Mimetizando o Método do Rolo de Ding na Lesão Muscular Induzida por Notexina em Ratos

Summary

Este protocolo descreve um dispositivo simples que imita o método de rolo de Ding, estabelece um modelo de lesão muscular esquelética em ratos e usa coloração de hematoxilina-eosina para observar a patologia do tecido danificado e ensaio imunoenzimático para detectar alterações nos marcadores de dano sérico.

Abstract

O método de rolo de Ding é uma das manipulações mais usadas em clínicas de massagem tradicional chinesa (Tuina) e uma das manipulações contemporâneas de Tuina mais influentes na China. Ele é baseado no método de rolamento tradicional comumente usado no gênero Zen de um dedo e chamado de método de rolo de Ding. Devido aos seus efeitos anti-inflamatórios e promotores da circulação sanguínea, o método de rolamento de Ding tem efeitos terapêuticos sólidos na miopatia. Devido à grande área de força aplicada à pele humana, o método de rolagem de Ding é desafiador de executar em animais experimentais com pequenas áreas de pele, como ratos e coelhos. Além disso, a força de Tuina aplicada ao corpo humano difere daquela aplicada aos animais de experimentação, por isso pode acontecer que a força seja muito alta ou muito baixa para alcançar o efeito terapêutico de Tuina durante o experimento. Este experimento visa criar um massageador simples adequado para ratos com base nos parâmetros de manipulação de rolamento de Ding (força, frequência, duração de Tuina). O dispositivo pode padronizar a manipulação em experimentos com animais e reduzir a variação na força de Tuina aplicada a diferentes animais devido a fatores subjetivos. Um modelo de lesão muscular esquelética induzida por anotoxina em ratos foi estabelecido, e os marcadores de lesão plasmática creatina quinase (CK) e proteína ligadora de ácidos graxos 3 (FABP3) foram usados para avaliar o efeito terapêutico de Tuina na lesão muscular esquelética. Os resultados mostraram que este massageador Tuina pode reduzir os níveis de expressão de CK e FABP3 e diminuir o grau de lesão muscular esquelética. Portanto, o massageador Tuina aqui descrito, mimetizando o método do rolo de Ding, contribui para padronizar a manipulação de Tuina em pesquisas experimentais e é de grande ajuda para pesquisas subsequentes sobre o mecanismo molecular de Tuina para miopatia.

Introduction

As lesões musculares são lesões traumáticas comuns na vida clínica e diária, causadas por golpes externos (contusões) ou sobretensão crônica das fibras musculares (estiramentos), etc., resultando em disfunção muscular e dor, afetando até seriamente a qualidade de vida do^paciente1. Iniciar a reabilitação o mais precocemente possível após uma lesão por esforço agudo é a chave para reduzir o tempo de retorno ao esporte² e reduzir a dor ^3,4. Na medicina ocidental moderna, os primeiros socorros clínicos para lesões musculares seguem os princípios de repouso, gelo, compressão e elevação (RICE) para parar o sangramento lesivo no tecido muscular⁵ e anti-inflamatórios não hormonais para aliviar a dor⁶. A descoberta de novas terapias, como os exossomos⁷ e^{a engenharia} tecidual8, tornou-se potencial estratégia de tratamento das doenças musculares esqueléticas, compensando as deficiências dos tratamentos farmacológicos anteriores. No entanto, também pode aumentar o custo do tratamento para os pacientes, colocando-os sob enorme pressão financeira⁹. Portanto, terapias alternativas e complementares são recomendadas para o tratamento de problemas musculoesqueléticos¹⁰. Tuina é amplamente utilizado clinicamente na China como um método médico tradicional e é popular entre os pacientes por sua eficácia e menos efeitos colaterais. A terapia com Tuina para distúrbios musculoesqueléticos pode aliviar a dor e melhorar a função^11,12,13. O Sr. Ding Jifeng, um famoso praticante de Tuina de Xangai, fundou o método de rolo¹⁴ de Ding. É uma técnica única de rolamento e esmagamento com uma grande área de força, força uniforme e suave, e penetração intensa.

Diferentes modelos animais são baseados em diferentes etiologias. Apresentam vantagens e desvantagens, e a seleção de modelos animais corretos e apropriados é de grande importância para experimentos básicos, o que ajuda a entender as vias de sinalização celular e molecular de regeneração e reparo após lesão muscular esquelética para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de doenças musculares esqueléticas. Modelos quimicamente induzidos de lesão muscular são amplamente utilizados, com injeções de músculo esquelético causando necrose de miofibras e produzindo áreas regeneradas que podem efetivamente se regenerar dentro de 2 semanas¹⁵. Tanto a notexina quanto a bupivacaína podem causar danos musculares. No entanto, a notexina pode causar dano miotóxico mais grave ao músculo esquelético do que a bupivacaína, e a recuperação funcional natural é relativamente mais lenta¹⁶. A moldagem por injeção intramuscular de drogas não só leva menos tempo, mas também tem efeitos controlados e extensão do dano muscular esquelético. Esse controle quantificável dificulta menos a moldagem com sucesso^15,17.

A resposta inflamatória é uma resposta biológica essencial que tem sido extensivamente estudada no contexto da^{miopatia18,19}. Nos estágios iniciais da lesão muscular esquelética, a necrose das miofibras interrompe a homeostase muscular local, e muitas células inflamatórias infiltram o local da lesão, secretando muitas citocinas pró-inflamatórias¹⁹. A creatina quinase (CK) é um biomarcador sérico tradicional para avaliação da lesão muscular esquelética. No entanto, carece de especificidade tecidual²⁰ e sensibilidade²¹, o que limita sua capacidade de avaliar a extensão do dano muscular induzido por drogas e relatar indiretamente a extensão da recuperação muscular após a lesão. Novos biomarcadores, incluindo a proteína ligadora de ácidos graxos 3 (FABP3), têm mostrado recentemente especificidade e sensibilidade teciduais relativamente altas em modelos de lesão muscular esquelética em roedores. FABP3 é uma família de proteínas de ligação expressas principalmente em células musculares cardíacas e esqueléticas e implicadas no metabolismo, transporte e sinalização de ácidos graxos²². Portanto, escolhemos uma combinação de dois biomarcadores, CK e FABP3, para avaliar a extensão do dano muscular esquelético induzido pela notoxina e a recuperação após o tratamento.

Em roedores, os músculos são superficiais, e a área da pele é pequena, o que também determina que os vários parâmetros de massagem em roedores não serão os mesmos que em humanos, como na terapia animal, o massagista deve tratá-los com menos força usando o método de rolo de Ding, e pode não ser propício para a operação desta técnica devido ao pequeno tamanho da área lesionada, o que pode, em última análise, levar a uma redução na eficácia da massagem. Portanto, o experimento utilizou o massageador de rolamento fabricado internamente, que está de acordo com as características do método do rolo de Ding, para intervir e avaliar o efeito terapêutico do modelo de lesão muscular esquelética induzida por notoxina em ratos, o que ajuda a padronizar os parâmetros de Tuina em estudos experimentais em animais, a fim de investigar profundamente o mecanismo molecular de ação de Tuina, um método de tratamento da medicina tradicional chinesa, sobre doenças musculoesqueléticas.

Protocol

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade de Medicina Chinesa de Hunan. 1. Montagem do massageador rolante Selecione um massageador que consista em um rolo de borracha, suporte de garfo, mola, defletor limite, tala de ajuste, parafuso e alça de acrílico (Figura 1). Certifique-se de que o rolo de borracha mede 3 cm de comprimento e 1,6 cm de diâmetro, a mola mede 3 …

Representative Results

A fim de observar as propriedades morfológicas do músculo esquelético de ratos após a lesão, o músculo gastrocnêmio foi corado com hematoxilina e eosina, e as imagens coradas foram lidas com um software de análise conforme descrito no protocolo para 8 ratos por grupo. Em ratos com lesão do músculo gastrocnêmio induzida por notexina (grupo NTX), muitas células musculares estavam rompidas, atróficas, necróticas e dispostas irregularmente. Havia também alta infiltração de neutrófilos e linfócitos ao redor…

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo para Tuina no tratamento da lesão muscular esquelética em ratos e, em seguida, analisamos o grau de lesão muscular esquelética após o tratamento para verificar a eficácia do método. Notadamente, modelos de lesão muscular esquelética de ratos, incluindo, mas não se limitando a, indução de drogas (notaxina, bupivacaína)16, contusão contusa ²⁶, esmagamento 27 e isquemia-reperfusão²⁸, podem ser intervencionados com Tuina.<sup class=…

Materials

1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ