de 120.000 células/mm3. Barra de escala = 100 μm. (B) Las neuronas hipotalámicas genéricas, colocadas a una densidad de 200.000 células/mm3, muestran características normales de desarrollo y crecimiento y conectividad (flechas negras). Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: DIV = días in vitro; LepR = receptor de leptina. Todos los datos generados o analizados para construir esta figura están disponibles en https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las neuronas in vivo son recapituladas por neuronas LepR+ cultivadas. (A) Imágenes representativas de un cultivo de neuronas que expresan la LepR (verde; DAPI es azul). El noventa y nueve por ciento de las células expresaron la LepR. Las neuronas se sembraron a una densidad de 120.000 células/mm3. En el DIV7, las neuronas presentaron axones alargados, maduración dendrítica y conectividad neuronal (flechas). Barra de escala = 40 μm. (B) Se utilizó inmunofluorescencia con anti-MAP2 para confirmar la naturaleza neuronal de las células. Se muestran morfologías neuronales específicas como axones, dendritas y protuberancias (flechas). Barra de escala = 40 μm. (C) Aumento de las células LepR+. LepR en verde y DAPI en azul. Barra de escala = 10 μm. (D) Tinción conjunta con LepR (verde) y POMC (rojo). Aproximadamente el 30% de las neuronas LepR+ fueron coinmunorreactivas a POMC, que se detectó a nivel del núcleo (flechas rojas). Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; MAP2 = proteína 2 asociada a microtúbulos; POMC = proopiomelanocortina; LepR = receptor de leptina. Todos los datos generados o analizados para construir esta figura están disponibles en https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Las células in vivo son recapituladas por neuronas hipotalámicas genéricas cultivadas. (A) Imágenes representativas de cultivos neuronales hipotalámicos genéricos teñidos con sinapsina 1 (verde), PSD95 (rojo) y DAPI (azul). Las neuronas exhibieron una conectividad y funcionalidad sináptica bien desarrolladas (flechas). Barra de escala = 40 μm. (B) Ampliación del recuadro en (A), que muestra la colocalización de Sinapsina 1 (verde) y PSD95 (rojo, flechas). Barra de escala = 20 μm. (C,D) Imágenes representativas que muestran células LepR+ en un cultivo general. Las células LepR+ (verde) representaron ~5% del total. Las células representativas de LepR+ se indican con flechas. Barra de escala = 40 μm. (E,F) Aumentos de las casillas en (C,D) que muestran los receptores de leptina punta verde localizados en el soma. Barra de escala = 20 μm. Todos los datos generados o analizados para construir esta figura están disponibles en https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Investigar las propiedades bioquímicas y eléctricas de las neuronas hipotalámicas es clave para comprender las bases moleculares del metabolismo, la termorregulación, el manejo del estado de ánimo, el comportamiento alimentario y más. Sin embargo, la heterogeneidad neuronal del hipotálamo hace que este esfuerzo sea un desafío, y se necesitan métodos para aislar y estudiar subpoblaciones hipotalámicas específicas.
Las técnicas in vivo emplean CRE-recombinasa, optogenética, fotometría de fibra e imágenes de calcio. Estos enfoques permiten principalmente el estudio de las propiedades eléctricas de las neuronas hipotalámicas, y actualmente hay muy pocos métodos disponibles para investigar sus atributos no eléctricos. La tecnología MACS desarrollada en este estudio podría proporcionar una técnica susceptible de aislar subpoblaciones neuronales hipotalámicas específicas in vitro, lo que permitiría tratamientos y análisis específicos. Los cultivos neuronales son más sencillos de manejar en comparación con los cocultivos de diferentes poblaciones neuronales. Además, los cultivos puros evitan los efectos de confusión derivados de la presencia de glía y microglía. Por lo tanto, las neuronas de la misma región hipotalámica y tipo podrían estudiarse en respuesta a entradas metabólicas y hormonales específicas.
En este protocolo, seleccionamos neuronas hipotalámicas que expresan la LepR. Se cultivaron células LepR+ aisladas para investigar sus características celulares, morfológicas y moleculares, que son difíciles de estudiar in vivo. La pureza de los cultivos fue del 99%, lo que avanzó la precisión del método. Además, las células LepR+ estaban sanas y viables en DIV7 hasta DIV21.
Esta técnica, sin embargo, tiene algunas limitaciones. Los cultivos de neuronas puras E18 o anteriores son difíciles de mantener. Por lo tanto, la ventana de extracción está limitada a E14-E16. Esto implica que los cambios celulares que ocurren después de E16 se pasan por alto. Por ejemplo, la expresión del receptor de leptina en las neuronas ARC aumenta durante el período postnatal temprano22. El procedimiento para el aislamiento debe realizarse lo más rápido posible para reducir el estrés y la muerte celular y mejorar el rendimiento. El procedimiento puede durar hasta 5 h; Por lo tanto, es esencial mantener las condiciones estériles y reducir la manipulación al mínimo necesario. La selección positiva puede conducir a un bajo rendimiento debido a las bajas cantidades de tejido disponibles, lo que limita el número de experimentos que se pueden realizar con una sola preparación. Se observó una elevada muerte neuronal, probablemente debido a la baja densidad celular y a la reducción de la conectividad neuronal y el soporte intraneuronal.
Además, el anticuerpo dirigido al antígeno de interés debe unirse a la superficie celular para garantizar una correcta separación; Por lo general, los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo son adecuados para la técnica MACS. Si el anticuerpo no se ha utilizado antes en los métodos de separación celular, se necesitan experimentos de validación y titulación para determinar el uso y la concentración ideales. La extracción de las células diana requiere un marcador de superficie celular. En este caso utilizamos un anticuerpo biotinilado, pero en principio también se podían utilizar anticuerpos conjugados con otras moléculas, como FITC (isotiocianato de fluoresceína) y PE (antificoeritrina purificada). La tecnología MACS también podría aplicarse a neuronas que expresan un fluoróforo, como GFP u otra proteína Tag, lo que podría aumentar la especificidad y el rendimiento. Si no se emplea un fluoróforo, la alternativa sería confirmar la expresión de la molécula de interés mediante inmunofluorescencia antes de realizar experimentos con células vivas. Estudios futuros pondrán a prueba la validez de estas alternativas.
Un aspecto importante que este estudio no abordó se refiere a la "fidelidad" de las poblaciones subneuronales. Comprobamos que las neuronas LepR+ cultivadas expresaban POMC, que es una firma de las neuronasnativas de ARC POMC . Sin embargo, se necesitarán más pruebas para concluir que los cultivos neuronales de LepR+ recapitulan sus contrapartes nativas in vivo . En general, el protocolo de aislamiento neuronal MACS presentado aquí puede proporcionar un método válido y eficaz para estudiar los mecanismos hipotalámicos in vitro que, de otro modo, serían difíciles de investigar in vivo.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Las figuras gráficas fueron creadas con BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIA (R01AG060919) y una subvención del NSF (2030348) a FS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo extraction | |||
| 1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
| 1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
| 60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Bench pads | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Cell Culture | |||
| Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
| Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
| Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
| Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
| Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
| Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
| Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
| MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit - Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
| Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
| Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
| Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
| Staining | |||
| Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
| Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
| POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
| PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
| Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
| Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |
References
- Cone, R. D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nature Neuroscience. 8 (5), 571-578 (2005).
- Clarke, I. J. Hypothalamus as an endocrine organ. Comprehensive Physiology. 5 (1), 217-253 (2015).
- Mignot, E., Taheri, S., Nishino, S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. Nature Neuroscience. 5 Suppl, 1071-1075 (2002).
- Baird, A. D., Wilson, S. J., Bladin, P. F., Saling, M. M., Reutens, D. C. Neurological control of human sexual behaviour: insights from lesion studies. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (10), 1042-1049 (2007).
- Caria, A., Dall, O. G. Functional neuroimaging of human hypothalamus in socioemotional behavior: a systematic review. Brain Sciences. 12 (6), 707 (2022).
- Andermann, M. L., Lowell, B. B. Toward a wiring diagram understanding of appetite control. Neuron. 95 (4), 757-778 (2017).
- Romanov, R. A., Alpar, A., Hokfelt, T., Harkany, T. Unified classification of molecular, network, and endocrine features of hypothalamic neurons. Annual Review of Neuroscience. 42, 1-26 (2019).
- Hajdarovic, K. H., Yu, D., Webb, A. E. Understanding the aging hypothalamus, one cell at a time. Trends in Neurosciences. 45 (12), 942-954 (2022).
- Zhang, Y. H., et al. Cascade diversification directs generation of neuronal diversity in the hypothalamus. Cell Stem Cell. 28 (8), 1483-1499 (2021).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-cell RNA-seq reveals hypothalamic cell diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Ma, C., et al. Neural pathways from hypothalamic orexin neurons to the ventrolateral preoptic area mediate sleep impairments induced by conditioned fear. Frontiers in Neuroscience. 17, 1122803 (2023).
- Wang, F., et al. A parabrachial to hypothalamic pathway mediates defensive behavior. Elife. 12, e85450 (2023).
- Cowley, M. A., et al. Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature. 411 (6836), 480-484 (2001).
- Parekh, R. U., et al. Hypothalamic kinin B1 receptor mediates orexin system hyperactivity in neurogenic hypertension. Scientific Reports. 11 (1), 21050 (2021).
- Schmidt, C. X., Tsang, A. H., Oster, H. Generation of mouse primary hypothalamic neuronal cultures for circadian bioluminescence assays. Bio-protocol. 11 (5), e3944 (2021).
- Foo, L. C. Purification of rat and mouse astrocytes by immunopanning. 2013 (5), Cold Spring Harbor Protocols. 421-432 (2013).
- Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. 2013 (9), Cold Spring Harbor Protocols. 854-868 (2013).
- Zhao, H., et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea. International Journal of Molecular Sciences. 12 (3), 1862-1875 (2011).
- Zhang, Z. M., et al. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chinese Medical Journal. 124 (12), 1813-1817 (2011).
- Drake, S. S., Zaman, A., Simas, T., Fournier, A. E. Comparing RNA-sequencing datasets from astrocytes, oligodendrocytes, and microglia in multiple sclerosis identifies novel dysregulated genes relevant to inflammation and myelination. WIREs Mechanisms of Disease. 15 (2), e1594 (2023).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Cottrell, E. C., et al. Developmental changes in hypothalamic leptin receptor: relationship with the postnatal leptin surge and energy balance neuropeptides in the postnatal rat. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296 (3), R631-R639 (2009).
