Efterlikna Dings rullningsmetod på Notexin-inducerad muskelskada hos råttor

Summary

Detta protokoll beskriver en enkel anordning som efterliknar Dings rollmetod, etablerar en råttmodell av skelettmuskelskada och använder hematoxylin-eosinfärgning för att observera patologin hos skadad vävnad och enzymkopplad immunadsorberande analys för att upptäcka förändringar i serumskademarkörer.

Abstract

Dings rollmetod är en av de mest använda manipulationerna i traditionella kinesiska massagekliniker (Tuina) och en av de mest inflytelserika samtida Tuina-manipulationerna i Kina. Den är baserad på den traditionella rullningsmetoden som vanligtvis används i zen-genren med ett finger och kallas Dings rullningsmetod. På grund av dess antiinflammatoriska och blodcirkulationsfrämjande effekter har Dings rullningsmetod goda terapeutiska effekter på myopati. På grund av det stora kraftområdet som appliceras på mänsklig hud är Dings rullningsmetod utmanande att utföra på försöksdjur med små hudområden, såsom råttor och kaniner. Dessutom skiljer sig styrkan hos Tuina applicerad på människokroppen från den som appliceras på försöksdjur, så det kan hända att styrkan är för hög eller för låg för att uppnå den terapeutiska effekten av Tuina under experimentet. Detta experiment syftar till att skapa en enkel massageapparat som är lämplig för råttor baserat på Dings rullande manipulationsparametrar (styrka, frekvens, Tuina-varaktighet). Enheten kan standardisera manipulation i djurförsök och minska variationen i Tuina-kraften som appliceras på olika djur på grund av subjektiva faktorer. En råttmodell av notexin-inducerad skelettmuskelskada etablerades, och plasmaskademarkörerna kreatinkinas (CK) och fettsyrabindande protein 3 (FABP3) användes för att bedöma den terapeutiska effekten av Tuina på skelettmuskelskada. Resultaten visade att denna Tuina-massageapparat kunde minska nivåerna av CK- och FABP3-uttryck och bromsa graden av skelettmuskelskada. Därför bidrar Tuina-massageapparaten som beskrivs här, som efterliknar Dings rullningsmetod, till att standardisera Tuina-manipulation i experimentell forskning och är till stor hjälp för efterföljande forskning om Tuinas molekylära mekanism för myopati.

Introduction

Muskelskador är vanliga traumatiska skador i det kliniska och dagliga livet, orsakade av yttre slag (kontusioner) eller kronisk överbelastning av muskelfibrer (stammar) etc., vilket resulterar i muskeldysfunktion och smärta, som till och med allvarligt påverkar patientens livskvalitet¹. Att påbörja rehabilitering så tidigt som möjligt efter en akut belastningsskada är nyckeln till att minska tiden för återgång till idrott² och för att minska smärta ^3,4. I modern västerländsk medicin följer klinisk första hjälpen för muskelskador principerna vila, is, kompression och höjning (RICE) för att stoppa skadlig blödning i muskelvävnaden⁵ och icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel för att lindra smärta⁶. Upptäckten av nya terapier som exosomer⁷ och vävnadsteknik⁸ blev potentiella behandlingsstrategier för skelettmuskelsjukdomar, vilket kompenserade för tidigare farmakologiska behandlingars brister. Men det kan också öka behandlingskostnaderna för patienterna, vilket sätter dem under enorm ekonomisk press⁹. Därför rekommenderas alternativa och kompletterande terapier för behandling av muskuloskeletala problem¹⁰. Tuina används i stor utsträckning kliniskt i Kina som en traditionell medicinsk metod och är populär bland patienter för sin effektivitet och färre biverkningar. Tuina-terapi för muskuloskeletala sjukdomar kan lindra smärta och förbättra funktionen^11,12,13. Ding Jifeng, en berömd Tuina-utövare från Shanghai, grundade Dings kastmetod¹⁴. Det är en unik rullnings- och krossteknik med ett stort kraftområde, enhetlig och skonsam kraft och intensiv penetration.

Olika djurmodeller är baserade på olika etiologier. De har för- och nackdelar, och valet av korrekta och lämpliga djurmodeller är av stor betydelse för grundläggande experiment, som hjälper till att förstå de cellulära och molekylära signalvägarna för regenerering och reparation efter skelettmuskelskada för att utveckla nya terapier för behandling av skelettmuskelsjukdomar. Kemiskt inducerade modeller av muskelskada används i stor utsträckning, med injektioner av skelettmuskulatur som orsakar myofibernekros och producerar regenererade områden som effektivt kan regenerera inom 2 veckor¹⁵. Både notexin och bupivakain kan orsaka muskelskador. Notexin kan dock orsaka allvarligare myotoxiska skador på skelettmuskulaturen än bupivakain, och den naturliga funktionella återhämtningen är relativt långsammare¹⁶. Läkemedel intramuskulär formsprutning tar inte bara mindre tid utan har också kontrollerade effekter och omfattning av skelettmuskelskada. Denna kvantifierbara kontroll gör det mindre svårt att lyckas med gjutningen^15,17.

Inflammatorisk respons är en essentiell biologisk respons som har studerats utförligt i samband med myopati^18,19. I de tidiga stadierna av skelettmuskelskada stör myofibernekros lokal muskelhomeostas, och många inflammatoriska celler infiltrerar skadestället och utsöndrar många proinflammatoriska cytokiner¹⁹. Kreatinkinas (CK) är en traditionell serumbiomarkör för bedömning av skelettmuskelskada. Den saknar dock vävnadsspecificitet²⁰ och sensitivitet²¹, vilket begränsar dess förmåga att bedöma omfattningen av läkemedelsinducerad muskelskada och indirekt rapportera omfattningen av muskelåterhämtning efter skada. Nya biomarkörer, inklusive fettsyrabindande protein 3 (FABP3), har nyligen visat relativt hög vävnadsspecificitet och känslighet i gnagarmodeller av skelettmuskelskada. FABP3 är en familj av bindande proteiner som främst uttrycks i hjärt- och skelettmuskelceller och är inblandade i fettsyrametabolism, transport och signalering²². Därför valde vi en kombination av två biomarkörer, CK och FABP3, för att bedöma omfattningen av notexin-inducerad skelettmuskelskada och återhämtning efter behandling.

Hos gnagare är musklerna grunda och hudområdet är litet, vilket också avgör att de olika parametrarna för massage hos gnagare inte kommer att vara desamma som hos människor, såsom vid djurterapi, massageterapeuten bör behandla dem med mindre kraft med Dings rullningsmetod, och kanske inte bidrar till denna teknik på grund av det skadade områdets lilla storlek, vilket i slutändan kan leda till en minskning av massagens effektivitet. Därför använde experimentet den rullande massageapparaten som gjorts internt, som överensstämmer med egenskaperna hos Dings rullmetod, för att ingripa och utvärdera den terapeutiska effekten av den notexin-inducerade skelettmuskelskademodellen hos råttor, vilket hjälper till att standardisera parametrarna för Tuina i experimentella djurstudier för att grundligt undersöka den molekylära verkningsmekanismen för Tuina, en traditionell kinesisk medicinbehandlingsmetod, på muskuloskeletala sjukdomar.

Protocol

Procedurer som involverar djur har godkänts av Institutional Care and Use Committee vid Hunan University of Chinese Medicine. 1. Montering av den rullande massageapparaten Välj en massageapparat som består av en gummirulle, gaffelhållare, fjäder, gränsbaffel, justeringsskena, skruv och akrylhandtag (Figur 1). Se till att gummirullen är 3 cm lång och 1,6 cm i diameter, fjädern är 3 cm lång och 0,9 cm i diameter, att gränsbaffe…

Representative Results

För att observera de morfologiska egenskaperna hos råttans skelettmuskulatur efter skada färgades gastrocnemiusmuskeln med hematoxylin och eosin, och de färgade bilderna lästes av med ett analysprogram enligt beskrivningen i protokollet för 8 råttor per grupp. Hos råttor med gastrocnemius muskelskada inducerad av notexin (NTX-gruppen) var många muskelceller brustna, atrofiska, nekrotiska och oregelbundet arrangerade. Det fanns också en hög infiltration av neutrofiler och lymfocyter runt det drabbade området (…

Discussion

Här beskrev vi ett protokoll för Tuina-behandling av skelettmuskelskada hos råtta och analyserade sedan graden av skelettmuskelskada efter behandling för att verifiera metodens effektivitet. Framför allt kan modeller för skelettmuskelskada på råtta, inklusive men inte begränsat till läkemedelsinduktion (notexin, bupivakain)16, trubbig kontusion ²⁶, kross 27 och ischemi reperfusion²⁸, användas med Tuina. Genom HE-fä…

Materials

1 mL syringe	JIANGXI FENGLIN	20220521
1.5 microtubes	Servicebio	EP-150X-J
15 mL centrifuge tube	Servicebio	EP-1501-J
30G needle	CONPUVON	220318
5 mL blood collection tube	Servicebio	QX0023
Acrylic handle	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Adjustment splint	CREROMEM	20220729
Cotton Swab	INOHV	22080215
Enzyme-labeled Instrument	Rayto	RT-6100
Ethanol	INOHV	211106
Fork holder	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Hair removal cream	Veet, France	LOTC190922002
Hematoxylin dyeing solution set	Wuhan Google Biotech	G1005
Imaging system	Nikon, Japan	Nikon DS-U3
IODOPHOR disfecting solution	Hale&Hearty	20221205
Light microscope	Nikon, Japan	Nikon Eclipse E100
Limit baffle	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodium	Merck KGaA	P3761
Rat creatine kinase (CK) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Rat fatty acid-binding protein 3 (FABP3) ELISA kit	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Rubber roller	Hebei Mgkui Chemical Technology Co.,Ltd	202207
Screw	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley rats	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Spring	Bingzhang Hardware	TH001
Surgical blade	Covetrus	#23
Weigh controller	Iyoys	HY-XSQ