Summary
الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) ، وهي نوع من الخلايا داخل الجمجمة تم تحديده مؤخرا ، لها وظائف غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا قابلا للتكرار لحصاد LLECs من الفئران وإنشاء مزارع أولية في المختبر . تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين الباحثين من الخوض في الوظائف الخلوية والآثار السريرية المحتملة ل LLECs.
Abstract
الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) هي مجموعة خلوية داخل الجمجمة تم اكتشافها مؤخرا مع توزيع فريد متميز بوضوح عن الخلايا البطانية اللمفاوية الطرفية. وظيفتها الخلوية وآثارها السريرية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وبالتالي ، فإن توافر إمدادات من LLECs أمر ضروري لإجراء البحوث الوظيفية في المختبر. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول قائم لحصاد وزراعة LLECs في المختبر.
نجحت هذه الدراسة في حصاد LLECs باستخدام بروتوكول متعدد الخطوات ، والذي تضمن طلاء القارورة بالفبرونيكتين ، وتشريح الليبتومينيات بمساعدة المجهر ، وهضم الليبتومينيات إنزيميا لإعداد تعليق أحادي الخلية ، مما يؤدي إلى توسع LLECs مع عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C) ، واختيار الخلايا الإيجابية لمستقبلات الهيالورونيك للأوعية اللمفاوية -1 (LYVE-1) من خلال فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). أدت هذه العملية في النهاية إلى إنشاء ثقافة أولية. تم تأكيد نقاء LLECs من خلال تلطيخ التألق المناعي وتحليل التدفق الخلوي ، مع مستوى نقاء يتجاوز 95٪. وقد أثبت هذا البروتوكول متعدد الخطوات قابلية التكرار والجدوى ، مما سيسهل إلى حد كبير استكشاف الوظيفة الخلوية والآثار السريرية ل LLECs.
Introduction
تشكل الخلايا البطانية اللمفاوية المكتشفة حديثا (LLECs) شبكة من الخلايا الفردية داخل leptomeninges ، وتظهر نمط توزيع متميز عند مقارنتها بالخلايا البطانية اللمفاوية المحيطية 1,2. لا تزال الوظائف الخلوية والآثار السريرية المرتبطة ب LLECs منطقة مجهولة إلى حد كبير. من أجل تمهيد الطريق للبحث الوظيفي على LLECs ، من الضروري إنشاء نموذج في المختبر لدراستهم. لذلك ، ابتكرت هذه الدراسة بروتوكولا شاملا للعزل والثقافة الأولية ل LLECs.
الفئران هي النموذج الحيواني المفضل بسبب ملاءمتها للتلاعب الجيني في أبحاث الأمراض. نجحت الدراسات السابقة في عزل الخلايا البطانية اللمفاوية من أنسجة الفئران المختلفة ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية3 ، والأنسجة المساريقية4 ، والأنسجة الجلدية5 ، وجمع اللمفاويات6 ، وأنسجة الرئة7. اعتمدت إجراءات العزل هذه بشكل أساسي على تقنيات مثل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) وفرز قياس التدفق الخلوي8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، أدت الجهود البحثية إلى إنشاء خطوط الخلايا العنكبوتية للفئران وخطوط الخلايا الشعرية اللمفاوية للفئران11,12. على الرغم من وجود تقنيات الاستزراع الخارجي ل leptomeninges13 ، إلا أن هناك حاجة ملحة لبروتوكول موحد لعزل وزراعة LLECs. وبالتالي ، نجحت هذه الدراسة في حصاد وزراعة LLECs من خلال فصل leptomeninges بدقة تحت إشراف المجهر وتعزيز توسع LLECs من خلال استخدام عامل نمو بطانة الأوعية الدموية C (VEGF-C). العلامة المميزة للخلايا البطانية اللمفاوية هي مستقبلات الهيالورونيك للأوعية اللمفاوية -1 (LYVE-1) 14. يقوم هذا البروتوكول متعدد الخطوات بعزل LLECs الإيجابية LYVE-1 بشكل انتقائي باستخدام MACS ويتحقق لاحقا من نقائها من خلال التحليل الخلوي للتدفق وتلطيخ الفلورسنت المناعي.
يمكن تلخيص الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول متعدد الخطوات على النحو التالي: طلاء القارورة ، تفكك leptomeninges ، الهضم الأنزيمي لل leptomeninges ، توسع الخلايا ، اختيار الخلايا المغناطيسية ، والثقافة اللاحقة ل LLECs. أخيرا ، يتم تأكيد نقاء LLECs المعزولة من خلال تحليل التدفق الخلوي وتلطيخ الفلورسنت المناعي. الهدف الشامل من هذه الدراسة هو تقديم بروتوكول قابل للتكرار ومتعدد الخطوات لعزل LLECs من leptomeninges الفئران وثقافتها اللاحقة في المختبر . هذا البروتوكول مهيأ لتسهيل التحقيقات بشكل كبير في الوظائف الخلوية والآثار السريرية ل LLECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
حصل هذا البحث على موافقة من لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة كونمينغ الطبية (kmmu20220945). التزمت جميع التجارب بالمبادئ التوجيهية المعمول بها لرعاية. تم حصاد الخلايا البطانية اللمفاوية Leptomeningeal (LLECs) من ذكور الفئران C57Bl / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ويزن ما بين 20-25 جم. تم شراء هذه الفئران من جامعة كونمينغ الطبية في كونمينغ ، الصين. تم إجراء الإجراء التجريبي بأكمله في ظل ظروف معقمة صارمة. يتم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.
1. إعداد الكواشف والأدوات
ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات التي تتضمن حلولا داخل خزانة مخاطر بيولوجية من الفئة الثانية.
- قم بإعداد محلول الغسيل عن طريق خلط محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين (P / S) (انظر جدول المواد). حافظ على هذا المخزن المؤقت باردا عند 4 درجات مئوية. من الضروري تحضيره طازجا في يوم الاستخدام وإزالة الغاز من المخزن المؤقت.
- تحضير الإنزيمات الهاضمة عن طريق الجمع بين 10 مل من PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) مع 2 مل من 0.25٪ تربسين ، 1 مل من 20 مجم / مل غراء ، و 200 ميكرولتر من 1 مجم / مل كولاجيناز I (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تأكد من استخدام حصص الأحجام المناسبة لمنع تكرار دورات التجميد والذوبان. قم بتخزين هذه القسوم في درجة حرارة -20 درجة مئوية. - قم بإعداد وسط الاستزراع من خلال استخدام مجموعة وسائط نمو الخلايا البطانية المتاحة تجاريا ، والتي تشمل VEGF-C (100 نانوغرام / مل) و 1٪ P / S (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد المخزن المؤقت للإيقاف عن طريق استكمال وسيط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بنسبة 10٪ FBS لإيقاف عملية الهضم.
- تحضير الأدوات الجراحية المعقمة: يجب أن تشتمل هذه الأدوات على مقص وملاقط مسننة وملاقط دقيقة.
2. طلاء قارورة
- قم بتغطية دورق T25 بمحلول فيبرونيكتين 100 ميكروغرام / مل (انظر جدول المواد) واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، قم بإزالة محلول الطلاء باستخدام ماصة.
- اغسل القارورة ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم قم بشفط PBS ، واترك قارورة T25 تجف في الهواء.
3. تفكك Leptomeninges
ملاحظة: استخدم دائما المخازن المؤقتة والمحاليل المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية.
- تخدير الفئران باستنشاق زائد من 4٪ إيزوفلوران ثم التضحية بها عن طريق قطع الرأس السريع باستخدام مقص تم تنظيفه مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- شق الجلد بعناية على طول خط الوسط ، بدءا من الفتحة الموجودة في الجزء الخلفي من الجمجمة وتمتد نحو المنطقة الأمامية.
- قم بإزالة الجمجمة بدقة ، وارفعها برفق بالمقص لتجنب إتلاف اللبتونينج ، مما يضمن الحصول على الدماغ بالكامل ، بما في ذلك leptomeninges.
- اغمر الدماغ كله في مخزن مؤقت للغسيل واغسله برفق لإزالة الدم السطحي.
- نقل الدماغ إلى طبق بتري معقم دون تقطيع ، واستخراج leptomeninges من سطح الدماغ باستخدام ملاقط دقيقة تحت المجهر.
- قطع الأنسجة leptomeninges إلى شظايا باستخدام مقص دقيق معقمة.
4. Leptomeninges الهضم الأنزيمي
- أضف 10 مل من مزيج الإنزيم (الخطوة 1.2) إلى الشظايا واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. حرك برفق لضمان فصل الشظايا عن قاع الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 10 مل من المخزن المؤقت للإيقاف (الخطوة 1.4) لوقف عملية الهضم.
- أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
- أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني بارد ، وقم بتمرير الخليط من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب معقم سعة 50 مل لتصفية أي كتل.
5. توسيع الخلية
- لوحة 1 × 10 5 خلايا لكل سم 2 في دورق T25 مغلف بالفبرونيكتين (الخطوة2) مع5 مل من وسط الاستزراع.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط للتخلص من الخلايا غير المرفقة.
- الحفاظ على الثقافة عن طريق استبدال 50٪ من الوسيط كل يومين. كرر هذه العملية مرتين أو ثلاث مرات.
6. اختيار الخلية المغناطيسية
ملاحظة: اعمل بسرعة ، وحافظ على برودة الخلية ، واستخدم المحاليل المبردة مسبقا لمنع وضع علامات غير محددة على الخلايا.
- تحضير الأدوات والكواشف: قم بتوصيل فاصل مغناطيسي بحامل فاصل مغناطيسي (انظر جدول المواد). قم بتوصيل عمود التحديد بالفاصل المغناطيسي ، وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر فوق عمود التحديد. ضع أنبوبا سعة 50 مل أسفل عمود التحديد لجمع التدفق.
- الهضم الأنزيمي: بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، قم بشفط الوسط وشطف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أوقف عملية الهضم عن طريق إضافة المخزن المؤقت للتوقف. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف.
- حضانة الأجسام المضادة: أعد تعليق 1 × 107 خلايا إجمالية في 100 ميكرولتر من PBS وأضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد LYVE-1 (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
- أدر الخلايا على 300 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. شطف الخلايا عن طريق إدخال 1 مل من PBS والطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. تماما إزالة طاف.
- وضع العلامات على الميكروبيدات: أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS وأضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
- أدر الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وصب المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بتطهير الخلايا باستخدام 1 مل من PBS من خلال الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أخيرا ، قم بإزالة المادة الطافية تماما.
- الاستبعاد السلبي المغناطيسي: أعد تعليق الخلايا في 4 مل من PBS. مرر الخلايا من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر للتخلص من الكتل. قم بإعداد عمود التحديد (انظر جدول المواد) عن طريق شطفه ب 3 مل من PBS ، ثم قم بتطبيق تعليق الخلية في عمود التحديد.
- قم بإجراء خطوات الغسيل باستخدام 3 مل من PBS واجمع الخلايا السالبة LYVE-1 في أنبوب سعة 50 مل يتم وضعه أسفل عمود التحديد للسماح لها بالمرور.
- الاختيار الإيجابي المغناطيسي: ماصة 6 مل من PBS في عمود التحديد. اغسل الخلايا ذات العلامات المغناطيسية على الفور عن طريق دفع المكبس بقوة في عمود التحديد للحصول على LLECs إيجابية LYVE-1.
ملاحظة: انتظر دائما حتى يصبح خزان عمود التحديد فارغا قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
7. ثقافة الشركات ذات المسؤولية المحدودة
- قم بطرد مركزي LLECs الإيجابية LYVE-1 عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
- لوحة 1 × 10 5 خلايا لكل سم2 في دورق T25 مغلف بالفبرونيكتين مع5 مل من وسط الثقافة.
- حافظ على الثقافة عن طريق استبدال 50٪ من الوسيط كل يوم. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ ، افصل الخلايا بنسبة 0.25٪ من التربسين وقم بمرور الخلية. استخدم الخلايا للتجارب اللاحقة بعد 2-3 ممرات.
8. تحليل التدفق الخلوي
ملاحظة: تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باتباع الإجراء15 الموضح سابقا.
- أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم أضف المخزن المؤقت لوقف عملية الهضم.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ونضح تماما طاف طفا. إعادة تعليق 1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من PBS.
- أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد LYVE-1. تخلط جيدا وتحتضن لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- أعد تعليق الخلايا بكمية مناسبة من المخزن المؤقت PBS للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي وبرنامج FlowJo (انظر جدول المواد).
9. تلطيخ المناعي
ملاحظة: تم إجراء تلطيخ المناعي باتباع الإجراء الموصوف سابقا16.
- اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. ثبت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من PFA واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- ضع المخزن المؤقت للكتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت للكتلة من أغطية الغطاء.
- أضف الجسم المضاد LYVE-1 في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى الخلايا واحتضانه في الظلام. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
- أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ إلى الخلايا واحتضانها في الظلام. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.
- كاونتر ستاين مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI). الخلايا جاهزة الآن للفحص المجهري المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الخطوات قابل للتكرار لحصاد الخلايا البطانية اللمفاوية (LLECs) من الفئران وبالتالي إنشاء ثقافتها الأولية في المختبر. تتضمن الخطوات الرئيسية تحضير القارورة وطلاء الفبرونيكتين ، وتفكك الليبتومينينج ، والحصول على تعليق أحادي الخلية من خلال الهضم الأنزيمي ، وتحفيز توسع LLECs باستخدام VEGF-C. ثم يتم عزل LLECs الإيجابية LYVE-1 بشكل انتقائي باستخدام فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS). وأخيرا، يتم إجراء تحليل التلوين المناعي والتدفق الخلوي لتقييم نقاء LLECs، مع نتائج مقايسة MTT التي تظهر معدلات نمو قوية ل LLECs (الشكل التكميلي 1). يتم توضيح الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول متعدد الإجراءات في المخطط الانسيابي ، حيث تستغرق العملية بأكملها حوالي 2-3 أسابيع (الشكل 1).
لحصاد LLECs ، من الضروري فصل leptomeninges وتعزيز توسع LLECs مع الحفاظ على صلاحية الخلية من خلال التقنيات الجراحية الفعالة والحفاظ على بيئة باردة (الشكل 2A-E). بعد الحصول على الدماغ كله جنبا إلى جنب مع leptomeninges في ظل ظروف معقمة ، يتم إجراء خطوة غسل تدفق لطيف لإزالة خلايا الدم الحمراء (الشكل 2F). بعد ذلك ، يتم استخراج leptomeninges بعناية من سطح الدماغ تحت المجهر (الشكل 2G). تتكون هذه اللبتومينات بشكل أساسي من ألياف الكولاجين ، لذلك يتم تجزئتها لتسريع عملية الهضم الأنزيمي (الشكل 2H). بعد ذلك ، يتم إجراء الهضم الأنزيمي لهذه الشظايا ، ويتم ترشيح أي كتل متبقية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر للقضاء على مجموعات أكبر من ألياف الكولاجين (الشكل 2I). أخيرا ، يتم طلاء الخلايا في دورق T25 المطلي بالفبرونيكتين ، ويضاف VEGF-C للحث على التوسع (الشكل 2J). بعد 24 ساعة ، تتم إزالة وسط الثقافة للتخلص من الخلايا غير المرفقة. تسهل هذه الخطوات حصاد الخلايا من leptomeninges وتعزز التوسع ، وهو أمر بالغ الأهمية للحصول على ما يكفي من LLECs الإيجابية LYVE-1 في وقت لاحق من العملية.
بينما يحفز VEGF-C توسع LLEC ، لا يزال بإمكان المجموعات الخلوية غير المتجانسة النمو معا. لعزل LLECs إيجابية LYVE-1 النقية ، يتم استخدام MACS لأن LYVE-1 هو علامة معترف بها للخلايا البطانية اللمفاوية. يتم تقييم نقاء LLECs من خلال قياس التدفق الخلوي ، حيث تشير النتائج إلى أن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية LYVE-1 في الممر 2 لا تختلف اختلافا كبيرا عن الممر 3 بعد MACS ، مما يدل على نقاء أكبر من 95٪ (الشكل 3A). لمزيد من التحقق من خصوصية LYVE-1-positive LLECs ، تم استخدام ثلاثة علامات إضافية للخلايا البطانية اللمفاوية - بودوبلانين (PDPN) ، ومستقبلات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية -3 (VEGFR-3) ، و homeobox1 المرتبط ب Prospero (PROX1) لتحديد17،18،19. أكد تلطيخ التألق المناعي أن LYVE-1 ملطخ بشكل مشترك مع هذه العلامات الثلاثة (الشكل 3 ب). علاوة على ذلك ، تم تحديد هوية LLECs في شرائح الدماغ في ظل الظروف الفسيولوجية ، مما يدل على تلطيخ مشترك ل LYVE-1 مع PROX1 و VEGFR-3 و PDPN (الشكل التكميلي 2A). لم تعبر الخلايا الإيجابية LYVE-1 عن F4 / 80 وبيتا عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGFR-β) ، مما يميز بشكل فعال LLECs عن الضامة والخلايا الليفية (الشكل التكميلي 2B). باختصار ، يسمح هذا البروتوكول بحصاد LLECs عالية النقاء القادرة على الزراعة في المختبر.
تظهر خلايا Leptomeningeal قبل MACS عدم تجانس ، تختلف عن مستعمرات الخلايا البطانية اللمفاوية. يتراوح مورفولوجيتها من كرات مستديرة مفردة إلى أشكال ألياف مدمجة (الشكل 4A-D). ومع ذلك ، بعد MACS ، تظهر LLECs ميزات نموذجية تشبه المغزل والحصى على شكل بطانة (الشكل 4E-H). بناء على هذه النتائج ، يتم حصاد LLECs بشكل فعال من خلال هذا البروتوكول متعدد الإجراءات والحفاظ عليها في حالة نمو صحية.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول متعدد الإجراءات. يوضح هذا المخطط الانسيابي البروتوكول متعدد الإجراءات لحصاد وزراعة الشركات ذات المسؤولية المنخفضة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حصاد خلايا الليبتومينينج . (أ) تحضير الأدوات الجراحية المعقمة. (ب) تم تخدير الفئران عن طريق استنشاق 4٪ إيزوفلوران ثم تنظيفها بعد ذلك باستخدام 70٪ من الإيثانول بعد القتل الرحيم. ج: قطع رأس الفئران وشق دقيق في خط الوسط للجلد، بدءا من الجزء الخلفي من الجمجمة باتجاه المنطقة الأمامية. د: الإزالة الدقيقة للجمجمة للحفاظ على سلامة اللبتونيات. ه: استرجاع الدماغ بأكمله الذي يحتوي على اللبتونينغ. (و) غسل الدماغ كله في محلول عازل مع احمرار لطيف لإزالة الدم السطحي. (ز) تشريح اللبتونات من سطح الدماغ باستخدام ملاقط دقيقة. (ح) تقطيع الليبتومينات إلى شظايا بمقص دقيق معقم، تليها إضافة 10 مل من مزيج الإنزيم والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. (ط) إعادة تعليق الحبيبات في 10 مل من PBS وترشيح الكتل من خلال مصفاة 70 ميكرومتر. (ي) طلاء الخلايا في دورق T25 المطلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم نقاء LLEC بعد MACS. (أ) الرسوم البيانية التمثيلية من تحليل التدفق الخلوي الذي يوضح التعبير عن الخلايا الموجبة LYVE-1 في المقطعين 2 و 3 بعد MACS. تتجاوز النسبة المئوية للخلايا الإيجابية LYVE-1 95٪ بعد MACS. تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة (Mean ± SEM). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. (B) صورة تألق مناعي تمثيلية تظهر تلطيخا مشتركا ل LYVE-1 مع PDPN و VEGFR-3 و PROX1. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: خواص نمو الخلايا البريمية والخلايا LLECs. (أ) مورفولوجيا الخلايا البريمية الملتقطة في صور تمثيلية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B-D) صور تمثيلية تصور مورفولوجيا الخلايا leptomeningeal في اليوم 1 واليوم 2 واليوم 3 قبل MACS. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (ه) مورفولوجيا LLECs الملتقطة في صور تمثيلية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (F-H) صور تمثيلية توضح مورفولوجيا LLECs في اليوم 1 واليوم 2 واليوم 3 بعد MACS. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: معدل نمو الشركات ذات الدخل المنخفض و SVEC4-10. تظهر نتائج مقايسة MTT انخفاضا كبيرا في معدل نمو LLECs في المقطع 1 مقارنة بمجموعة SVEC4-10. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعتي LLECs للمرور 2 والمقطع 3 مقارنة بمجموعة SVEC4-10. تمثل البيانات نتائج من ست تجارب مستقلة (المتوسط ± SEM). تشير أشرطة الخطأ إلى التسويق عبر محرك البحث. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: توصيف وتمييز LLECs في شرائح الدماغ. (أ) صورة تألق مناعي تمثيلية توضح التلوين المشترك ل LYVE-1 مع PROX1 و VEGFR-3 و PDPN في شرائح الدماغ في ظل الظروف الفسيولوجية. أشرطة المقياس = 2 ميكرومتر. (B) صورة تألق مناعي تمثيلية توضح أن LYVE-1 لا يتعايش مع F4 / 80 و PDGFR-β في شرائح الدماغ في ظل الظروف الفسيولوجية. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: نمو LLECs تحت تحفيز VEGF-C. (أ) صور تمثيلية ل LLECs تحت 1 نانوغرام / مل تحفيز VEGF-C. (ب) صور تمثيلية ل LLECs تحت 100 نانوغرام / مل تحفيز VEGF-C. (ج) صور تمثيلية ل LLECs تحت 500 نانوغرام / مل تحفيز VEGF-C. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: التعبير عن CD31 و PDPN و VEGFR-3 بعد الحصاد. (أ) تظهر الرسوم البيانية التمثيلية من تحليل قياس التدفق الخلوي أن الخلايا الموجبة CD31 أقل من 5٪. (ب) تشير الرسوم البيانية التمثيلية من تحليل التدفق الخلوي إلى أن الخلايا الموجبة ل PDPN تتجاوز 95٪. (ج) توضح الرسوم البيانية التمثيلية من تحليل التدفق الخلوي أن الخلايا الإيجابية VEGFR-3 تتجاوز 95٪. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 5: مورفولوجيا LLECs والتمييز عن CD31. (أ) صور تمثيلية لمورفولوجيا LLECs التي كشف عنها تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (B) توضح صور التألق المناعي التمثيلي أن LYVE-1 و PDPN لا يتلطخان مع CD31. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 6: معدل انتشار الاختلالات غير الساحلية. وتظهر النتائج التمثيلية من اختبار CCK-8 انخفاضا كبيرا في معدل انتشار المنخفضات منخفضة الدخل في المقطع 1 والمقطع 6 مقارنة بالمقطعين 2 و5 على التوالي. تمثل البيانات نتائج من ست تجارب مستقلة (المتوسط ± SEM). تشير أشرطة الخطأ إلى التسويق عبر محرك البحث. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لم يتم الإبلاغ من قبل عن البروتوكول الحالي لحصاد واستزراع LLECs في المختبر . تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الإجراءات قابل للتكرار لحصاد وزراعة LLECs من leptomeninges الفئران.
في حين أن هذا البروتوكول متعدد الإجراءات قابل للتكرار ، إلا أن هناك العديد من الاعتبارات الرئيسية. على سبيل المثال ، تعمل قوارير T25 المغلفة بالفبرونيكتين على تعزيز التصاق LLECs وتعمل من خلال القضاء على الخلايا غير الملتصقة ، وبالتالي ضمان وجود سكان خلويين أكثر تجانسا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المدة الزمنية ودرجة الحرارة أثناء العمليات الجراحية لفصل leptomeninges هي عوامل حاسمة تؤثر على بقاء الخلية. لذلك ، من الضروري الحفاظ على مدة زمنية في غضون 1 ساعة والحفاظ على المخزن المؤقت باردا بدرجة كافية. نقطة حرجة أخرى تتعلق بوجود خلايا الدم الحمراء في leptomeninges ، والتي قد يؤدي إطلاق الهيموغلوبين منها إلى الإضرار ب LLECs. للتخفيف من ذلك ، من الضروري التنظيف والغسل بلطف لإزالة خلايا الدم الحمراء ، ومنع آثارها السامة للخلايا. أخيرا ، تتطلب LLECs التحفيز باستخدام VEGF-C20 ، خاصة بتركيز 100 نانوغرام / مل. تحت هذا التحفيز ، تظهر LLECs مورفولوجيا مميزة تشبه البطانة بدلا من تشكيل الأنابيب (الشكل التكميلي 3A-C). وبالتالي ، استخدمت هذه الدراسة وسط استزراع يحتوي على 100 نانوغرام / مل VEGF-C للحث على التوسع والحفاظ على التجانس في المجموعات الخلوية.
يأتي البروتوكول متعدد الإجراءات الموضح هنا مع خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها وبعض القيود. أولا ، يستغرق هذا البروتوكول 2-3 أسابيع حتى يكتمل ، مما يجعله غير عملي للتكرار المتكرر. ثانيا ، قد تؤدي الإجراءات الجراحية والأنزيمية إلى وجود خلايا ميتة لا يتم التخلص منها قبل الطلاء ، مما قد يؤثر على ثقافة الخلايا. وسيتم استكشاف هذه الإمكانية في عمليات تنفيذ البروتوكول في المستقبل. ثالثا ، في حين أن نقاء LLECs المحصودة (الخلايا الإيجابية VEGFR-3 و PDPN) يتجاوز 95٪ ، تستمر بعض مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، بما في ذلك الخلايا الإيجابية CD31 ، والتي تشكل أقل من 5٪ (الشكل التكميلي 4A-C). هذا تحد شائع في ثقافة الخلايا الأولية. توضح الصور عالية الدقة من تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين أن LLECs تعرض أشكالا مميزة تشبه البطانة ولكنها لا تعبر عن CD31 (الشكل التكميلي 5A ، B). وأخيرا، تشير نتائج فحص CCK-8 إلى انخفاض كبير في معدل الانتشار في المنخفضات منخفضة الدخل عند الممر 1 و6 مقارنة بالمرور 2 و5 على التوالي (الشكل التكميلي 6). قد يؤدي المقطع 1 إلى تلف LLECs بسبب علاج الأجسام المضادة والإجهاد البدني أثناء الفرز ، بينما يظهر المقطع 6 انخفاضا في الانتشار مع زيادة عدد الممرات. لذلك ، فإن الخلايا اللاحقة بعد المرور 6 غير مناسبة للتجارب ذات الصلة. بالنظر إلى توزيع الخلايا الليفية في السحايا21 ، قد يحتوي ما يقرب من 5 ٪ من الخلايا الملوثة على الخلايا الليفية. لمعالجة هذا ، يمكن استخدام إضافة فرز الخلايا الوراثية والخلايا المغناطيسية المناعية لإزالة الخلايا الليفية الملوثة22,23. ستساعد مراقبة معدل تلوث الخلايا الليفية في كل ممر من LLECs في القضاء على تأثير الخلايا الليفية على نموLLECs 24. وبالنظر إلى عدم التجانس بين الفئران والبشر، ينبغي متابعة حصاد وزراعة الحشرات البشرية الأولية منخفضة الأثر للتطبيقات السريرية المحتملة في البحوث المستقبلية.
باختصار ، لا يوجد حاليا بروتوكول ثابت لحصاد وزراعة LLECs في المختبر. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا متعدد الإجراءات قابل للتكرار لحصاد LLECs من الفئران leptomeninges ومن ثم إنشاء ثقافتها الأولية في المختبر. سيسهل هذا العمل مزيدا من استكشاف الوظائف الخلوية والتطبيقات السريرية المحتملة ل LLECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81960226 ، 81760223) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة يونان (202001AS070045 ، 202301AY070001-011) ، ومؤسسة البحث العلمي التابعة لوزارة التعليم بمقاطعة يوننان (2023Y0784).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. Neuroscience. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
