Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

Summary

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Abstract

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Caracteriza-se por diferentes prevalências entre os sexos, acometendo mais mulheres do que homens, e desfechos diferentes, mostrando formas mais agressivas em homens do que em mulheres. Além disso, a EM é altamente heterogênea em termos de aspectos clínicos, radiológicos e patológicos. Assim, faz-se necessário o aproveitamento de modelos experimentais animais que permitam a investigação do maior número possível de aspectos da patologia. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) representa um dos modelos de EM mais utilizados em camundongos, modelando diferentes características da doença, desde a ativação do sistema imune até danos ao SNC. Descrevemos aqui um protocolo para a indução de EAE em camundongos C57BL/6J machos e fêmeas usando imunização com o peptídeo glicoproteico 35-55 de oligodendrócitos de mielina (MOG_35-55), que leva ao desenvolvimento de uma forma crônica da doença. Relatamos também a avaliação do escore clínico diário e do desempenho motor desses camundongos durante 28 dias pós-imunização (28 dpi). Finalmente, ilustramos algumas análises histológicas básicas em nível do SNC, enfocando a medula espinhal como o sítio primário de dano induzido pela doença.

Introduction

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica autoimune que afeta o sistema nervoso central (SNC). Mostra a presença de infiltração perivascular de células inflamatórias, desmielinização, perda axonal e gliose¹. Sua etiologia permanece desconhecida e seus aspectos clínicos, radiográficos e patológicos sugerem notável heterogeneidade na^doença2.

Devido à sua etiologia e complexidade desconhecidas, até o momento, nenhum modelo animal recapitula todas as características clínicas e radiológicas apresentadas na EM humana ^3,4. No entanto, vários modelos animais são empregados para estudar diferentes aspectos da SM ^3,4. Nesses modelos, o início da doença é tipicamente extremamente artificial, e o período de tempo do início dos sinais clínicos é diferente entre humanos e camundongos. Por exemplo, em humanos, os processos fisiopatológicos subjacentes à doença não são detectados por anos antes do início das manifestações clínicas. Por outro lado, os experimentadores podem detectar sintomas em modelos animais dentro de semanas ou até dias após a indução da SM⁴.

Três modelos animais básicos produzem as características da desmielinização características da EM: os induzidos por vírus (por exemplo, o vírus da encefalomielite murina de Theiler), os induzidos por agentes tóxicos (por exemplo, cuprizona, lisolecitina) e as diferentes variantes da encefalomielite autoimune experimental (EAE)⁵. Cada modelo ajuda a estudar algumas facetas específicas da doença, mas nenhuma replica todas as características da EM⁶. Assim, é fundamental a escolha do modelo correto considerando as necessidades experimentais específicas e as questões científicas a serem abordadas.

Graças aos procedimentos de imunização contra antígenos derivados da mielina, o EAE é induzido pelo desencadeamento de uma resposta autoimune aos componentes do SNC em camundongos suscetíveis. A interação entre uma ampla gama de mecanismos imunopatológicos e neuropatológicos causa o desenvolvimento das principais características patológicas da EM (isto é, inflamação, desmielinização, perda axonal e gliose) nos camundongos imunizados ^7,8. Os camundongos começam a apresentar sintomas clínicos por volta da segunda semana após a imunização e geralmente apresentam paralisia ascendente da cauda para o membro e membro anterior. O escore clínico (isto é, a quantificação do acúmulo de déficits relacionados à doença) é geralmente avaliado por meio de uma escala de 5^pontos7.

A imunização ativa com proteína ou peptídeo ou a transferência passiva de células T encefalitogênicas podem ser usadas para induzir EAE em camundongos com diferentes origens genéticas (por exemplo, SJL/J, C57BL/6 e camundongos não obesos-diabéticos (NOD). A proteína proteolipídica da mielina (PLP), a proteína básica da mielina (MBP) e a glicoproteína oligodendrócita da mielina (MOG) são exemplos de proteínas do auto-SNC a partir das quais os imunógenos são usualmente produzidos. Particularmente, camundongos SJL/J imunizados com o epítopo imunodominante de PLP (PLP_139−151) desenvolvem um curso de doença remitente-recorrente (RR), enquanto camundongos C57BL/6J imunizados com o peptídeo MOG_35-55 imunodominante apresentam EAE de natureza crônica¹. Apesar de algumas limitações, como fornecer poucas informações sobre a progressão da SM, o papel das células B na doença, os mecanismos de dentro para fora ou dificuldades no estudo da remielinização, os modelos EAE têm contribuído enormemente para a compreensão dos processos autoimunes e neuroinflamatórios, aumentando o conhecimento no campo da EM e, assim, permitindo o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para essa doença^{4, 6º}.

No presente trabalho, focamos em uma forma particular de EAE ativo, a forma induzida pelo peptídeo glicoproteico 35-55 (MOG_35-55) 9,10,11,12. O EAE induzido pelo MOG_35-55 modela uma forma crônica de EM. Após a imunização, os camundongos passam por uma fase assintomática na primeira semana após a imunização, então a doença geralmente surge durante a segunda semana após a imunização, enquanto entre a terceira e a quarta semanas após a imunização, a doença torna-se crônica, sem possibilidade de recuperação completa dos déficits acumulados ^7,8,13. Curiosamente, não há diferenças entre homens e mulheres na incidência, início, curso ou progressão da doença na maioria dos estudos presentes na^literatura14, mesmo que menos estudos comparem a doença em homens e mulheres.

Em contraste, em humanos, esses parâmetros são conhecidos por serem fortemente dimórficos^sexualmente2. A SM afeta mais mulheres do que homens; no entanto, os homens geralmente desenvolvem uma forma mais agressiva da doença². Essas evidências sugerem um papel essencial, bem como complexo, dos hormônios gonadais¹⁵; No entanto, o papel e o mecanismo de ação dos hormônios sexuais na patologia permanecem obscuros. Além disso, dados de modelos animais apoiam a ideia de que tanto estrógenos quanto andrógenos exercem efeitos positivos em diferentes tratos da patologia de forma específica por sexo^16,17.

Alguns estudos também sugerem efeitos neuroprotetores, promielinizantes e anti-inflamatórios da progesterona¹⁸ e, embora as evidências em pacientes com EM sejam escassas¹⁸, esteroides neuroativos (ou seja, esteroides sintetizados de novo pelo sistema nervoso, como pregnenolona, tetrahidroprogesterona e diidroprogesterona) também podem afetar o curso patológico¹⁹. Coletivamente, esses dados apoiam a ideia de que os hormônios sexuais produzidos tanto perifericamente quanto dentro do SNC têm um papel importante e específico do sexo no início e progressão da doença. Portanto, no presente trabalho, pedimos a coleta de dados separados de animais machos e fêmeas.

Do ponto de vista histopatológico, a substância branca da medula espinhal é o principal sítio de lesão do SNC nesse modelo, que se caracteriza por regiões multifocais e confluentes de infiltrado inflamatório mononuclear e desmielinização8. Assim, ao descrever este protocolo para a indução de EAE induzida por MOG_35-55 em camundongos C57BL/6J, levaremos em consideração o desfecho da doença nos dois sexos e forneceremos alguns insights histopatológicos em relação à medula espinhal.

Protocol

Os cuidados e manejo dos animais no presente trabalho foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho da União Europeia de 22de setembro de 2010 (2010/63/UE); todos os procedimentos relatados no presente estudo foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (407/2018-PR) e pelo Comitê de Ética da Universidade de Torino (Projeto n° 360384). Sugerimos adequar o desenho experimental às diretrizes ARRIVE originalmente publicadas por Kilkenny et al., em 201020. Antes de come?…

Representative Results

Acompanhamento das EAE após a imunizaçãoIsso foi avaliado conforme descrito a seguir. Peso corporal e ingestão alimentarA análise de variância (ANOVA) two-way (sexo e tempo como variáveis independentes) mostra uma diminuição no PN dos animais EAE de ambos os sexos, especialmente na segunda semana pós-indução (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). No entanto, o dimorfismo sexual no…

Discussion

O protocolo de EAE induzido por MOG_35-55 que descrevemos levou ao desenvolvimento de uma forma crônica de EM em camundongos C57BL/6J7,8,13. Nesses resultados representativos, relatamos que os animais de ambos os sexos submetidos ao procedimento de imunização desenvolveram uma forma crônica da doença (ou seja, não se recuperam totalmente após o início da doença, acumulam déficits e mantêm um EC de pelo menos…

Materials

18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe	Terumo	TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope	NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance	Merck	Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y	Sigma-Aldrich	HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml	Sacco System	L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion)	VWR	213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s)	Sigma-Aldrich	MHS32	Filter before using it.
Image analysis Software	Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	Sigma-Aldrich	F5506	Store at +4 °C.
Isoflurane	Wellona Pharma		This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice	Jackson Laboratory, Envigo		Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g.
Microtome	Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium	Merck	107961
Mouse Rotarod	Ugo Basile	#47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra	Difco Laboratories Inc.	231141	Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)	Espikem	EPK1	Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations.
Optical microscope	NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer.
Pertussis toxin (PT)	Duotech	PT.181	Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution)	B. Eurospital	A 032182038	Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP
Software for image acquisition	NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle	Nipro	SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle	PIC	20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes	Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine	Rompun		This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative.
Zolazepam and Tiletamine	Zoletil  100		This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic