Summary
ショウジョウバエ は、筋形成を調節する重要な分子を研究するための確立されたモデルです。しかし、現在の方法では、mRNAの転写動態や合胞体内の空間分布を決定するには不十分です。この制限に対処するために、1分子スケールでのmRNAの検出と定量を可能にするRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法を最適化しました。
Abstract
骨格筋は、多くの筋線維が束ねられた大きな合胞体であり、力を生み出し、体の動きを可能にします。 ショウジョウバエ は、筋肉生物学を研究するための古典的なモデルです。ショウ ジョウバエ の遺伝学と高度なオミクスアプローチの両方の組み合わせにより、筋肉の形態形成と再生を調節する重要な保存分子が同定されました。しかし、これらの分子の転写動態や合胞体内のメッセンジャーRNAの空間分布は、従来の方法では評価できません。ここでは、既存の単一分子RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(smFISH)法を最適化して、成体の飛行筋とその筋幹細胞内の個々のmRNA分子の検出と定量を可能にしました。概念実証として、進化的に保存された2つの転写因子であるMef2とZfh1/ZebのmRNA発現と分布を解析しました。この手法により、筋前駆細胞、成体筋、筋幹細胞の両転写産物について、単一のmRNA分子を効率的に検出・定量できることを示しました。
Introduction
成人の骨格筋は、分化した多核筋線維でできており、その収縮特性が動きを生み出します。筋肉の成長、維持、再生は、胚発生中に特定される筋前駆細胞と筋幹細胞(MuSC)に依存しています1。筋原性プログラムは、一連のコア筋原性転写因子(TF)(Pax3/7、MYODおよびMef2、およびZEBなど)によって細かく制御されています2,3,4。筋生物学を調節する分子機構の解明は、筋学に関する根本的な疑問を解明し、筋変性疾患の治療に応用するために重要です。
ショウジョウバエは、筋形成を研究する遺伝子モデルとして長い歴史を持っています5.最近、筋肉の再生を調査するための新しいモデルとして登場しました6,7,8。筋肉構造と中核筋原性プログラムは、ハエと哺乳類の間で高度に保存されています。例えば、TFのMef2とZfh1/ZEBは、筋肉の発達と再生を調節する保存された機能を持っています3,9,10,11。間接飛翔筋(IFM)などのショウジョウバエの成体筋は、成体筋前駆細胞(AMP)として知られる特定のMuSCの集団から形成されます12。これらのAMPは胚発生中に指定され、翼や脚の椎間板などの上皮構造と関連しています。AMPは、胚期および幼虫期を通じて、分化と融合に従事してIFMを形成する変態まで未分化のままです13,14。TFスパルトメジャー(スパルト、サルム)は、飛行筋の発達中に発現し、それらの構造的同一性を決定するために必要です15。Mef2は、成人の筋肉形成に不可欠な別の重要な筋原性TFです16,17。AMPで発現し、成体IFMで維持される10,18。AMPの大部分は機能的な筋肉に分化しますが、サブセットは分化を免れ、成体のMuSCを形成します11。脊椎動物と同様に、TF Zfh1/ZEBは成体のMuSCの早期分化を防ぎ、幹細胞性を維持するために必要である9,10。
遺伝子発現動態は、さまざまな筋肉の生物学的プロセスを調節することが証明されています19,20。ハイスループットの単一細胞および単一核RNAシーケンシング技術の出現により、これらの転写ダイナミクスの包括的な調査が可能になりました21,22。これらのアプローチの注目すべき限界の1つは、多核筋線維中のmRNA分子の空間分布を提供できないことです。これらの特徴は、1.細胞質に広がり、成熟したRNAを表す個々のmRNA分子と2つのタイプのmRNAボディを明らかにする単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)によって調査できます。最大2つの明るい核病巣が新生転写産物に対応し、転写活性対立遺伝子を明らかにする23。したがって、smFISHは、個々のmRNA分子の定量、空間分布の調査、遺伝子転写動態のスナップショットの提供に最適な方法です。
smFISH法は、標的転写産物を相補的に行うように特別に設計された一連の短い蛍光オリゴヌクレオチドプローブに依存しています。アニーリングすると、共焦点顕微鏡24を使用して単一分子レベルでmRNAを検出できる高強度の点光源を生成します。この方法は、哺乳類の筋肉組織を含むさまざまな種類の細胞にますます適用されています19,20。しかし、ショウジョウバエでは、他の動物モデルと同様に、成体の筋肉遺伝子発現に関する知識のほとんどは、mRNA分子の空間的位置に関する定量的な情報が不足しているバルク分子アッセイに由来します。ここでは、筋肉前駆細胞と成虫のショウジョウバエの筋肉に対してsmFISHを実行するための方法を最適化しました23,25。このプロトコルには、核のセグメンテーションとmRNAのカウントとローカリゼーションのための完全に自動化された分析パイプラインが含まれています。
Protocol
1.翼椎間板と成体筋肉の解剖と準備
注:解剖ベンチとすべての解剖装置をRNAse阻害剤溶液でクリーンアップします(材料表)。実験用手袋は、実験手順全体を通して着用する必要があります。
- ウィングディスク
- L3段階の幼虫を冷たい1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます(図1A)。
- 幼虫を1x PBSで3回すすぎ、この溶液に5分間入れます。
- 2対の鋭い鉗子を使用して、幼虫を前部から保持し、残りの体組織(約2/3)を引っ張って廃棄します。
- 幼虫の最初の1/3を1対の鉗子で保持し、もう1対の鉗子で口フックを保持します。幼虫の内側の口のフックを完全に反転するまで引っ込めます。
注:分析に十分なサンプルサイズを確保するために、実験ごとに約30匹の幼虫を解剖します。 - 翼の円盤は、幼虫の両側に沿って走る気管の2つの主要な枝と密接に関連していることを観察します。
- 他のすべての幼虫成分(脚椎間板と脳)を取り除き、気管に一対の翼椎間板が取り付けられたきれいな倒立幼虫の死骸を得ます(図1B)。
- サンプルを 1 mL 遠心チューブに入れ、1x PBS で希釈した 4% パラホルムアルデヒド(PFA)に浸し、室温で 45 分間撹拌しながら固定します。
注:サンプルの攪拌は、振動攪拌機(材料表)によって行われます。 - サンプルを70%エタノール(EtOH、RNAseフリー水で希釈)で3 x 5分間洗浄し、同じ洗浄液中で4°Cで少なくとも2日間、最大1週間保存します。
- 間接飛行筋
- 成虫のハエをCO2 フライパッドで麻酔し、頭、腹部、脚、翼を取り除きます。
- 解剖した胸部を冷たい1x PBSに入れ、すべてのサンプルが解剖されるまでこれを続けます(図1D)。
- 胸部を4%PFA(1%トリトン)で室温で20分間攪拌下でプレフィクスします。
- サンプルを1x PBT洗浄液(1x PBS中の1%Triton)で3 x 5分間すすぎます。
- スライドガラスの両面テープ(材料表)に胸部を配置し、鋭利なミクロトームブレードで二等分して2つの半胸部を作製します(図1E、F)。
- 撹拌しながら、サンプルを4%PFA(1%トリトン)で室温で45分間固定します。
- 撹拌下で室温で1x PBT洗浄液(1% Triton、1x PBS)で2 x 20分間洗浄します。
- 半胸部を冷たい1x PBSに入れ、鉗子を使用してIFMを半胸部から静かに分離します(図1G)。
注意: これを実現するには、キューティクルをできるだけ完全に取り除くことが重要です。 - サンプルを透過処理するには、単離したIFMを70%EtOH溶液中で4°Cで少なくとも2日間、最大1週間保存します。
注:実験ごとに約10の胸部からIFMを分離し、分析に適切なサンプルサイズを確保します。
2. ハイブリダイゼーション、免疫染色、およびマウント
注:同様のハイブリダイゼーション手順は、ウィングディスクとIFMサンプルの両方に適用されます。ハイブリダイゼーションを開始する前に、幼虫の死骸から翼板を分離し、200 μLのバッファーAに入れることが重要です。
- プローブを 400 μL の TE バッファー(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)に再懸濁し、最終ストック溶液を 12.5 μM にします。
- サンプルをバッファーA(材料表)を含む0.5 mL遠心チューブに移します。
注:容器の容積を減らすことで、サンプルを視覚化しやすくなり、洗浄プロセス中にサンプルが失われるのを防ぎます。 - サンプルをバッファーAで2 x 20分間洗浄します。
- バッファーAを吸引し、400 μLのハイブリダイゼーションバッファーと交換し(材料表)、サーマルミキサーで37°Cで30分間サンプルをプレハイブリダイズします(材料表)。
- プローブをハイブリダイゼーションバッファーで最終濃度125 nM(翼椎間板用)、成体用筋肉(成体用筋肉)200 nMに希釈し、一次抗体を添加します。
注:抗体の希釈率は、使用する特定の抗体によって異なります(材料表)。抗体の追加は任意です。ユーザーは、タンパク質の染色を中止し、代わりに抗体の添加を含まない同様のsmFISHプロトコルを使用することを選択できます。 - ハイブリダイゼーションバッファーを吸引し、プローブおよび抗体を含む100μLのハイブリダイゼーションバッファーと交換する。
- サンプルを37°Cの暗所で、サーマルミキサーで300rpmの撹拌下で少なくとも16時間インキュベートします。
- バッファー A のアリコートを 37 °C でウォームアップします。
- 300rpmの撹拌下で37°Cのサーマルミキサーでサンプルを3 x 10分間洗浄します。
- 最後の洗浄では、二次抗体(1/200)とDAPI(1/10,000)をバッファーAで希釈し、この溶液中でサンプルを37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
- サンプルをバッファーB(材料表)で3 x 20分間洗浄します。
- サンプルを顕微鏡スライドに慎重に移し、残留バッファーBを拭き取り、30 μLの封入剤を加え、18 x 18 mmのカバーガラスで覆います。マニキュアを使用して準備を密封します。
- サンプルを4°Cで最大1週間保存します。
注意: ただし、プローブ信号の劣化を避けるために、できるだけ早くイメージングを実行することをお勧めします。
3. イメージング
- 40倍および63倍の油浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、xyz取得モードで画像を取得します(材料表)。smFISH信号は、光子計数モードを介してHyD検出器によって検出されます。
- DAPI信号とUVランプを使用してサンプルを見つけます。
- 翼椎間板に関連する筋前駆細胞とIFM(図2 および 図3)を画像化するには、レーザーラインと発光フィルターに次の設定を適用します。 DAPI (励起(例) 405 nm、発光(em))を選択します。 450 nm)、 Alexa Fluor 488 (例: 496 nm, em. 519 nm)、smFISHプローブ用の Quasar 670 (例: 647 nm、em. 670 nm)です。
- 成体MuSCを画像化するには(図2D)、レーザーラインと発光フィルターに以下の設定を適用します。 DAPI (例: 405 nm、em. 450 nm)、 Alexa Fluor 488 (例: 496 nm, em. 519 nm)、 Alexa Fluor 555 (ex. 555 nm, em. 565 nm)、smFISHプローブ用の Quasar 670 (例: 647 nm、em. 670 nm)です。
注:イメージングでは、二次抗体やプローブに関連する色素に応じて波長を調整することができます。 - 共焦点画像を として保存します。TIFFファイル。
4. 画像解析後
- 開始するには、ImageJ を起動し、[ プラグイン ] メニューに移動します。そこから、[ マクロ] |[編集 ] をクリックして、マクロのソース コードを開きます。
注:これにより、必要に応じてパラメータを調整し、必要に応じて、マクロのソースコード内の各チャネルのフォルダディレクトリを変更できます。 - このプロトコルに従い、幼虫の Mef2 smFISHスポットを定量するには、 Log_radius = 3.0およびLog_quality = 20.0の設定を使用します。Segement Mef2陽性核で、 blur = 2、nucleus_scale_parameter = 30、nucleus_threshold = -8.0、nucleus_size = 300。
- 筋線維では、次のパラメータを使用します: Log_radius = 2.5;Log_quality = 60.0;ぼかし = 2;nucleus_scale_parameter = 100;nucleus_threshold = 0.0;nucleus_size = 300 です。
- マクロを開始するには、runコマンドを実行し、マクロが指定されたフォルダーからすべての画像を自動的にロードし、順番に定量化するのを待ちます。
注:このプロセスの所要時間は、分析するデータの量に応じて、数秒から数時間までさまざまであることに注意してください。 - file_FISH_results と file_nuclei_results という 2 つの新しい.csvファイルに表示される結果を探します。1つ目は、転写スポットの数と、それらの平均強度と最大強度を示しています。2つ目は、核の総数と各核内のスポットの数の両方を示します。
Representative Results
このプロトコルでは、 Mef2 および zfh1 mRNAを標的とする市販のプローブを使用しました。プローブは、メーカーのFISHプローブデザイナー(材料表)で設計しました。 Mef2 セットは、すべての Mef2 RNA アイソフォーム(エクソン 3 からエクソン 10 まで)に共通するエクソンを標的としています。 zfh1 セットは、 zfh1-RB および zfh1-RE アイソフォーム10の両方に共通する第3のエクソンを標的としています。どちらのプローブもQuasar 670蛍光色素に結合しています。
ImageJソフトウェアと互換性のあるマクロを社内で生成し、生.tifデータを自動的に分析しました。このマクロは、フィジープラグインBIOPを使用したCellpose26 による核の3Dセグメンテーションと、Trackmateプラグイン27で実装されているガウスのラプラシアンによる転写スポット定量を可能にします。後処理には MorpholibJ プラグイン28 を使用します (補足ファイル 1)。
最初のステップとして、Mef2とzfh1がAMPで発現していることが知られている翼の仮想円盤でsmFISHを実施しました。これらのデータは、Mef2抗体またはZfh1抗体のいずれかで共染色されたAMP集団において、両方の転写産物が均一に検出されることを示しています(図2A、B)。活性転写部位(TS)は、個々の細胞質転写産物や成熟核転写産物よりも大きく、より強いシグナルを持つ傾向があるため、smFISHによって成熟mRNAを明らかにし、区別することができます。AMPの倍率が高いほど、TS病巣と細胞質に散在する成熟mRNAが区別され(図2A'、B')、このsmFISHプロトコルの感度が検証されます。ただし、zfh1とMef2の両方で、原子核ごとに1つの活性TSが観察されたことに言及する必要があります(図2A'、B')。これらのデータは、AMPのMef2およびzfh1転写パターンがそれぞれのタンパク質の検出と共局在するため、プローブ設計の精度をさらに検証します(図2)。
第2ステップでは、分化した成体IFMおよび関連幹細胞におけるMef2およびzfh1 mRNAの転写部位および分布を調べました(図2C、D)。これらのデータは、合胞体筋核におけるMef2 TSと細胞質全体にわたるMef2 mRNAの分布を明確に示しています(図2C、C')。Zfh1は、MuSCの個体群を特異的に10,11マークします。このsmFISHプロトコルを用いて、GFP発現>Zfh1-Gal4でマークされたMuSCにおけるzfh1転写を検出することに成功しました。倍率が高いほど、zfh1 TSと細胞質単一mRNAの両方が検出されます(図2D')。
最後に、自社開発のImageJマクロを用いて、Mef2の転写動態と空間分布を定量的に解析しました。計算パイプラインは、Mef2スポットと筋肉核を効率的に検出してセグメント化することができます(図3A-C)。ただし、S/N比の問題により、場合によってはスポットが検出されないことがあります(図3A'、B')。この自動化された方法を使用して、Mef2 mRNAの存在量が筋肉前駆細胞(AMP)と分化した成体IFMの間で異なるかどうかを調べました。我々の解析では、成体のIFMとAMPの核あたりのMef2 mRNAの数に有意差がないことが示されています(図3D)。
成体IFM筋におけるMef2転写産物の空間分布に関する洞察を得るために、細胞質と核のMef2 mRNAスポットの割合を定量化しました(図3E、F)。私たちのプログラムを使用して、Mef2 mRNAスポットの総数と、核染色(Mef2)と重複するMef2 mRNAスポットの数の両方をカウントしました。全mRNA数から核関連mRNAを差し引くと、細胞質mRNAスポットの数が得られます。図3E、Fに示すように、Mef2 mRNAの約92%が細胞質に存在し、残りの8%が筋肉核と関連していることが明らかになりました。
図1:smFISH用の翼板とIFMサンプルを解剖して調製する手順。 (A)L3段階幼虫。(B)幼虫の前端を解剖し、反転させたもの。矢印は翼の円盤を示す。(C)孤立した翼椎間板。 (D)解剖された成体の胸郭。(E)二分(点線)の前に両面テープに配向した成人の胸郭。(F)成人の半胸。(g) 絶縁型 IFM。(H) smFISHプロトコルのワークフロー。 略語:IFMs =間接飛行筋;smFISH = 単一分子 RNA 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション;EtOH =エタノール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:翼椎間板と成体IFMにおける Mef2 および zfh1 smFISHの代表的な画像。 (A,B) Mef2 および zfh1 mRNA(紫色)はAMPで均一に検出され、それぞれ(A,A')Mef2および(B,B')Zfh1タンパク質(緑色)と共局在しています。(A'',B'')AMPの高倍率化。(C)Mef2 mRNAとMef2タンパク質は、成体IFMで検出されます。(C') Cのボックス領域の高倍率。(D)Zfh1-Gal4>UAS-mCD8GFP 発現(緑)は成体MuSCを標識する。 zfh1 RNAは成体のMuSCで検出されます。(D') Dのボックス領域の高倍率。 Zfh1 転写開始部位と単一mRNAは、それぞれ矢印と矢印で示されています。DAPI染色(青)。スケールバー = 50 μm (A,B,A',B')、10 μm (A",B",C,D)、5 μm (C',D')。略語:IFMs =間接飛行筋;smFISH = 単一分子 RNA 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション;AMPs = 成体の筋肉前駆細胞;MuSCs = 筋幹細胞;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;GFP = 緑色蛍光タンパク質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:smFISHによる Mef2 転写と細胞質mRNA蓄積の定量化。 (A)野生型成体IFMにおける Mef2 転写産物(紫色)とMef2タンパク質(緑色)の分布。(A') Aのボックス領域の高倍率。転写開始部位と単一mRNAは、それぞれ矢印と矢印で示されています。(B、C) Mef2 スポットの自動検出と核セグメンテーション。細胞質および核の Mef2 mRNAは、それぞれ緑色とマゼンタ色で示されています。(B',C') B と Cのボックス領域の高倍率。アスタリスクは、マクロでカウントされないスポットを示します。(D)AMPおよび成体IFMにおける Mef2 スポット定量の例(核の総数に対する)。(p = 0,0785、スチューデントの t検定、翼板(n = 4)、IFM(n = 11))。(E)成体IFMにおける Mef2 スポット分布の定量化例。(*** p< 0.0007、スチューデントの t検定、n = 5)。(F)核の内側と外側で検出された Mef2 mRNAスポットの割合(n = 5)。スケールバー = 10 μm (A,A')。略語:IFMs =間接飛行筋;smFISH = 単一分子 RNA 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション;AMPs = 成体筋前駆細胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: 後処理に使用されるマクロ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
smFISH法の応用は近年人気を博しており、その使用はさまざまな細胞タイプやモデル生物に広がっています。しかし、 ショウジョウバエの場合、成体の筋肉遺伝子発現に関する知識の大部分はバルク分子アッセイに由来しており、mRNA分子の正確な空間的位置に関する定量的な情報を提供することができません。このギャップに対処するために、筋肉前駆細胞と成体の ショウジョウバエ の筋肉でsmFISHを実行する方法を最適化しました。このアプローチは、以前に公開されたプロトコル23 から採用され、ショウ ジョウバエ の筋肉組織に最適化されています。
高品質のsmFISH画像を得る上での主な障害は、プローブの最適な浸透を妨げる成人の筋肉の厚さです。したがって、成体の筋肉を動物の他の組織から分離し、穏やかな攪拌で交配プロセスを実行することが重要です。この特定のステップにより、組織の効果的な透過化が保証されます。
もう1つの重要な側面は、S/N比が計算パイプラインの特定のmRNAスポットの検出に失敗する可能性があることです。S/N比を上げるには、プローブの最適な濃度を見つけることで達成できることがわかりました。最適な希釈は、標識色素およびオリゴヌクレオチド組成を含む各プローブセットの組成によって異なり得る。さまざまな希釈を試すことをお勧めします。最終希釈率を 200 nM にすると、これらの実験では成体組織に対して最高の S/N 比が得られました。
smFISH法では、TS焦点で新たに合成されたRNAの数を定量することができます。遺伝子が活発に転写されると、TSで複数の新生RNAが同時に産生されます。その結果、TSの強度は成熟細胞質RNAの強度を上回り、この特徴は、その核局在と相まって、TSを個々の細胞質RNAと区別することができます。筋肉生物学の文脈では、TSの検出と定量化は、同じ合胞体内の筋肉核間の特定の遺伝子の転写の同期を決定するために特に重要です。ただし、この計算パイプラインは、細胞質のmRNAとTSシグナルを区別するようには設計されていません。別の方法として、このsmFISHメソッドを、BayFISHやFISH-quant29,30などの他の定評あるsmFISH分析ツールと組み合わせることをお勧めします。これらのツールは、RNA凝集体の自動セグメンテーションと蛍光強度計算を驚くべき精度で容易に行うことが証明されています。
最後に、smFISHはmRNA分子を高い空間分解能で検出しますが、同時に解析できるmRNAの数は少数に制限されています。merFISH(multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)のようなマルチスケール法により、多数の異なるmRNAの同時分析が可能になる31。この方法では、オリゴヌクレオチドプローブとエラー訂正コードを組み合わせることで、単一細胞内の数百のRNA種の検出を容易にします。
Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
アラン・ヴァンサンが原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。Zfh1抗体を提供してくださったRuth Lehmann氏に感謝します。ステファニー・ドゥテルトル氏とザビエル・ピンソン氏の協力により、MRic Imaging Platformでの共焦点顕微鏡検査に感謝しています。ELは、ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifiqueのPhDフェローシップによってサポートされています。NAは、AFM-Telethon Ph.D.フェローシップ23846によってサポートされています。TPは、T.P.(2019-198009)へのChan Zuckerberg Initiative DAF助成金によって資金提供されています。HBは、CNRS、Atip Avenirプログラム、およびAFM-Telethonトランポリン助成金23108によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
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