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Bioengenharia

아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델

Published: December 08, 2023
doi:
10.3791/65801
, , ,
1Department of Biomedical Engineering,University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research,University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology,University of Rochester Medical Center

Summary

쥐 뒷다리 이식에서 아킬레스건 삽입의 충돌로 인한 섬유연골 변화를 지속적인 세포 생존력으로 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼 및 조직 배양 프로토콜을 제시하여 힘줄 충돌의 역학을 탐구하는 데 적합한 모델을 제공합니다.

Abstract

뼈에 대한 힘줄 충돌은 횡방향 압축 변형률이 현저하게 상승한 다축 기계적 변형 환경을 생성하며, 이는 글리코사미노글리칸(GAG)이 풍부한 매트릭스의 축적과 콜라겐 네트워크의 리모델링을 특징으로 하는 국부적인 섬유연골 표현형을 유도합니다. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 GAG 침착과 콜라겐 네트워크의 무질서는 건병증의 특징입니다. 따라서 충돌은 건병증의 시작과 진행에 중요한 외적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 힘줄 충돌의 기저에 있는 기계생물학은 여전히 연구가 부족합니다. 힘줄 충돌에 대한 세포 반응을 밝히기 위한 이전의 노력은 세포에 단축 압축을 적용하고 체외에서 힘줄 외식을 절제했습니다. 그러나 분리된 세포는 기계적 반응에 중요한 3차원 세포외 환경이 부족하며, 시험관 내 및 절제된 외식물 연구 모두 충돌 부위의 해부학적 특징에 따라 생체 내 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 변형 환경을 재현하지 못합니다. 더욱이, 힘줄 충돌의 생체 내 모델은 기계적 변형 환경에 대한 제어가 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구에 적합한 새로운 쥐 뒷다리 이식 모델을 제시합니다. 이 모델은 아킬레스건을 제자리에서 유지하여 국소 해부학적 구조를 보존하고, 수동적으로 적용된 발목 배굴곡 중에 종골에 아킬레스건 삽입이 충돌하여 생성된 다축 변형 환경을 재현하면서 세포를 원래 환경 내에 유지합니다. 이 모델에 필수적인 조직 배양 프로토콜을 설명하고 7일 동안 지속적인 이식 생존 가능성을 설정하는 데이터를 제시합니다. 대표적인 결과는 조직학적 GAG 염색이 향상되고 충돌에 이차적으로 콜라겐 섬유 정렬이 감소했음을 보여주며, 이는 섬유연골 형성 증가를 시사합니다. 이 모델은 다양한 기계적 부하 요법을 조사하는 데 쉽게 적용할 수 있으며 충돌에 대한 반응으로 아킬레스건의 표현형 변화를 중재하는 메커니즘을 식별하기 위해 관심 분자 경로를 조작할 수 있습니다.

Introduction

아킬레스건과 회전근개 힘줄을 포함한 많은 힘줄은 정상적인 해부학적 위치로 인해 뼈 충돌을 경험합니다1,2,3,4. 힘줄 충돌은 종방향 섬유 축에 횡방향으로 향하는 압축 변형을 생성합니다.5,6,7. 힘줄 충돌 부위는 수축된 둥근 세포(섬유연골세포)가 글리코사미노글리칸(GAG) 함량이 현저히 증가한 무질서한 콜라겐 네트워크 내에 내장되어 있는 독특한 섬유연골 표현형을 보여줍니다2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. 이전 연구에서는 힘줄 충돌에 의해 생성된 이질적인 기계적 환경이 기본 메커니즘은 불분명하지만 큰 응집체 프로테오글리칸, 특히 아그레칸의 침착을 유도하여 이 GAG가 풍부한 매트릭스를 유지한다고 제안합니다1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 섬유연골 형성과 관련된 비정상적인 프로테오글리칸 대사는 만성적으로 충돌된 힘줄에서 불균형적으로 나타나는 흔하고 쇠약해지는 질병인 건병증의 특징입니다1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. 따라서 힘줄 충돌은 회전근개 질환 및 삽입성 아킬레스 건병증(IAT)을 포함한 가장 흔한 건병증을 유발하는 중요한 외인적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다50,51,52. 현재 건병증의 치료는 비효율적입니다. 예를 들어, IAT 환자의 약 47%는 보존적 관리 실패 후 외과적 개입이 필요하며, 수술 후 결과는 다양합니다53,54,55,56. 충돌과 건병증 사이의 명백한 관계에도 불구하고, 충돌한 힘줄의 세포가 기계적 환경을 감지하고 반응하는 기계생물학적 메커니즘이 제대로 설명되지 않아 건병증 발병기전에 대한 이해가 모호하고 부적절한 치료가 발생합니다.

외식(Explant) 모델은 힘줄 기계생물학(tendon mechanobiology) 57,58 연구에 유용한 도구이다. 힘줄 충돌의 기계생물학을 이해하기 위한 첫 번째 단계로, 몇몇 선행 연구에서는 세포 또는 절제된 힘줄 외피 27,29,30,31,32,33,34,39에 간단한 단축 압축을 적용한 후 세포 반응을 탐구했습니다. 그러나, 시험관 내 세포에는 균주 전달을 촉진하고, 기계적 변형에 의해 방출되는 중요한 성장 인자와 사이토카인을 격리하며, 기계적 형질도입에 중요한 역할을 하는 국소 접착 복합체를 위한 기질을 제공하는 세포외 및 세포주위 기질이 부족합니다57,59. 또한, in vitro 및 excised explant 연구 모두 in vivo에서 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 기계적 변형 환경을 재현하지 못하며, 이는 충돌 영역 5,6의 해부학적 특징에 의존한다. 충돌된 아킬레스건 삽입의 맥락에서, 여기에는 후종골 윤활낭 및 Kager의 지방 패드60,61,62,63과 같은 주변 조직이 포함됩니다. 반대로, 힘줄 충돌(25,28,36,37,38,64,65,66)의 생체내 모델은 힘줄에 직접 가해지는 하중의 크기 및 빈도에 대한 최소한의 제어를 허용하며, 이는 힘줄 기계생물학을 연구하기 위한 생체내 모델의 잘 알려진 한계이다57,58,67,68,69,70입니다. 생체 내 힘줄 변형률 측정의 어려움을 감안할 때, 이러한 모델 내에서 생성된 내부 변형률 환경은 종종 제대로 특성화되지 않습니다.

이 원고에서는 전체 쥐 뒷다리 외식에서 종골에 대한 아킬레스건 삽입의 충돌을 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼을 제시하며, 이 조직 배양 프로토콜과 짝을 이룰 때 식생 배양에서 7일 동안 생존력을 유지하고 힘줄 충돌의 생물학적 후유증을 연구할 수 있습니다. 이 플랫폼은 3D 프린팅된 폴리락트산(PLA) 베이스를 기반으로 제작되어 그립 부착 및 3D 프린팅된 PLA 체적 감소 인서트를 부착할 수 있는 기반을 제공합니다. 이 그립은 뒷다리의 꼬리 쪽이 위쪽을 향하도록 위쪽 다리와 무릎 근위부를 고정하는 데 사용되며, 초음파 프로브 또는 도립 현미경을 사용하여 위에서 아킬레스건을 이미지화할 수 있습니다(그림 1A). 부피 감소 인서트는 베이스의 트랙을 따라 미끄러지며 필요한 조직 배양 배지의 부피를 줄입니다. 뒷발을 감싼 땋은 선은 기본 디자인과 3D 프린팅된 PLA 클립을 사용하여 플랫폼 밖으로 라우팅됩니다. 줄을 당기면 뒷발이 배굴곡되고 아킬레스건 삽입이 종골에 부딪혀 횡방향 압박 변형률이 상승합니다 5,6 (그림 1A). 플랫폼은 조직 배양 배지에 잠긴 뒷다리 외출부를 유지하는 아크릴 욕조 내에 포함되어 있습니다. 팽팽한 끈을 접착 테이프로 욕조 외부에 고정하면 발목 배굴곡이 유지되어 아킬레스건 삽입의 정적 충돌이 발생합니다. 3D 프린팅 부품용 CAD 파일은 다양한 형식(보충 파일 1)으로 제공되므로 다양한 상용 및 무료 오픈 소스 CAD 소프트웨어로 가져와 실험 요구 사항에 맞게 수정할 수 있습니다. 제작을 위해 3D 프린터에 액세스할 수 없는 경우 저렴한 비용으로 부품을 인쇄하고 배송하는 온라인 3D 프린팅 서비스에 CAD 파일을 제공할 수 있습니다.

중요한 것은 삼두근-아킬레스 근 복합체가 무릎과 발목 관절 모두에 걸쳐 있다는 것입니다 71,72,73. 결과적으로 아킬레스건의 인장 변형은 무릎 굴곡의 영향을 받습니다. 무릎 신전은 아킬레스건에 긴장을 가하는 반면 무릎 굴곡은 긴장을 줄입니다. 먼저 무릎을 펴고 발목을 수동적으로 배측 굴곡함으로써 충돌된 삽입부의 압축 변형이 인장 변형에 중첩될 수 있습니다. 반대로 무릎을 구부린 상태에서 발목을 수동적으로 배측 굴곡하면 인장 변형이 감소하고 압축 변형이 남습니다. 현재 프로토콜은 이러한 세 가지 조건을 탐색합니다. 1) 정적 충돌의 경우 발을 경골에 대해 110° < 배굴곡하여 삽입을 방해하고 무릎을 구부려 긴장을 줄입니다. 2) 베이스라인 장력 그룹의 경우 무릎을 펴고 발목을 배굴곡 145° 이상으로 펴서 삽입 시 주로 인장 변형을 발생시킵니다. 3) 무부하 그룹의 경우, 외식은 외부에서 가해지는 하중이 없는 상태에서 무릎과 발목이 중립 위치에 있는 페트리 접시에서 배양됩니다. 위에서 언급한 각도는 발과 경골이 180° 각도로 평행하고 90° 각도로 수직인 좌표계를 기준으로 사진으로 측정한 것입니다.

프로토콜의 주요 단계에는 1) 뒷다리 외피 절개 및 피부와 족저 힘줄의 신중한 제거가 포함됩니다. 2) 48시간 덱사메타손 전처리 후 이식 배양; 3) 조직 절편 및 조직학적 염색; 4) 섬유연골 형성을 평가하기 위한 컬러 이미지 분석. 절개 후, 각 뒷다리 이식은 덱사메타손74가 보충된 배양 배지에서 48시간 동안 전처리됩니다. 각 마우스의 반대쪽 팔다리는 쌍별 비교를 위해 별도의 실험 그룹에 할당되어 생물학적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 전처리 후, 외식을 위에서 설명한 대로 플랫폼에 배치하고 7일 더 배양합니다(그림 1B). 48시간 전처리 직후 외식재를 제거하는 전처리(0일) 그룹에 대한 추가 비교가 이루어집니다.

이식 배양 후 뒷다리를 다듬고 포르말린을 고정하고 석회질을 제거하고 파라핀에 넣습니다. 시상 방향의 연속 절편은 근건성 접합부에서 종골 삽입까지 아킬레스건을 시각화하는 동시에 전체 힘줄을 통해 절편 깊이를 추적할 수 있습니다. 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 매개 dUTP X-nick 라벨링(TUNEL)은 세포사멸에 의한 이차적인 DNA 손상을 시각화하고 생존 가능성을 평가하는 데 사용됩니다. 톨루이딘 블루 조직학 및 맞춤형 컬러 이미지 분석을 수행하여 GAG 염색의 변화를 정량화합니다. 그런 다음 톨루이딘 블루 염색 조직 절편을 SHG 이미징에 사용하여 콜라주 섬유 조직의 변화를 특성화합니다(그림 1B).

제공된 대표적인 결과는 GAG가 풍부한 매트릭스의 조직학적 염색 변경과 모델 내에서 7일간의 정적 충돌에 의해 생성된 세포외 콜라겐 네트워크의 무질서를 시사합니다. 이 모델은 충돌 유도 섬유연골 변화의 기저에 있는 분자 메커니즘을 탐구하는 데 활용할 수 있습니다.

Protocol

모든 동물 연구는 로체스터 대학교 동물 자원 위원회의 승인을 받았습니다. 1. 조직 배양 배지의 제조 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신 및 200μM L-아스코르브산을 사용하여 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(1x DMEM)에서 모든 외식을 배양합니다. 초기 48시간 전처리의 경우, 100nM 덱사메타손74가 보충된 70mL의 배?…

Representative Results

TUNEL 염색 조직 절편의 대표 이미지는 실험군에서 7일간의 식생 배양 후 아킬레스건 체내 최소 세포사멸 핵을 보여줍니다(그림 2A). 이러한 이미지의 정량화는 조직 배양 프로토콜이 로딩 조건에서 7일간의 이식 배양 후 아킬레스건 내에서 평균 최대 78%의 생존율을 유지한다는 증거를 제공합니다(그림 2B). 정성적으로 향상된 톨루이?…

Discussion

이 연구에서 설명한 조직 배양 프로토콜과 결합된 실험용 쥐 뒷다리 이식 플랫폼은 아킬레스건 삽입 시 충돌 유도 섬유연골 형성의 역학을 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다. 이 이식 모델의 유용성은 7일간의 정적 충돌 후 톨루이딘 블루 염색에서 유의미하고 공간적으로 이질적인 변화와 함께 세포 생존율의 유지를 나타내는 대표적인 결과로 입증됩니다. 이러한 발견은 기계적 충돌에 이차…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 P30AR06965가 부분적으로 자금을 지원한 로체스터 대학교 근골격계 연구 센터의 조직학, 생화학 및 분자 이미징(HBMI) 코어의 Jeff Fox와 Vidya Venkatramani가 제공한 지원과 도움에 감사드립니다. 또한 저자들은 다광자 현미경 검사에 도움을 준 로체스터 대학 의료 센터의 광학 현미경 및 나노스코피 센터(CALMN)에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 R01 AR070765 및 R01 AR070765-04S1, 1R35GM147054 및 1R01AR082349의 자금 지원을 받았습니다.

Materials

Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox – Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining
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Referências

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Keywords: Murine Hind LimbExplant ModelMechanobiologyAchilles Tendon ImpingementMultiaxial Mechanical StrainFibrocartilageTendinopathyIn Vitro ModelIn Vivo ModelExtracellular MatrixGlycosaminoglycan (GAG)Collagen Network
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Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).
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