两性多发性硬化症建模：MOG35-55 诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎
Summary
实验性自身免疫性脑脊髓炎是多发性硬化症使用最广泛的小鼠模型之一。在目前的方案中，两性的C57BL / 6J小鼠都用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽免疫，主要导致尾巴和四肢的上行麻痹。在这里，我们讨论EAE诱导和评估的协议。
Abstract
多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。它的特点是两性患病率不同，影响的女性多于男性，结果也不同，男性比女性更具侵略性。此外，多发性硬化症在临床方面、影像学和病理学特征方面具有高度异质性。因此，有必要利用实验动物模型，以尽可能多地研究病理学的各个方面。实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 是小鼠中最常用的 MS 模型之一，模拟了不同的疾病特征，从免疫系统的激活到中枢神经系统损伤。在这里，我们描述了使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫在雄性和雌性C57BL / 6J小鼠中诱导EAE的方案，这导致慢性疾病的发展。我们还报告了免疫接种后28天（28 dpi）对这些小鼠的每日临床评分和运动表现的评估。最后，我们说明了中枢神经系统水平的一些基本组织学分析，重点关注脊髓作为疾病诱导损伤的主要部位。
Introduction
多发性硬化症（MS）是一种影响中枢神经系统（CNS）的慢性自身免疫性炎症性疾病。它显示存在炎症细胞的血管周围浸润、脱髓鞘、轴突缺失和胶质增生1。其病因尚不清楚，其临床方面、影像学和病理学特征表明该疾病具有显著的异质性2。
由于其病因和复杂性未知，目前尚无动物模型概括人类多发性硬化症中显示的所有临床和放射学特征 3,4。然而，采用各种动物模型来研究 MS 3,4 的不同方面。在这些模型中，疾病的发生通常是非常人为的，并且人类和小鼠之间临床症状发作的时间范围不同。例如，在人类中，在临床表现出现之前，疾病的病理生理过程多年未被发现。相反，实验者可以在 MS 诱导后的数周甚至数天内检测到动物模型的症状 4.
三种基本动物模型产生多发性硬化症特征的脱髓鞘特征：病毒诱导的特征（例如，泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒）、毒性物质诱导的特征（例如铜酮、溶血卵磷脂）以及实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 的不同变体5。每个模型都有助于研究疾病的某些特定方面，但没有一个模型可以复制MS6的所有特征。因此，考虑到具体的实验需求和要解决的科学问题，选择正确的模型至关重要。
由于针对髓鞘衍生抗原的免疫程序，EAE是通过触发易感小鼠对中枢神经系统成分的自身免疫反应来诱导的。广泛的免疫病理学和神经病理学机制之间的相互作用导致免疫小鼠中 MS 的主要病理特征（即炎症、脱髓鞘、轴突丢失和神经胶质增生）的发展 7,8。小鼠在免疫接种后第二周左右开始出现临床症状，通常表现出从尾巴到肢体和前肢的上行麻痹。临床评分（即疾病相关缺陷积累的量化）通常使用 5 分制7 进行评估。
蛋白质或肽的主动免疫或脑致癌 T 细胞的被动转移可用于在具有不同遗传背景的小鼠（例如 SJL/J、C57BL/6 和非肥胖糖尿病 （NOD） 小鼠）中诱导 EAE。髓鞘蛋白脂质蛋白 （PLP）、髓鞘碱性蛋白 （MBP） 和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 （MOG） 是通常产生免疫原的自身中枢神经系统蛋白的例子。特别是，用免疫显性 PLP 表位 （PLP139−151） 免疫的 SJL/J 小鼠发展为复发缓解 （RR） 病程，而用免疫显性 MOG35-55 肽免疫的 C57BL/6J 小鼠表现出慢性性质的 EAE 1。尽管存在一些局限性，例如提供有关 MS 进展、B 细胞在疾病中的作用、由内而外的机制或研究髓鞘再生的困难的信息很少，但 EAE 模型为理解自身免疫和神经炎症过程做出了巨大贡献，增加了 MS 领域的知识，从而允许开发针对这种疾病的新治疗方法4，6.
在本研究中，我们专注于一种特殊形式的活性 EAE，即髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55 （MOG35-55） 诱导的形式9、10、11、12。MOG35-55 诱导的 EAE 模拟了一种慢性 MS 形式。免疫后，小鼠在免疫后第一周内经历无症状阶段，然后疾病通常在免疫后的第二周出现，而在免疫后的第三周和第四周之间，疾病变成慢性的，不可能从累积的缺陷中完全恢复7,8,13.有趣的是，在文献中的大多数研究中，男性和女性在发病率、发病、病程或进展方面没有观察到差异14，即使比较男性和女性疾病的研究较少。
相比之下，在人类中，已知这些参数具有强烈的性别二态性 2。多发性硬化症影响女性多于男性;然而，男性通常会患上更具侵袭性的疾病2。这一证据表明，性腺激素起着重要而复杂的作用15;然而，性激素在病理学中的作用和作用机制仍不清楚。此外，来自动物模型的数据支持雌激素和雄激素都以性别特异性的方式对病理学的不同区域产生积极影响的观点16,17。
一些研究还表明黄体酮具有神经保护、早髓鞘和抗炎作用18 ，尽管 MS 患者的证据很少18，但神经活性类固醇（即神经系统 从头 合成的类固醇，如孕烯醇酮、四氢孕酮和二氢孕酮）也可能影响病理过程19.总的来说，这些数据支持这样一种观点，即外周和中枢神经系统内部产生的性激素在疾病发生和进展中具有重要的性别特异性作用。因此，在本工作中，我们敦促收集雄性和雌性动物的单独数据。
从组织病理学的角度来看，脊髓白质是该模型中 CNS 损伤的主要部位，其特征是单核炎症浸润和脱髓鞘的多灶性汇合区域8。因此，在描述该方案在C57BL / 6J小鼠中诱导MOG35-55诱导的EAE时，我们将考虑两性的疾病结果，并提供一些关于脊髓的组织病理学见解。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述的 MOG35-55 诱导的 EAE 方案导致 C57BL/6J 小鼠慢性 MS的发展 7,8,13。在这些具有代表性的结果中，我们报告说，接受免疫程序的男女动物都患上了慢性形式的疾病（即，它们在疾病发作后没有完全恢复，它们积累了缺陷，并且在慢性期保持CS至少为1.5）。
即使许多研究报告该模型1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 Ministero dell’Istruzione、dell’Università e della Ricerca – MIUR 项目 Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 和 2023-2027 到神经科学系 Rita Levi Montalcini 的支持;Cavalieri-Ottolenghi 基金会，意大利奥尔巴萨诺。BB 是皮埃蒙特地区 INFRA-P （n.378-35） （2022-2023） 和 PRIN 2020 – 20203AMKTW 的研究员。我们感谢 Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus （FORB） 的支持。出版费得到了Distretto Rotaract 2031的善意捐赠，特别是都灵北东扶轮社的捐赠。我们感谢伊莱恩·米勒（Elaine Miller）校对我们的手稿。
Materials
| 18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
| Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
| Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
| Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
| Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
| Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
| Image analysis Software | Fiji | ||
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
| Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
| Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
| Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
| Mounting Medium | Merck | 107961 | |
| Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
| Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
| Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
| Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
| Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
| Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
| Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
| Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
| Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
| Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
| Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
| Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
| Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |
Referências
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