Imitación del método de rodillo de Ding en lesiones musculares inducidas por Notexin en ratas

Summary

Este protocolo describe un dispositivo simple que imita el método de rollo de Ding, establece un modelo de lesión muscular esquelética en ratas y utiliza la tinción de hematoxilina-eosina para observar la patología del tejido dañado y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas para detectar cambios en los marcadores de daño sérico.

Abstract

El método del rollo de Ding es una de las manipulaciones más utilizadas en las clínicas de masaje tradicional chino (Tuina) y una de las manipulaciones contemporáneas de Tuina más influyentes en China. Se basa en el método tradicional de enrollado comúnmente utilizado en el género zen de un dedo y se denomina método de rollo de Ding. Debido a sus efectos antiinflamatorios y promotores de la circulación sanguínea, el método de rodadura de Ding tiene efectos terapéuticos sólidos sobre la miopatía. Debido a la gran área de fuerza aplicada a la piel humana, el método de balanceo de Ding es difícil de realizar en animales de experimentación con áreas de piel pequeñas, como ratas y conejos. Además, la fuerza de Tuina aplicada al cuerpo humano difiere de la aplicada a animales de experimentación, por lo que puede suceder que la fuerza sea demasiado alta o demasiado baja para lograr el efecto terapéutico de Tuina durante el experimento. Este experimento tiene como objetivo crear un masajeador simple adecuado para ratas basado en los parámetros de manipulación de balanceo de Ding (fuerza, frecuencia, duración de Tuina). El dispositivo puede estandarizar la manipulación en experimentos con animales y reducir la variación en la fuerza de Tuina aplicada a diferentes animales debido a factores subjetivos. Se estableció un modelo de lesión muscular esquelética inducida por notexina en ratas, y se utilizaron marcadores de lesión plasmática creatina quinasa (CK) y proteína de unión a ácidos grasos 3 (FABP3) para evaluar el efecto terapéutico de Tuina sobre la lesión muscular esquelética. Los resultados mostraron que este masajeador Tuina podía reducir los niveles de expresión de CK y FABP3 y ralentizar el grado de lesión del músculo esquelético. Por lo tanto, el masajeador Tuina descrito aquí, imitando el método del rollo de Ding, contribuye a estandarizar la manipulación de Tuina en la investigación experimental y es de gran ayuda para la investigación posterior sobre el mecanismo molecular de Tuina para la miopatía.

Introduction

Las lesiones musculares son lesiones traumáticas comunes en la vida clínica y diaria, causadas por golpes externos (contusiones) o sobreesfuerzo crónico de las fibras musculares (distensiones), etc., que dan lugar a disfunción muscular y dolor, afectando incluso gravemente a la calidad de vida del paciente¹. Iniciar la rehabilitación lo antes posible después de una lesión por esfuerzo agudo es la clave para reducir el tiempo de retorno al deporte² y para reducir el dolor ^3,4. En la medicina occidental moderna, los primeros auxilios clínicos para las lesiones musculares siguen los principios de reposo, hielo, compresión y elevación (RICE) para detener el sangrado dañino en el tejido muscular⁵ y los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos para aliviar el dolor⁶. El descubrimiento de nuevas terapias como los exosomas⁷ y la ingeniería tisular⁸ se convirtieron en posibles estrategias de tratamiento para las enfermedades del músculo esquelético, compensando las deficiencias de los tratamientos farmacológicos anteriores. Sin embargo, también puede aumentar el costo del tratamiento para los pacientes, poniéndolos bajo una tremenda presión financiera⁹. Por lo tanto, se recomiendan terapias alternativas y complementarias para el tratamiento de problemas musculoesqueléticos¹⁰. Tuina se usa ampliamente clínicamente en China como un método médico tradicional y es popular entre los pacientes por su eficacia y menos efectos secundarios. La terapia Tuina para los trastornos musculoesqueléticos puede aliviar el dolor y mejorar la función^11,12,13. El Sr. Ding Jifeng, un famoso practicante de Shanghai Tuina, fundó el método de rollo^{de Ding 14}. Es una técnica única de laminación y trituración con una gran área de fuerza, una fuerza uniforme y suave, y una penetración intensa.

Los diferentes modelos animales se basan en diferentes etiologías. Tienen ventajas y desventajas, y la selección de modelos animales correctos y apropiados es de gran importancia para los experimentos básicos, lo que ayuda a comprender las vías de señalización celular y molecular de la regeneración y reparación después de una lesión del músculo esquelético para desarrollar nuevas terapias para tratar el tratamiento de las enfermedades del músculo esquelético. Los modelos de lesión muscular inducidos químicamente son ampliamente utilizados, con inyecciones de músculo esquelético que causan necrosis miofibral y producen áreas regeneradas que pueden regenerarse efectivamente en 2 semanas¹⁵. Tanto la notexina como la bupivacaína pueden causar daño muscular. Sin embargo, la notexina puede causar un daño miotóxico más grave al músculo esquelético que la bupivacaína, y la recuperación funcional natural es relativamente más lenta¹⁶. El moldeo por inyección intramuscular de fármacos no solo lleva menos tiempo, sino que también tiene efectos controlados y extensión del daño muscular esquelético. Este control cuantificable hace que el moldeo exitoso sea menos difícil^15,17.

La respuesta inflamatoria es una respuesta biológica esencial que ha sido ampliamente estudiada en el contexto de la miopatía^18,19. En las primeras etapas de la lesión del músculo esquelético, la necrosis miofibrosa altera la homeostasis muscular local, y muchas células inflamatorias se infiltran en el sitio de la lesión, secretando muchas citocinas proinflamatorias¹⁹. La creatina quinasa (CK) es un biomarcador sérico tradicional para evaluar la lesión del músculo esquelético. Sin embargo, carece de especificidad tisular²⁰ y sensibilidad²¹, lo que limita su capacidad para evaluar el alcance del daño muscular inducido por fármacos e informar indirectamente el grado de recuperación muscular después de la lesión. Nuevos biomarcadores, incluida la proteína de unión a ácidos grasos 3 (FABP3), han demostrado recientemente una especificidad tisular y una sensibilidad relativamente altas en modelos de lesiones musculares esqueléticas en roedores. FABP3 es una familia de proteínas de unión que se expresan principalmente en las células del músculo cardíaco y esquelético e implicadas en el metabolismo, el transporte y la señalización de los ácidos grasos²². Por lo tanto, elegimos una combinación de dos biomarcadores, CK y FABP3, para evaluar el alcance del daño muscular esquelético inducido por notexina y la recuperación después del tratamiento.

En roedores, los músculos son poco profundos y el área de la piel es pequeña, lo que también determina que los diversos parámetros del masaje en roedores no serán los mismos que en los humanos, como en la terapia con animales, el masajista debe tratarlos con menos fuerza utilizando el método de rollo de Ding, y puede no ser propicio para la operación de esta técnica debido al pequeño tamaño del área lesionada, lo que, en última instancia, puede conducir a una reducción de la eficacia del masaje. Por lo tanto, el experimento utilizó el masajeador rodante de fabricación propia, que se ajusta a las características del método de rodillo de Ding, para intervenir y evaluar el efecto terapéutico del modelo de lesión muscular esquelética inducida por notexina en ratas, lo que ayuda a estandarizar los parámetros de Tuina en estudios con animales de experimentación con el fin de investigar profundamente el mecanismo molecular de acción de Tuina. un método de tratamiento de la medicina tradicional china, sobre las enfermedades musculoesqueléticas.

Protocol

Los procedimientos que involucran animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de la Universidad de Medicina China de Hunan. 1. Montaje del masajeador rodante Seleccione un masajeador que conste de un rodillo de goma, un soporte para horquillas, un resorte, un deflector de límite, una férula de ajuste, un tornillo y un mango acrílico (Figura 1). Asegúrese de que el rodillo de goma mida 3 cm de largo y 1,6…

Representative Results

Con el fin de observar las propiedades morfológicas del músculo esquelético de rata después de la lesión, el músculo gastrocnemio se tiñó con hematoxilina y eosina, y las imágenes teñidas se leyeron con un software de análisis como se describe en el protocolo para 8 ratas por grupo. En ratas con lesión muscular gastrocnemia inducida por notexina (grupo NTX), muchas células musculares estaban rotas, atróficas, necróticas y dispuestas irregularmente. También hubo una alta infiltración de neutrófilos y lin…

Discussion

Aquí, describimos un protocolo para el tratamiento de Tuina de la lesión muscular esquelética en ratas y luego analizamos el grado de lesión muscular esquelética después del tratamiento para verificar la efectividad del método. En particular, los modelos de lesión del músculo esquelético de rata, que incluyen, entre otros, la inducción de fármacos (notexina, bupivacaína)¹⁶, la contusión^{contusa 26}, el aplastamiento²⁷ y la isquemia-reperf…

Materials

1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ