Modelo de Explante de Membro Posterior Murino para Estudo da Mecanobiologia do Impacto do Tendão de Aquiles

Summary

Apresentamos uma plataforma experimental personalizada e um protocolo de cultura de tecidos que recria a alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles em explantes murinos de membros posteriores com viabilidade celular sustentada, fornecendo um modelo adequado para explorar a mecanobiologia do impacto tendíneo.

Abstract

O impacto tendíneo sobre o osso gera um ambiente de deformação mecânica multiaxial com tensão compressiva transversal acentuadamente elevada, que provoca um fenótipo de fibrocartilagem localizada caracterizado pelo acúmulo de matriz rica em glicosaminoglicanos (GAG) e remodelamento da rede de colágeno. Enquanto a fibrocartilagem é uma característica normal em regiões impactadas de tendões saudáveis, a deposição excessiva de GAG e a desorganização da rede de colágeno são características marcantes da tendinopatia. Assim, o impacto é reconhecido clinicamente como um importante fator extrínseco no início e progressão da tendinopatia. No entanto, a mecanobiologia subjacente ao impacto tendíneo permanece pouco estudada. Esforços anteriores para elucidar a resposta celular ao impacto tendíneo aplicaram compressão uniaxial às células e excisaram explantes tendinosos in vitro. No entanto, as células isoladas carecem de um ambiente extracelular tridimensional crucial para a mecanorresposta, e tanto os estudos de explantes in vitro quanto os excisados não conseguem recapitular o ambiente de deformação multiaxial gerado pelo impacto tendíneo in vivo, que depende das características anatômicas da região impactada. Além disso, os modelos in vivo de impacto tendíneo carecem de controle sobre o ambiente de deformação mecânica. Para superar essas limitações, apresentamos um novo modelo de explante de membro posterior murino adequado para o estudo da mecanobiologia do impacto do tendão de Aquiles. Este modelo mantém o tendão de Aquiles in situ para preservar a anatomia local e reproduz o ambiente de deformação multiaxial gerado pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles sobre o calcâneo durante a dorsiflexão do tornozelo aplicada passivamente, retendo as células em seu ambiente nativo. Descrevemos um protocolo de cultura de tecidos integrado a este modelo e apresentamos dados que estabelecem a viabilidade sustentada do explante ao longo de 7 dias. Os resultados representativos demonstram aumento da coloração histológica de GAG e diminuição do alinhamento das fibras colágenas secundárias ao impacto, sugerindo elevada formação de fibrocartilagem. Este modelo pode ser facilmente adaptado para investigar diferentes regimes de carregamento mecânico e permite a manipulação de vias moleculares de interesse para identificar mecanismos mediadores de alterações fenotípicas no tendão de Aquiles em resposta ao impacto.

Introduction

Uma infinidade de tendões, incluindo o tendão de Aquiles e os tendões do manguito rotador, experimentam impacto ósseo devido ao posicionamento anatômico normal^1,2,3,4. O impacto tendíneo gera deformação compressiva direcionada transversalmente ao eixo longitudinal das fibras^5,6,7. Regiões de impacto tendíneo demonstram um fenótipo único de fibrocartilagem no qual células arredondadas e encolhidas (fibrocondrócitos) estão embutidas em uma rede de colágeno desorganizada com conteúdo de glicosaminoglicanos (GAG) acentuadamente aumentado^{2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. Estudos anteriores sugerem que o ambiente mecânico díspar produzido pelo impacto tendíneo sustenta essa matriz rica em GAG impulsionando a deposição de grandes proteoglicanos agregadores, mais notavelmente agrecan, embora os mecanismos subjacentes não sejam claros^{1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. Enquanto a fibrocartilagem é uma característica normal em regiões impactadas de tendões saudáveis, o metabolismo aberrante de proteoglicanos associado à formação excessiva de fibrocartilagem é uma característica marcante da tendinopatia, uma doença comum e debilitante que surge desproporcionalmente em tendões cronicamente impactados^{1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49}. Assim, o impacto tendíneo é reconhecido clinicamente como um importante fator extrínseco que conduz várias das tendinopatias mais comuns, incluindo a doença do manguito rotador e a tendinopatia de Aquiles insercional (TIA)^50,51,52. Atualmente, o tratamento da tendinopatia é ineficiente. Por exemplo, aproximadamente 47% dos pacientes com IAT necessitam de intervenção cirúrgica após falha no manejo conservador, com resultados pós-operatórios variáveis^53,54,55,56. Apesar da aparente relação entre impacto e tendinopatia, os mecanismos mecanobiológicos pelos quais as células do tendão impactado sentem e respondem ao seu ambiente mecânico são pouco descritos, o que obscurece o entendimento da patogênese da tendinopatia e resulta em tratamento inadequado.

Modelos de explantes são ferramentas úteis no estudo da mecanobiologia tendínea^57,58. Como primeiro passo para o entendimento da mecanobiologia do impacto tendíneo, vários estudos prévios exploraram a resposta celular após a aplicação de compressão uniaxial simples em células ou explantes tendinosos excisados27,29,30,31,32,33,34,39. Entretanto, as células in vitro carecem de matrizes extracelulares e pericelulares que facilitem a transferência de deformação, sequestrem importantes fatores de crescimento e citocinas liberadas por deformação mecânica e forneçam substrato para complexos de adesão focal que desempenham um papel na mecanotransdução^57,59. Além disso, tanto os estudos in vitro quanto os excisantes excisados não conseguem recapitular o ambiente de deformação mecânica multiaxial gerado pelo impacto tendíneo in vivo, que depende das características anatômicas da região impactada5,6. No contexto da inserção do tendão de Aquiles impactado, isso inclui tecidos circunvizinhos, como a bursa retrocalcânea e o coxim gorduroso de Kager 60,61,62,63. Por outro lado, modelos in vivo de impacto tendíneo25,28,36,37,38,64,65,66 permitem controle mínimo sobre a magnitude e frequência da carga aplicada diretamente ao tendão, o que é uma limitação bem reconhecida dos modelos in vivo para o estudo da mecanobiologia tendínea57,58 67,68,69,70. Diante dos desafios na mensuração in vivo da deformação tendínea, o ambiente interno de deformação gerado nesses modelos é frequentemente pouco caracterizado.

Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma experimental personalizada que recria o impacto da inserção do tendão de Aquiles sobre o calcâneo dentro de explantes de membros posteriores murinos inteiros que, quando pareados com este protocolo de cultura de tecidos, mantém a viabilidade por 7 dias em cultura de explantes e permite o estudo das sequelas biológicas do impacto tendíneo. A plataforma é construída sobre uma base de ácido polilático (PLA) impressa em 3D que fornece a base para a fixação das alças e inserção de redução de volume PLA impressa em 3D. As pegas são usadas para pinçar a perna e o joelho proximal à junção miotendínea de Aquiles com a face caudal do membro posterior voltada para cima, permitindo que o tendão de Aquiles seja visualizado de cima usando uma sonda de ultrassom ou microscópio invertido (Figura 1A). A inserção de redução de volume desliza ao longo de uma trilha na base e reduz o volume necessário de meios de cultura de tecidos. Uma linha trançada enrolada ao redor da pata traseira é roteada para fora da plataforma utilizando o design de base e um clipe PLA impresso em 3D. Ao puxar a corda, a pata traseira é dorsiflexionada e a inserção do tendão de Aquiles é impingida contra o calcâneo, resultando em elevada deformação compressiva transversa ^5,6 (Figura 1A). A plataforma está contida dentro de um banho de acrílico que mantém os explantes do membro posterior submersos em meios de cultura de tecidos. A fixação da corda tensa na parte externa do banho com fita adesiva mantém a dorsiflexão do tornozelo para produzir impacto estático da inserção do tendão de Aquiles. Os arquivos CAD para componentes impressos em 3D são fornecidos em vários formatos (Arquivo Suplementar 1), permitindo a importação para uma variedade de softwares CAD comerciais e gratuitos de código aberto para modificação para atender às necessidades experimentais. Se o acesso a impressoras 3D não estiver disponível para fabricação, os arquivos CAD podem ser fornecidos aos serviços de impressão 3D on-line que imprimirão e enviarão as peças a baixo custo.

É importante ressaltar que o complexo músculo-tenculotendíneo tríceps sural abrange as articulações do joelho e tornozelo 71,72,73. Consequentemente, o estiramento tênsil no tendão de Aquiles é influenciado pela flexão do joelho. A extensão do joelho coloca o tendão de Aquiles sob tensão, enquanto a flexão do joelho reduz a tensão. Estendendo primeiro o joelho e, em seguida, dorsiflexando passivamente o tornozelo, as tensões compressivas na inserção impactada podem ser sobrepostas às tensões de tração. Por outro lado, ao dorsiflexar passivamente o tornozelo com o joelho flexionado, a tensão de tração é reduzida e a tensão compressiva permanece. O protocolo atual explora três dessas condições. 1) Para impacto estático, o pé é dorsiflexionado a < 110° em relação à tíbia para impactar a inserção, com o joelho fletido para reduzir a tensão. 2) Para o grupo tensão basal, o tornozelo é estendido acima de 145° de dorsiflexão com o joelho estendido, gerando tensão tracional predominante na inserção. 3) Para o grupo descarregado, os explantes são cultivados em placa de Petri com joelho e tornozelo em posição neutra na ausência de carga aplicada externamente. Os ângulos acima referidos são medidos fotograficamente em relação a um sistema de coordenadas onde o pé e a tíbia são paralelos num ângulo de 180° e perpendiculares num ângulo de 90°.

As principais etapas do protocolo incluem: 1) dissecção dos explantes dos membros posteriores e remoção cuidadosa da pele e do tendão plantar; 2) cultura de explantes após pré-tratamento com dexametasona 48 h; 3) corte tecidual e coloração histológica; e 4) análise de imagens coloridas para avaliar a formação de fibrocartilagem. Após a dissecção, cada explante de membro posterior é pré-tratado por 48 h em meios de cultura suplementados com dexametasona⁷⁴. Os membros contralaterais de cada camundongo são alocados em grupos experimentais separados para comparação pareada, o que ajuda a controlar a variabilidade biológica. Após o pré-tratamento, os explantes são posicionados em plataformas como descrito acima e cultivados por mais 7 dias (Figura 1B). Comparações adicionais são feitas com um grupo pré-tratado (dia 0) no qual os explantes são removidos imediatamente após o pré-tratamento de 48 h.

Após a cultura do explante, os membros posteriores são aparados, fixados em formalina, descalcificados e incluídos em parafina. A secção seriada em orientação sagital proporciona a visualização do tendão de Aquiles desde a junção miotendínea até a inserção do calcâneo, permitindo que a profundidade da secção seja rastreada através de todo o tendão. A marcação dUTP X-nick mediada pela desoxinucleotidiltransferase terminal (TdT) (TUNEL) é usada para visualizar danos ao DNA secundários à apoptose e avaliar a viabilidade. A histologia do azul de toluidina e a análise de imagens coloridas personalizadas são realizadas para quantificar as alterações na coloração GAG. Cortes de tecido corados com azul de toluidina são então usados para imagens de SHG para caracterizar alterações na organização das fibras de colagem (Figura 1B).

Os resultados representativos fornecidos sugerem coloração histológica alterada da matriz rica em GAG e desorganização da rede de colágeno extracelular gerada por 7 dias de impacto estático dentro do modelo. Este modelo pode ser utilizado para explorar mecanismos moleculares subjacentes à alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto.

Protocol

Todo o trabalho com animais foi aprovado pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. 1. Preparo dos meios de cultura de tecidos Cultivar todos os explantes em meio Dulbecco’s Modified Eagle (1x DMEM) com 1% v/v de penicilina-estreptomicina e 200 μM de ácido L-ascórbico em estufa a 37 °C e 5% de CO2. Para o pré-tratamento inicial de 48 h, cada explante foi cultivado em 70 mL de meio de cultura suplementado com 100 nM de dexametasona<…

Representative Results

Imagens representativas de cortes de tecido corados com TUNEL demonstram núcleos apoptóticos mínimos dentro do corpo do tendão de Aquiles após 7 dias de cultura de explantes em todos os grupos experimentais (Figura 2A). A quantificação dessas imagens fornece evidências de que o protocolo de cultura de tecidos mantém até 78% de viabilidade em média dentro do tendão de Aquiles após 7 dias de cultura de explantes em condições de carregamento (Figura 2B</stron…

Discussion

A plataforma experimental de explante de membro posterior murino pareada com o protocolo de cultura de tecidos descrito neste estudo fornece um modelo adequado para o estudo da mecanobiologia da formação de fibrocartilagem impulsionada pelo impacto na inserção do tendão de Aquiles. A utilidade deste modelo de explante é demonstrada pelos resultados representativos, que indicam manutenção da viabilidade celular concomitante com mudança significativa e espacialmente heterogênea na coloração com azul de toluidin…

Materials

Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	–	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining