Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Summary

Os bacteriófagos (fagos), vírus que infectam bactérias, são um componente integral do microbioma intestinal. Embora esses habitantes simbióticos impulsionem a aptidão bacteriana e a dinâmica populacional, pouco se entende sobre como eles afetam a homeostase intestinal e a doença. Este protocolo estuda fagos isolados de T4 dentro de um modelo murino, adaptável a outros pares fago-bactérias.

Abstract

Bacteriófagos (fagos) são vírus que infectam bactérias com especificidade em nível de espécie e cepa e são as entidades biológicas mais abundantes em todos os ecossistemas conhecidos. Dentro de comunidades bacterianas, como as encontradas na microbiota intestinal, os fagos estão implicados na regulação da dinâmica populacional da microbiota e na condução da evolução bacteriana. Tem havido um interesse renovado na pesquisa de fagos na última década, em parte devido às capacidades de matar os fagos líticos específicos do hospedeiro, que oferecem uma ferramenta promissora para combater a crescente ameaça de bactérias resistentes a antimicrobianos. Além disso, estudos recentes demonstrando que os fagos aderem ao muco intestinal sugerem que eles podem ter um papel protetor na prevenção da invasão bacteriana no epitélio subjacente. É importante ressaltar que, assim como os microbiomas bacterianos, os fageomas interrompidos têm sido associados a desfechos piorados em doenças como a doença inflamatória intestinal. Estudos anteriores demonstraram que os fagos podem modular o microbioma de animais e humanos por meio de transplantes de filtrados fecais, beneficiando a saúde do hospedeiro. Com essa recente onda de pesquisas, surge a necessidade de estabelecer e padronizar protocolos para o estudo de fagos no contexto do microbioma intestinal. Este protocolo fornece um conjunto de procedimentos para estudar fagos isolados de T4 e seu hospedeiro bacteriano, Escherichia coli, no contexto do trato gastrointestinal murino. Os métodos descritos aqui descrevem como começar a partir de um lisado de fago, administrá-lo a camundongos e avaliar os efeitos sobre os níveis de hospedeiro bacteriano e fago. Este protocolo pode ser modificado e aplicado a outros pares fago-bactéria e fornece um ponto de partida para o estudo da dinâmica hospedeiro-fago in vivo.

Introduction

Bacteriófagos, ou fagos, são vírus que infectam e matam bactérias com especificidade em nível de espécie e cepa¹. Os fagos desempenham papéis importantes dentro de comunidades bacterianas complexas, como a microbiota intestinal, onde têm sido implicados na regulação da dinâmica populacional e na condução da aptidão bacteriana². Ao longo da última década, tem havido um interesse renovado na pesquisa de fagos devido ao aumento de patógenos resistentes a antimicrobianos3 e ao potencial da fagoterapia como estratégia alternativa de tratamento. Nos últimos anos, coquetéis de fagos líticos têm sido utilizados por via intravenosa com algum sucesso em infecções sépticas bacterianas graves e resistentes a antibióticos em humanos ^3,4. A fagoterapia oral também tem sido proposta como uma alternativa potencial aos antibióticos para tratar infecções intestinais e inflamação. Além disso, fagos têm sido implicados no sucesso dos transplantes de filtrado fecal (FFT), que são preparações da microbiota fecal que foram filtradas para remover bactérias, no tratamento da infecção recorrente por Clostridioides difficile (rCDI)^5,6, distúrbios inflamatórios intestinais (DII)^7,8 e enterocolite necrosante em suínos ^prematuros9. Diante desses resultados, é importante considerar interações tanto entre fagos e a microbiota intestinal, quanto entre fagos e mamíferos hospedeiros, pois a adição de novos fagos a uma comunidade preexistente pode ter efeitos indiretos sobre a comunidade como um todo, e não apenas sobre suas bactérias-alvo ^2,10.

O estudo das interações dos fagos com suas bactérias-alvo in vitro tem se mostrado útil para a compreensão dos mecanismos e impactos das interações entre fagos e bactérias no intestino. Nesse contexto, demonstrou-se que fagos T4 específicos de Escherichia coli da ordem Caudovirales necessitam de domínios semelhantes a imunoglobulinas (Ig) localizados dentro de proteínas altamente antigênicas do capsídeo externo (Hoc) na superfície do vírion para aderir ao muco intestinal¹¹. Além disso, ensaios transwell mostraram que fagos T4 são capazes de interagir com culturas de células epiteliais e translocar através das camadas celulares por macropinocitose^12,13. Estes resultados suportam a hipótese de que os fagos podem interagir com seus hospedeiros metazoários, mesmo sendo incapazes de infectar células eucarióticas. Esses modelos, embora úteis, carecem de toda a gama de interações complexas que ocorrem em um ecossistema intestinal que são necessárias para uma exploração abrangente da interação tripartite entre fagos, bactérias e o hospedeiro metazoário.

Modelos de camundongos são uma ferramenta importante para a investigação de fagos em ambientes complexos. Uma aplicação desejável da administração de fagos é como uma estratégia alternativa para tratar infecções resistentes a antimicrobianos ou patobiontes associados a doenças inflamatórias crônicas, incluindo DII. No entanto, a literatura emergente sugere que o comportamento dos fagos in vitro não representa completamente as funções in vivo. Buttimer et ^al.14 demonstraram que um coquetel de fagos foi capaz de esgotar as bactérias-alvo em um consórcio simplificado de microbiota humana in vitro, mas não pôde ser replicado in vivo em camundongos gnotobióticos colonizados com o mesmo consórcio bactéria-fago. Além disso, em um microbioma convencional de camundongos, o fago T7 levou à depleção seletiva de suas bactérias intestinais alvo, embora a recuperação gradual tenha sido observada ao longo do tempo, indicando resistência evoluída¹⁵. Outros estudos demonstraram a coexistência de fagos administrados por via oral e suas cepas bacterianas alvo in vivo ^2,16. De fato, além da coexistência de fago/bactéria, a administração de fagos levou a mudanças generalizadas na composição e função geral da comunidade da microbiota ^2,16. Isso é relevante em situações de doença, pois vários estudos encontraram associações entre o aumento da abundância relativa de caudovirais e DII ^7,8,17 que foram independentes de mudanças na abundância bacteriana⁷. Ainda não se sabe se isso é um fator determinante ou consequência da patogênese da doença.

O foco histórico da investigação de fagos tem sido em torno da relação entre um fago e sua bactéria-alvo. No entanto, também é importante considerar potenciais interações entre o fago e a mucosa, o epitélio e o sistema imune do hospedeiro metazoário. Todas essas interações desempenham um papel importante na resposta global à infecção intestinal por fago. Para demonstrar isso, fagos têm sido estudados utilizando camundongos germ-free (GF) para elucidar seu impacto no sistema imune sem interferência da microbiota⁸. Nesse sistema, os ácidos nucléicos dos fagos foram detectados por receptores do tipo Toll (TLRs) localizados dentro de endossomos de células imunes fagocíticas (macrófagos e células dendríticas). Isso ativou a sinalização a jusante e estimulou a produção dependente de células T de interferon (IFN)-^{γ 8} ou IFNs tipo I¹⁸. Além disso, Fluckiger et ^al.19 implicaram células T CD8⁺ de memória no reconhecimento de antígenos codificados por fagos (prófagos), o que resultou em reatividade cruzada de células T com antígenos tumorais, resultando em redução da carga tumoral. Finalmente, a produção de anticorpos fago-específicos foi documentada em estudos em camundongos onde fagos foram entregues a modelos animais de forma contínua através da água potável ^8,20, ou por gavagem oral repetida ao longo de vários meses²⁰, demonstrando a capacidade das proteínas dos fagos em promover respostas imunes humais. Embora esses modos de inoculação de fagos permitam o priming ótimo e contínuo do sistema imunológico, eles podem não representar as interações naturais entre fagos e o ambiente intestinal, nem a cinética da terapia fagológica aplicada por via oral. Até o momento, um número limitado de estudos examinou as interações do fago com uma única espécie bacteriana em modelos de camundongos monocolonizados²¹. No entanto, camundongos monocolonizados mostraram-se críticos para decifrar os efeitos micróbio-específicos de espécies individuais sobre o trato gastrointestinal (GI) e o desenvolvimento imunológico 22,23,24, e ainda podem ser úteis na compreensão das interações tripartites entre fagos, suas bactérias-alvo e o hospedeiro metazoário.

De forma empolgante, ainda há muito a aprender sobre as interações entre fagos intestinais e bactérias comensais intestinais, bem como as interações que ocorrem entre o hospedeiro metazoário e os fagos que residem nele. Este protocolo fornece um conjunto de procedimentos para estudar o fago isolado de T4 e sua contraparte bacteriana, E. coli (K-12, BW25113), usando um modelo gnotobiótico em camundongos. Esses procedimentos padronizados também fornecem uma base para otimizar outras díades de fago/bactéria, adaptando os parâmetros de crescimento aos pares de interesse. Os métodos aqui descritos descrevem: (1) Preparação de fagos T4 e lisados veiculares para gavagem oral de camundongos; (2) Administração oral de fago T4 a camundongos monocolonizados de E. coli gnotobióticos; (3) Monitoramento dos níveis de fagos T4 em fezes e tecidos de camundongos ao longo do tempo.

Para os resultados representativos aqui apresentados, lisados purificados de fagos T4 foram propagados a partir de estoques de bancos de fagos mantidos pelo Rohwer Lab. O método Phage-on-Tap para propagação de fago T4 foi adaptado²⁵, conforme referenciado neste protocolo. O método produz altos títulos e baixos estoques de fago com endotoxina em três dias. Utilizando essa abordagem, 10 mL de ≥ 10¹⁰ unidades formadoras de placa (pfu)/mL de fago T4 com < 0,5 unidades de endotoxina (EU)/mL foram rotineiramente coletados. Os níveis recomendados de endotoxinas para administração oral ou intravenosa em ratinhos são ≤ 20 EU/ml e ≤ 5 EU/kg/h (ou 0,1 EU administrados durante 1 h para um ratinho de 20 g), respetivamente, tornando este um método adequado de preparação de fagos para inoculação in vivo . Todos os estoques de fago foram armazenados a 4 °C em tampão fagogênico salino magnésio (SM) (receita fornecida na etapa 1.1.5.1). E. coli foi cultivada em meio LB. Para vários pares de fagos-bactérias, diversos meios de cultura e condições de crescimento podem ser adaptados a partir deste protocolo. Os fagos também podem ser obtidos do ambiente, tais como águas residuais, água marinha, solo e conteúdo intestinal, e podem ser isolados e purificados conforme Sambrook e Russell²⁶ antes da preparação, usando as condições apropriadas de crescimento e propagação para cada par fago-hospedeiro de interesse²⁵. Alternativamente, os fagos podem ser obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) ou de bancos de fagos.

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidados com Animais da UBC e protocolos aprovados pelo Comitê de Biossegurança (A23-0113, B19-0038). Camundongos foram alojados na Universidade da Colúmbia Britânica sob condições livres de patógenos no Center for Disease Modelling. Camundongos C57BL/6 foram criados dentro da instalação em um isolador de filme flexível estéril, fornecido com dieta estéril para camundongos, água, cama e material de nidificação. Os camundongos foram mantidos em um ciclo dia/noite de 12 h. Camundongos experimentais, machos e fêmeas, foram pareados por idade dentro de cada experimento, variando entre 6 e 12 semanas de idade e pesando 15-30 g para todos os experimentos.

1. Preparação de lisados de fago e veículo para gavagem oral em camundongos

1. Purificação de fagos e geração de estoque
   NOTA: Neste estudo, os fagos T4 são cultivados e titulados por plaqueamento em um gramado de bactérias usando o método de camada única de ágar, descrito abaixo. O método da dupla camada de ágar já foi descrito anteriormente^25,27e também pode ser usado com eficácia semelhante. O método de camada única de ágar foi selecionado para este protocolo por proporcionar melhor visibilidade da placa²⁸.
   1. Cultivar E. coli em 5 mL de LB estéril em tubos estéreis de poliestireno ou de cultura de vidro (com tampas). Incubar os tubos a 37 °C com agitação a 200 rpm durante a noite, até atingir a fase estacionária.
   2. Preparar ágar macio em um frasco de meio de vidro autoclavando LB com 0,5% de ágar e resfriando a 50 °C ou menos (permanecendo um líquido) antes da suplementação. Preparar ágar macio suficiente para 15 mL por placa.
   3. Suplemente ágar mole com MgSO₄ e CaCl₂ até uma concentração final de 1 mM para cada um. Adicionar 100 μL de cultura de E. coli durante a noite para cada 3 mL de ágar mole. Mexa suavemente usando uma barra de agitação magnética para homogeneizar os suplementos e cultura no ágar macio.
      NOTA: A consistência no volume e densidade de E. coli que é adicionada à preparação de ágar mole é crítica (descrita na seção de resultados representativos).
   4. Adicionar 15 mL de ágar mole + E. coli por placa de Petri (15 cm de diâmetro) usando uma pipeta sorológica. Deixe as placas ajustadas à temperatura ambiente para uso no mesmo dia.
      OBS: As placas serão ajustadas em aproximadamente 20 min com as tampas abertas. O ágar permanecerá macio, mas não mudará quando as placas forem invertidas.
   5. Preparar 8-10 diluições seriadas do fago T4 da fonte em factores de 10 diluindo em tampão SM. Colocar 5 μL de cada diluição em placas. Deixe as manchas secarem, invertam e incubem as placas a 37 °C durante a noite.
      1. Para preparar o tampão de fago de magnésio salino (SM), em 1 L de H₂O deionizado, dissolver 100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄·7H₂O e 50 mM Tris-HCl (pH 7,4). Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente.
         NOTA: No dia seguinte, E. coli deveria ter crescido em um gramado em todo o ágar LB macio. Placas, ou áreas limpas de crescimento visíveis no gramado de E. coli , aparecerão onde ocorreu a morte de hospedeiros infectados por E. coli . Cada placa representa uma unidade formadora de placa (pfu).
   6. Escolha uma única placa da placa de ágar macia empurrando uma ponta de pipeta estéril para o centro da placa, criando um plugue de ágar no final da ponta. Ressuspenda o plugue da placa em 1 mL de tampão SM em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Vórtice o tubo à velocidade máxima durante 1 min para misturar.
   7. Centrifugar o tubo a 4000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente para remover quaisquer detritos do lisado. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
   8. Para propagar o fago isolado, repita os passos 1.1.1-1.1.3. Adicionar 100 μL do fago isolado a uma alíquota de 15 mL de ágar mole contendo E. coli em um tubo cônico. Inverta o tubo três vezes para misturar e despeje o ágar em uma placa de Petri.
   9. Deixe as placas secarem antes de inverter e incubar durante a noite a 37 °C. Preparar uma placa de controle de gramado sem fago para confirmar a viabilidade de E. coli .
      NOTA: Após a incubação durante a noite, a placa de controle deve ter um gramado de E.coli , enquanto a placa contendo fago deve ser completamente lisada.
   10. Para extrair o fago da placa, adicione 5 mL de tampão SM à superfície da placa desobstruída por fagos e agite a 70 rpm em um balancim por 15 minutos à temperatura ambiente.
   11. Recolher o tampão da placa num tubo de centrífuga cónica de 50 ml e centrifugar a 4000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente para pelar quaisquer detritos da placa de ágar.
   12. Recolher o lisado de fago T4 num tubo novo e armazenar a 4 °C até à titulação e propagação.
       NOTA: Os fagos T4 são estáveis por mais de 10 anos²⁵; no entanto, a estabilidade dependerá do tipo de fago e das condições de armazenamento. O título de fago também varia com o tempo de armazenamento. Os fagos são sensíveis ao congelamento. Portanto, recomenda-se a criopreservação em nitrogênio líquido e evitar ciclos de congelamento-descongelamento, pois isso pode danificar os fagos, reduzindo o título de fago²⁵.
   13. Titular o lisado de estoque de fago T4 para determinar a concentração em pfu/mL, conforme descrito anteriormente 25,29,30. Um estoque de fago T4 de alto título conterá 10^{a 8} pfu/mL ou mais.
2. Preparação de lisados fagológicos experimentais
   1. Cultura de E. coli em 5 mL de LB em tubos estéreis de poliestireno ou vidro (com tampas). Incubar os tubos durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm, até atingir a fase estacionária.
   2. Subcultivar a cultura noturna de E. coli 1:50 em meio LB de 100 mL em frasco cônico de vidro. Incubar a 37 °C com agitação a 200 rpm até que as bactérias tenham atingido a fase exponencial precoce a média (aprox. 1,5 h).
      NOTA: Uma curva de crescimento inicial pode ser realizada para determinar a densidade óptica na faixa de 600 nm (OD₆₀₀) na qual a cultura bacteriana está em fase exponencial. A cultura em tubo cônico de vidro é sugerida, pois evidências recentes descobriram que os fagos são capazes de aderir a plásticos como o polipropileno³¹.
   3. Adicionar 100 μL do estoque de fago T4 de alto título da etapa 1.1 na subcultura de E. coli e incubar a 37 °C com agitação por 3 h, ou até que o novo lisado não esteja mais turvo. Recolher o lisado de fago T4 em tubos cónicos de 50 ml e proceder directamente às etapas de limpeza ou, se necessário, conservar a 4 °C até ao dia seguinte.
      NOTA: Um tamanho de explosão de fago maior (indicando um maior número médio de viriões libertados por ciclo de replicação) requer um período de incubação mais longo para a subcultura bacteriana no passo 1.2.2. Isso proporciona um aumento da densidade de bactérias antes de aumentar os estoques de fagos.
   4. Centrifugar lisados a 4000 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente para peletizar quaisquer bactérias e detritos celulares remanescentes. Filtrar-esterilizar o sobrenadante resultante usando um filtro de nylon de 0,22 μm e transferir o filtrado para novos tubos de centrífuga cônica de 50 mL.
   5. Adicionar 0,1 volumes de clorofórmio a cada volume de lisado de fago T4 filtrado para matar as bactérias restantes e impedir o crescimento bacteriano. Vórtice brevemente para misturar e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
      NOTA: Os fagos envelopados com lipídios são sensíveis ao clorofórmio, o que pode reduzir o título de fago²⁵. Ignore esta etapa, se necessário.
      CUIDADO: O clorofórmio é um solvente orgânico tóxico que é perigoso quando inalado, ingerido ou absorvido através da pele. Use um exaustor e equipamento de proteção individual (EPI) apropriado ao trabalhar com clorofórmio. Use vidro em vez de pipetas sorológicas de poliestireno ao trabalhar com clorofórmio, pois não é compatível com a maioria dos plásticos. O clorofórmio pode ser colocado em tubos de centrífuga cónica de polipropileno para os passos 1.2.5-1.2.6, mas não deve ser armazenado a longo prazo em tubos de plástico.
   6. Centrifugar o lisado a 4000 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente para separar o clorofórmio do lisado. Use uma pipeta sorológica para transferir cuidadosamente a camada de lisado superior para um novo tubo cônico de 50 mL sem perturbar a camada de clorofórmio subjacente. Eliminar os resíduos de clorofórmio no recipiente adequado para resíduos líquidos perigosos. Conservar lisados a 4 °C até à concentração e troca de tampão no dia seguinte.
   7. Concentrar os lisados de fagos num dispositivo de filtro centrífugo de 100 kDa (ver Tabela de Materiais) adicionando 13 ml de lisado de fago ao reservatório superior do dispositivo e centrifugando a 4000 x g durante 5 minutos, ou até que a maior parte do lisado tenha passado através do filtro para o reservatório inferior.
      NOTA: Objetivo de ter aproximadamente 2 mL de lisado no final do tempo de spin. À medida que a concentração de fagos aumenta no filtro com a adição de lisado, os tempos de rotação provavelmente aumentarão. Os dispositivos de filtragem centrífuga têm um ponto morto físico para evitar que fiquem secos³². Não deixe a membrana do filtro secar se o uso continuado for planejado (ou seja, removendo todo o líquido do reservatório superior). Os tempos de rotação podem variar de acordo com o tipo de fago e o título.
   8. Usando uma pipeta P200 ou P1000, pipetar suavemente os ~2 mL restantes de lisado para cima e para baixo dentro do reservatório superior para desobstruir a membrana do filtro após cada giro. Descarte o filtrado do reservatório inferior em um recipiente de resíduos, deixando o fago concentrado no reservatório superior.
   9. Repetir os passos 1.2.7-1.2.8 até que todo o volume de lisado de fago tenha sido passado através do dispositivo filtrante, com ~2 mL de fago concentrado retido no reservatório superior após cada spin.
   10. Desobstruir a membrana do filtro após o último giro pipetando o lisado restante (~2 mL) no reservatório superior para cima e para baixo. Lavar o fago (troca de tampão) adicionando 12 mL de tampão SM ao reservatório superior e centrifugar a 4000 x g por 10 min, ou até que a maior parte do tampão tenha passado pelo filtro.
   11. Eliminar o filtrado e repetir o passo de lavagem (passo 1.2.10). Ressuspender os 2 mL restantes de lisado em tampão SM para um volume final de 10 mL (ou menos), para armazenamento a longo prazo. Transferir o lisado para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL e armazenar a 4 °C até a remoção da endotoxina.
       NOTA: É opcional titular o fago nesta fase para garantir que o lisado do fago tenha sido concentrado (> 10⁸ pfu/mL) e para determinar a perda de fago durante o processo de remoção da endotoxina.
   12. Remover endotoxinas contaminantes do lisado de fago T4 adicionando 0,4 volumes de 1-octanol (ver Tabela de Materiais) ao volume total de lisado.
       NOTA: As endotoxinas são removidas por serem altamente imunoestimulantes e, portanto, sua presença pode levar à indução de uma resposta imune inata independente de fago²⁵.
       CUIDADO: 1-Octanol é um composto aromático, orgânico, inflamável com um odor forte e é um irritante para os olhos. Use EPI apropriado ao trabalhar com 1-octanol. Execute todo o trabalho em uma capela de fumaça para evitar a inalação de vapor. Use película de vedação para evitar o vazamento de tubos ao trabalhar fora do exaustor.
   13. Sele a tampa do tubo centrífugo cônico com película de vedação para evitar vazamentos. Agitar a 120 rpm em plataforma ou agitador à temperatura ambiente durante 1 h, seguido de incubação a 4 °C durante 1,5 h, sem agitar.
   14. Centrifugar a 4000 x g durante 10 minutos para separar o lisado eliminado de endotoxinas do 1-octanol. A camada de 1-octanol flutuará sobre o lisado. Use uma pipeta P1000 para remover cuidadosamente o máximo possível de 1-octanol e descartar no recipiente apropriado de resíduos líquidos perigosos/inflamáveis.
   15. Use uma agulha de 18 G e uma seringa de 10 mL para coletar o lisado do fago abaixo da camada restante de 1-octanol, tomando cuidado para não coletar a camada de 1-octanol. Conservar lisado a 4 °C até à velocidade de vácuo.
   16. Transferir alíquotas de 1 mL de lisado de fago T4 para tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL. Acelerar o vácuo com as tampas abertas a 4000 x g à temperatura ambiente para evaporar o 1-octanol residual do lisado. Acelerar o vácuo por 3 h ou até que o volume de lisado do fago tenha sido reduzido em 30%²⁵. Conservar a 4 °C até à titulação.
   17. Titular o lisado do fago para determinar a concentração em pfu/mL. Diluir o lisado de fago T4 resultante em tampão SM até a concentração desejada e re-titular para confirmar.
   18. Quantificar as endotoxinas presentes no lisado de fago T4 utilizando um kit de quantificação de endotoxinas cromogénicas, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Comparar os níveis de endotoxina no lisado final do fago com uma amostra de pré-remoção de endotoxina, controles do veículo, tampão e água potável de camundongos.
       NOTA: O kit de quantificação de endotoxinas cromogênicas é inativado por 1-octanol²⁵. Executar etapas de vácuo de velocidade para remover 1-octanol (passo 1.2.16) antes de quantificar as endotoxinas. O teor de endotoxinas para a água destilada é estimado em 20 EU/mL²⁵; no entanto, o conteúdo de endotoxinas da água potável de camundongos pode variar entre as instalações. Se os níveis de endotoxina no lisado de fago excederem a quantidade presente na água potável, considere repetir as etapas de remoção de endotoxinas (1.2.12-1.2.16).
   19. Armazenar lisados de fago T4 concentrados e eliminados por endotoxinas em tampão SM a 4 °C.
3. Preparação de lisado bacteriano livre de fagos para controles de veículos
   NOTA: Um lisado bacteriano livre de fagos pode ser preparado como um veículo para controlar quaisquer efeitos devido a contaminantes bacterianos (por exemplo, endotoxina) gerados na produção de lisado de fago na etapa 1.2, o que poderia afetar os resultados experimentais quando inoculado em camundongos.
   1. A partir de uma cultura noturna de E. coli, subcultivar a E. coli 1:50 em 100 mL de LB. Sem adição de fago, continuar a cultivar as bactérias agitando a 37 °C durante 3 h ou igualando o tempo de incubação do lisado de fago produzido no passo 1.2.
   2. Transferir a cultura de E. coli para tubos cônicos de 50 mL e células de lise usando uma sonda sonicadora (ver Tabela de Materiais) em gelo a 30 kHz por pulsos de 30 s (3x) para lisar manualmente as células bacterianas.
   3. Siga o restante do protocolo conforme a etapa 1.2, começando na etapa 1.2.4, incluindo todas as etapas de limpeza, lavagem e remoção de endotoxinas.
      NOTA: Durante a concentração usando o dispositivo de filtro centrífugo, o lisado do veículo fluirá através do filtro mais rapidamente do que o lisado de fago, devido à ausência de fago. Portanto, diminua os tempos de centrifugação de 5 minutos para 2-5 minutos para garantir que a membrana do ultrafiltro não seque durante a centrifugação prolongada.
   4. Titer o lisado do veículo para confirmar que não contém fago.
   5. Use um kit de quantificação de endotoxinas cromogênicas de acordo com as instruções do fabricante para medir os níveis de endotoxinas no lisado do veículo. Diluir o lisado do veículo em tampão SM para corresponder aos níveis de endotoxina no lisado de fago.
4. Controles experimentais alternativos: preparação de lisado de fago inativado termicamente
   NOTA: Uma alternativa ao lisado bacteriano livre de fagos é um lisado de fago inativado pelo calor. A inativação térmica dissocia os viriões dos fagos, enquanto endotoxinas residuais como os lipopolissacarídeos (LPS) são estáveis ao calor ^8,33. Esse método foi utilizado por Gogokhia et ^al.8 para determinar se virions fagos intactos e viáveis eram necessários para a ativação imune. Os pesquisadores são encorajados a testar ambos os métodos (livre de fagos vs. inativado pelo calor) e determinar qual controle é mais apropriado para suas necessidades experimentais. Seja qual for a escolha, é importante reconhecer que é improvável que um controle tampão seja apropriado devido à manipulação significativa necessária para concentrar e limpar um estoque de fago.
   1. Transfira o volume necessário de lisado de fago T4 limpo, purificado e diluído da etapa 1,2 (100 μL por rato) para tubos de microcentrífuga estéreis equipados com fechaduras de tampa.
   2. Aquecer lisados num bloco térmico a 95 °C durante 15 min¹⁶.
   3. OPCIONAL: Se a remoção de ácidos nucleicos fagos/bacterianos for necessária, execute o tratamento com DNase I e RNase A conforme Jakočiūnė e Moodley³⁴. Brevemente:
      1. Adicionar 50 μL de tampão DNase I 10x, 1 μL de DNase I (1 U/μL) e 1 μL de RNase A (10 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) a 450 μL de lisado de fago inativado pelo calor.
      2. Incubar lisados a 37 °C durante 1,5 h num bloco de calor, sem agitar.
      3. Inativar a DNase I e RNase A adicionando 20 μL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 ^M34.
   4. Segure os lisados à temperatura ambiente durante 10 minutos para arrefecer e combine os lisados se forem utilizados vários tubos. Conservar a 4 °C até à titulação.
   5. Realizar um título de fago para confirmar que nenhum fago T4 viável está presente no lisado. Conservar lisados inactivados termicamente a 4 °C.
   6. Use um kit de quantificação de endotoxina cromogênica de acordo com as instruções do fabricante para medir os níveis de endotoxina no lisado inativado pelo calor. Diluir o lisado inativado pelo calor em tampão SM de acordo com os níveis de endotoxina presentes no lisado de fago correspondente.

2. Administração e monitoramento de fago T4 em camundongos monocolonizados com E. coli

1. Monocolonização de camundongos com E. coli
   1. Preparar E. coli para administração em camundongos GF⁸ cultivando E. coli colhida de uma única colônia em meio LB durante a noite.
   2. Sob condições rigorosas e estéreis³⁵, administrar 200 μL de cultura de E. coli a camundongos GF alojados em isoladores de vinil estéreis ou gaiolas herméticas de bioexclusão por gavagem oral. Se usar bactérias aerotolerantes, camundongos também podem ser colonizados pela aplicação de 200 μL de cultura bacteriana no dorso de cada camundongo.
      OBS: A dose de inoculação será dependente da cepa, pois diferentes bactérias demonstram diferentes capacidades de sobrevivência ao pH^36,37. Zucoloto et ^al.35 recomendam a inoculação com 1 x 10⁸ ufc por animal. Resultados representativos mostrados aqui foram gerados a partir de camundongos inoculados com uma cultura noturna (ufc não foi determinado). Experimentos piloto podem ser realizados para determinar uma dose que resulte em colonização confiável da linhagem de camundongos de interesse. O volume de bactérias a ser administrado por gavagem oral pode ser afetado pela idade e peso dos camundongos. Consulte o protocolo de ética animal individual de laboratório ou institucional para obter doses máximas permitidas. O volume sugerido aqui é baseado em uma permissão de gavagem de 10% do peso corporal do camundongo (por exemplo, 200 μL no máximo para um camundongo de 20 g). Algumas espécies bacterianas não toleram a acidez do estômago e não conseguem colonizar o intestino. Considere a primeira gavagem com 100 μL de NaHCO₃ 1 M para neutralizar os ácidos estomacais². Se usar um anaeróbio estrito para colonizar, o micróbio precisará ser cultivado em condições anaeróbias e transferido para a instalação animal gnotobiótica em recipientes herméticos preparados individualmente (1 para cada camundongo). Execute cada gavagem rapidamente assim que o recipiente for aberto para limitar a perda de viabilidade microbiana devido à exposição ao oxigênio.
   3. Monitorar camundongos para efeitos adversos à saúde.
      NOTA: Em caso de efeitos adversos para a saúde, consulte as normas estabelecidas pela instalação de cuidados aos animais relevante. Os possíveis efeitos adversos à saúde incluem, mas não estão limitados a: (1) Aspiração de líquido de gavagem: os sintomas incluem expulsão de bolhas pelo nariz, respiração de "boca aberta" / ofegação. (2) Perfuração do esôfago: os sintomas incluem saúde rapidamente doente, curvamento, letargia, levando à morte do animal dentro de 24 h. (3) Inflamação do esôfago devido a gavagem repetida: os sintomas incluem dificuldade para inserir a agulha de gavagem. (4) Diarreia por alterações no microbioma.
   4. Confirmar a colonização bacteriana em pellets fecais por meio de cultura pelo menos uma vez por semana e/ou por sequenciamento de 16S rRNA³⁵.
      NOTA: Se colonizar criadores dentro de um isolador gnotobiótico para produção de camundongos experimentais, planeje com pelo menos 9 semanas de antecedência a geração de camundongos experimentais de primeira geração de descendentes (F1) com 6 semanas de idade. Alternativamente, camundongos GF adultos podem ser monocolonizados. Nessa abordagem, recomenda-se aguardar 7 semanas pós-colonização antes da inoculação do fago, pois este é o tempo necessário para que a mucosa intestinal se estabilize após a introdução de uma microbiota complexa em camundongos GF³⁸.
2. Inoculação oral de fago T4 em camundongos monocolonizados com E. coli
   1. Diluir os lisados de fago T4 e os controlos do veículo até uma concentração pré-determinada em tampão SM. De acordo com Hsu et ^al.2, os lisados de fagos diluídos para permitir a administração de 2 x 10⁶ pfu por camundongo².
      NOTA: Uma maior ou menor concentração de fago pode ser usada dependendo da estabilidade do fago in vivo. Doses de 2 x 10, 2,² x 10,⁴ e 2 x 10,⁶ pfu de fago T4 por camundongo resultaram em colonização estável e de longo prazo no intestino que não pareceu ser dose-dependente (mostrado na seção de resultados representativos). A cinética fago-bactéria deve, portanto, ser testada in vivo antes de experimentos em larga escala.
   2. Sob condições estéreis e gnotobióticas, gavagem cada camundongo com 100 μL de NaHCO₃ 1 M autoclavado para neutralizar os ácidos estomacais. Esperar 10 minutos e, em seguida, gavagem com 100 μL de lisado de fago T4 ou controle do veículo.
   3. Monitorar camundongos para efeitos adversos à saúde.

3. Monitoramento dos níveis de fagos T4 in vivo

NOTA: Uma vez que os ratos tenham sido inoculados com fago, a concentração de ambos os fagos e bactérias-alvo pode ser medida em amostras fecais ou de tecido. Isso fornece informações sobre a cinética da infecção do fago e a dinâmica de colonização de ambos os organismos.

1. Spot plating de fago T4 para determinação da concentração em pellets fecais
   1. Coletar pastilhas fecais de cada camundongo em tubos de microcentrífuga estéreis e pré-pesados para medir os níveis de T4 fago e E. coli . Guarde os tubos no gelo até o revestimento.
      NOTA: Coloque as amostras no gelo no intervalo entre a coleta e o plaqueamento para retardar o crescimento de bactérias aerotolerantes. Ao longo de várias horas, ainda pode haver crescimento de bactérias aeróbicas, ou alguma morte de bactérias anaeróbicas devido à exposição ao oxigênio, o que pode levar a contagens distorcidas de bactérias. Portanto, a plaqueação de bactérias e fagos deve ser realizada o mais rápido possível após a coleta das amostras. As bactérias anaeróbicas obrigatórias não toleram a exposição ao oxigênio. Para preservar a amostra, colete as amostras em tubos selados e transfira os tubos para uma câmara anaeróbia o mais rápido possível após a coleta. Se nenhum crescimento for detectado em amostras fecais, considere alternativas como 16S rRNA qPCR para quantificação bacteriana.
   2. Registre os pesos finais de cada tubo e calcule o peso da amostra subtraindo o peso inicial do tubo. Isso será usado para normalizar a concentração de fago T4 e E. coli para o peso da amostra (pfu/g ou ufc/g, respectivamente).
   3. Adicionar 1 mL de tampão SM estéril a cada tubo e vórtice completamente à velocidade máxima (>1 min) para homogeneizar os pellets fecais. Se a amostra for inferior a 15 mg, pode ser adicionado um volume menor de tampão SM. Registar o volume de tampão SM adicionado a cada amostra para cálculos de ufc/g ou pfu/g de amostra.
   4. Preparar uma série de 8 (ou mais, dependendo da concentração esperada de fago) diluições seriadas de 20 μL de cada amostra em tampão SM de 180 μL, em fatores de 10. Vórtice cada amostra homogeneizada brevemente para misturar antes de adicionar ao primeiro tubo/poço. Pipeta para misturar entre cada adição e mudar as pontas entre cada diluição para evitar a insuflação da contagem de fagos ou bactérias através do transporte da amostra.
      NOTA: Se as fibras e os detritos presentes na amostra dificultarem a pipetagem, adicione tampão adicional ao chorume fecal para diluir ainda mais a amostra-mãe.
   5. Colocar 5 μL de cada diluição em placas de ágar mole LB contendo E. coli (para ensaios de placa de fago) ou placas de ágar LB (ágar 1,5%, para ensaios de colónias bacterianas) para determinar a concentração de T4 phage e E. coli em cada amostra. Para precisão, identifique cada amostra em triplicata.
      NOTA: Se preparar diluições em série numa placa de 96 poços, pode ser utilizada uma pipeta multicanal P20 de 8 canais para pipetar cada coluna de amostra diluída em série para chapas. Trocar as pontas entre cada diluição, mesmo passando da mais diluída para a mais concentrada, pois o fago pode aderir às paredes da ponta da pipeta e alterar a quantidade de fago adicionada a cada novo poço³¹.
   6. Deixe cada ponto secar antes de inverter a placa e colocá-la na incubadora. Incubar durante a noite a 37 °C.
   7. Para cada amostra, selecione a diluição na qual há 3-30 placas contáveis por ponto. Conte e registre o número de placas no local e a diluição utilizada.
   8. Calcular pfu/g de amostra dividindo o número de placas pelo volume plaqueado em cada ponto para dar pfu/μL. Multiplique este pelo factor de diluição e pelo volume de tampão SM adicionado a cada amostra para obter pfu/amostra. Por último, divida pelo peso da amostra para obter pfu/g³⁰.
      
      
2. Amostragem de tecido em desfechos experimentais
   1. Em cada momento selecionado, eutanasiar camundongos de acordo com o protocolo institucional de ética animal aprovado e coletar conteúdo cecal, conteúdo do intestino delgado e grosso e quaisquer tecidos de interesse em tubos de microcentrífuga de fundo redondo estéreis e pré-pesados de 2 mL.
   2. Registre os pesos finais de cada tubo para calcular o peso da amostra. Armazenar tecidos e conteúdo cecal no gelo até o plaqueamento no mesmo dia.
   3. Adicione buffer SM estéril a cada tubo e registre os volumes adicionados.
   4. Para o conteúdo cecal e intestinal, amostras de vórtice cuidadosamente (>1 min) de acordo com a etapa 3.1.3.
   5. Para amostras de tecido, adicione uma conta de metal estéril a cada tubo. Homogeneizar os tecidos usando um lisador de tecido (ver Tabela de Materiais) a 20 Hz por 5 min ou até que os tecidos estejam dissociados e a suspensão seja homogênea.
      NOTA: Se as amostras não homogeneizarem bem, considere aumentar o volume de tampão SM adicionado, aumentar o tempo de homogeneização ou aumentar a frequência de homogeneização para 30 Hz. Um homogeneizador tecidual também pode ser usado para dissociar tecidos, permitindo a recuperação bacteriana e^{fagológica 39,40}. Os homogeneizadores são operados em frequências mais altas do que os lisadores teciduais, mantendo a integridade das bactérias.
   6. Preparar diluições seriadas de cada amostra em factores de 10 e proceder a plaqueamento pontual para determinar as concentrações de E. coli e T4 phage em cada amostra, tal como descrito nos passos 3.1.4-3.1.8⁴¹.

Results

Para investigar as interações entre a díade T4 fago/E. coli no intestino murino, o fago T4 e os lisados veiculares foram preparados, limpos e purificados (Figura 1A). Os lisados de fagos T4 foram titulados por ensaio de placa e diluídos a 2 x 10⁷ pfu/mL (2 x 10⁶ pfu/camundongo) em tampão SM. Os lisados de veículos também foram titulados para confirmar a ausência de fagos viáveis e diluídos no mesmo volume de tampão SM que o lisado de fago T4. Os níveis de endotoxinas foram quantificados em lisados diluídos usando um kit de quantificação de endotoxinas cromogênicas. O fago T4, o fago inativado pelo calor e os lisados de veículos apresentaram níveis de endotoxinas abaixo dos aceitáveis para água potável (<20 EU/mL)²⁵ (Figura 1B). Como o lisado veicular apresentou quantidade de endotoxina semelhante à do lisado de fago T4, considerou-se um controle adequado. O lisado de fago inativado termicamente (2 x 10⁷ pfu/mL antes do tratamento térmico) apresentou menos endotoxina do que o lisado de fago veículo e T4. De acordo com as instruções do kit, as amostras que haviam sido tratadas com 1-octanol foram testadas para inibição do ensaio pela adição de um padrão de endotoxina ao lisado do veículo (veículo fortificado), para obter uma concentração final de 0,5 EU/mL. Os níveis de endotoxina veicular fortificada menos os níveis de endotoxina veicular mediram 0,5 EU/mL ±25%, de acordo com as recomendações do fabricante (Figura 1B). Isso demonstrou que o 1-octanol foi removido com sucesso e que não houve inibição do ensaio causada pelos lisados que pudesse interferir nos resultados do ensaio.

E. coli Camundongos C57BL/6 monocolonizados K-12 (BW25113) foram criados em isolador de vinil de filme flexível estéril sob condições gnotobióticas (Figura 2A). Camundongos da geração F0 foram colonizados com E. coli através de sua adição ao ambiente e co-alojamento. Apenas as progênies (geração F1 e F2) colonizadas com E. coli desde o nascimento por transmissão vertical e co-alojamento foram utilizadas para os experimentos. Essa estratégia controlou as alterações no sistema imune, na produção de muco e no desenvolvimento do trato gastrointestinal que ocorrem em resposta à inoculação bacteriana^22,37, permitindo, portanto, mensurar as alterações que ocorrem apenas devido à introdução do fago. Uma vez maturados, os camundongos experimentais foram transferidos para isocages estéreis, onde cada um recebeu 2 x 10⁶ pfu de fago T4 ou um volume igual de lisado veicular por gavagem oral com 6-8 semanas de idade. A abundância de fagos T4 e E. coli foi monitorada durante quatro semanas por meio da coleta de pelotas fecais e ensaios de plaqueamento em ágar 0,5% (mole) ou 1,5% de ágar, respectivamente. Ao longo deste experimento, o fago T4 e a E. coli foram capazes de coexistir sem que nenhuma das populações estivesse esgotada (Figura 2B, C). A administração oral de fago T4 em doses mais baixas de 2 x 10² e 2 x 10⁴ pfu/camundongo não reduziu a capacidade do fago T4 de colonizar o intestino em comparação com 2 x 10⁶ pfu (Figura 2D). Da mesma forma, não foi observado efeito dose-dependente da inoculação de T4 sobre os níveis de E. coli (Figura 2E).

É importante ressaltar que a consistência no plaqueamento entre as amostras foi crucial para a contagem de placas. Por exemplo, ao adicionar bactérias no ágar mole, determinou-se que a densidade de bactérias influenciou grandemente o resultado do ensaio. A adição de E. coli subcultivada por 1 h, 1,5 h ou 2 h resultou em contagens de placa mais baixas do que com a adição de E. coli subcultivada por 2,8 h ou mais. Além disso, a quantificação da placa estabilizou-se em ~1 x 10⁹ pfu/mL quando E. coli foi subcultivada por 2,8 h a 16 h (durante a noite), o que foi aproximadamente um aumento de 5 vezes em comparação com o valor calculado a partir de uma subcultura de 1 h (~2 x 10⁸ pfu/ml) (Figura 3A). Em vez de subcultivar, as bactérias-alvo podem ser inoculadas em ágar mole de culturas noturnas. Aqui, o volume da cultura de E. coli de 16 h (durante a noite) inoculada no ágar mole impactou a contagem de placas (Figura 3B). Estes resultados indicam que a densidade de E. coli dentro do ágar pode influenciar a contagem de placas. Em ambas as abordagens, os resultados da quantificação de fagos estabilizaram no mesmo valor (10-9 pfu/ml), sugerindo que as bactérias-alvo devem ser de densidade suficientemente alta no ágar mole para garantir a precisão da contagem de placas.

Em conjunto, esses resultados destacam a importância de desenvolver uma compreensão da cinética fago-bacteriana através de experimentos piloto in vitro e in vivo antes de realizar manipulações experimentais.

Figura 1: Preparação dos lisados fagológicos. (A) Fluxo de trabalho para iniciar um lisado de fago a partir de um estoque de fago de alto título. Os lisados foram propagados, limpos, concentrados e as endotoxinas removidas. O contaminante 1-octanol foi removido por vácuo de velocidade. (B) As endotoxinas foram quantificadas em lisados de fagos e veículos usando um kit de quantificação de endotoxinas cromogênicas. Linhas azuis tracejadas indicam os limites superior e inferior para refutar a inibição do produto no controle de inibição do produto (0,5 EU/mL ± 25%). Cada ponto representa uma das duas réplicas técnicas. A altura da barra representa a média entre as réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Geração de camundongos monocolonizados e monitoramento dos níveis de fagos e bactérias em pellets fecais. (A) Fluxo de trabalho para colonização de camundongos livres de germes com uma única espécie de bactéria e geração de camundongos monocolonizados F1 e F2. (B-E) Níveis de fago T4 e E. coli detectados em pelotas fecais de camundongos C57BL/6 que nasceram monocolonizados com E. coli e foram inoculados com fago T4 com 6-8 semanas de idade. No dia 0 (pré-colonização) e nos dias indicados após a colonização, os níveis de T4 foram medidos por métodos de plaqueamento e placa usando o método da camada única de ágar. Os níveis de E. coli foram medidos por plaqueamento em ágar 1,5% LB. (B, C) Cinética dos níveis de (B) fago T4 e (C) E. coli em pelotas fecais recuperadas após inoculação com 2 x 10⁶ pfu de fago T4 ou lisado veicular (normalizado para volume e níveis de endotoxina). (D, E) (D) níveis de fago T4 e (E) E. coli em pellets fecais recuperados após inoculação com 2 x 10² pfu, 2 x 10⁴ pfu ou 2 x 10⁶ pfu de fago T4. As barras de erro representam a média e o erro padrão da média (EPM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Precisão da solução de problemas em ensaios de placa. (A) Título de lisado de fago T4 usando culturas noturnas de E. coli ou subculturas para preparação de ágar mole (0,5% ágar, LB). As subculturas foram feitas usando uma diluição de 1:50 da cultura noturna de E. coli em LB fresco. 5 mL de preparações de ágar mole foram inoculados com 100 μL de E. coli e 20 μL de fago T4. CaCl₂ e MgSO₄ não foram adicionados ao ágar mole para esses testes, mas podem ser adicionados se desejado. Tempos de subcultivo de E. coli inferiores a 2,8 h resultaram em menor título aparente de fago. (B) título de lisado de fago T4 usando diferentes densidades de E. coli em preparação de ágar mole. A adição de diferentes volumes de E. coli de uma cultura noturna (não subcultivada, como em A) no ágar mole resultou em diferentes títulos aparentes de fago. As barras de erro representam a incerteza calculada do título do fago. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O estudo de fagos no microbioma apresenta um desafio significativo em comparação com seus homólogos bacterianos. Especificamente, os fagos não contêm um marcador filogenético conservado comum a todos os fagos, semelhante às subunidades ribossomais 16S e 18S, que permita a facilidade no sequenciamento e identificação de espécies procarióticas e eucarióticas, respectivamente⁴². No entanto, com os avanços nas abordagens de sequenciamento de próxima geração, incluindo o aumento do comprimento de leitura, a taxa de transferência e a diminuição dos custos, ocorre a rápida expansão dos bancos de dados do genoma de bacteriófagos 42,43,44. Com muito trabalho de base na descoberta de fagos bem encaminhado, a pesquisa de fagos está agora mais acessível do que nunca. Como membros-chave do microbioma intestinal e os organismos mais geneticamente diversos da Terra, os fagos apresentam um ângulo empolgante para novas pesquisas que investigam a complexidade do microbioma. Os protocolos aqui descritos concentram-se na investigação de espécies de fagos conhecidas em camundongos colonizados com suas bactérias-alvo. Deve-se notar que esses protocolos fornecem uma diretriz para o estudo de fagos in vivo e podem ser expandidos com o crescimento do campo.

A pesquisa de bacteriófagos para o tratamento terapêutico de infecções bacterianas saiu de moda com o advento dos antibióticos na década de 1940. No entanto, a prescrição excessiva e o uso indevido de antibióticos aceleraram o surgimento de patógenos multirresistentes como um grande problema de saúde pública³. Os fagos apresentam uma alternativa potencial atrativa aos antibióticos, devido ao seu alto grau de especificidade do hospedeiro³. É importante ressaltar que, como os fagos naturalmente se instalam como membros do microbioma intestinal humano, é necessário primeiro entender os papéis que os fagos desempenham nesses ambientes complexos. Embora muitos estudos tenham investigado a relação entre um fago e suas bactérias-alvo in vitro, é importante considerar como essas relações podem se manter dentro da paisagem do trato gastrointestinal. Como em estudos exploratórios que investigaram os componentes bacterianos da microbiota, modelos simplificados de camundongos como GF e camundongos monocolonizados permitem isolar os efeitos do fago em sua espécie-alvo, e como essa relação contribui para a resposta imune. Este é um passo importante para a fagoterapia, pois alguns fagos podem não proporcionar benefícios quando introduzidos no intestino. Por exemplo, o fago Pf4 de Pseudomonas aeruginosa exacerba a doença causada por seu hospedeiro, inibindo tanto a resposta imune antibacteriana quanto a migração de queratinócitos, resultando em prejuízo na cicatrização de feridas^18,45. Os procedimentos aqui descritos visam padronizar técnicas de estudo de fagos como membros da microbiota murina. Ecoando estudos pioneiros que investigaram o impacto da microbiota no hospedeiro metazoário, pesquisas contínuas em fagos dentro do contexto da microbiota podem ser empolgantes e significativas na compreensão mais ampla do multibioma⁴⁶.

Limitações
Os protocolos aqui descritos foram otimizados para estudar a competição entre o fago T4 e sua bactéria-alvo, E. coli, quando fagos T4 são administrados por gavagem oral a camundongos monocolonizados com E. coli. Assim como as bactérias, espécies distintas de fagos comportam-se de forma diferente umas das outras, apresentando tempos de replicação, tamanhos de explosão e faixas de alvos bacterianos^{variados 47}. Portanto, ao investigar outros pares fago-bacterianos em modelos animais semelhantes, deve-se ter o cuidado de otimizar esses protocolos em todas as etapas. Por exemplo, fagos com um tempo de replicação mais longo e/ou um tamanho de explosão menor podem exigir uma incubação mais longa com seu alvo bacteriano para a produção de um lisado de alto título. Da mesma forma, os tempos de incubação da placa podem precisar ser estendidos para ensaios de placa. Além disso, fagos com um curto tempo de replicação e/ou alto tamanho de explosão podem exigir incubações de placas mais curtas, pois a incubação noturna pode resultar em crescimento excessivo da placa. Se as condições de propagação forem desconhecidas para um fago específico de interesse, as bases para determinar as condições de crescimento devem ser estabelecidas antes do início do trabalho in vivo ⁴⁸.

Domínios Ig-like encontrados nas proteínas do capsídeo Hoc do fago T4 facilitam a aderência ao muco intestinal¹¹. Dependendo da capacidade de ligação do muco do fago de escolha, a cinética dos níveis de fago-bactérias nas amostras fecais pode diferir dos resultados mostrados na Figura 2B-E. Por exemplo, foi demonstrado em sistemas gut-on-a-chip que fagos contendo proteínas Hoc intactas tinham aumentado a capacidade de matar E. coli em comparação com o fago deficiente em Hoc¹¹. Embora se suspeite que os fagos T4 sejam retidos através da ligação do muco in vivo 11,12,13, o impacto da reinoculação através do comportamento coprófago de camundongos não pode ser descartado. Esses efeitos podem ser reduzidos com o uso de fundos de gaiolas de arame ou com a troca frequente de gaiolas. Como domínios Ig-like não foram identificados em fagos de ssDNA ou RNA⁴⁹, será interessante separar as outras estratégias usadas pelos fagos para reter a residência na mucosa intestinal.

Finalmente, esses estudos exploratórios examinaram as interações fago-bactéria-hospedeiro apenas na homeostase. Em modelos animais de doença humana, não se sabe como alterações na integridade da barreira intestinal, como na DII, podem afetar essas interações. Estudos recentes têm demonstrado que os fagos caudovirais têm aumentado a riqueza e diversidade em pacientes com DII ^7,8. Em modelos murinos, demonstrou-se que o tratamento contínuo com fagos exacerbou a colite experimental induzida pelo sulfato de sódio (DSS)⁸. Resta determinar como as interações fago-bactéria-hospedeiro se desenrolam em ambientes inflamatórios e se a integridade da barreira prejudicada facilita a inflamação induzida por fago.

Solução de problemas e métodos alternativos

Modelos de mouse
Modelos monocolonizados em camundongos permitem interrogar uma única espécie de bactéria sobre a fisiologia do hospedeiro¹⁶. Pesquisas envolvendo camundongos monocolonizados têm desempenhado um papel crucial na elucidação de como a microbiota influencia o sistema imunológico²². Como um sistema modelo, camundongos monocolonizados não recapitulam a fisiologia de seus homólogos convencionais da microbiota. Mais semelhantes aos camundongos GF, os camundongos monocolonizados por E. coli têm produção de muco reduzida (semelhante aos camundongos GF⁵⁰) e um sistema imunológico imaturo²³. No entanto, camundongos monocolonizados têm sido inestimáveis para desvendar os efeitos micróbio-específicos de espécies individuais no trato gastrointestinal e no desenvolvimento imunológico. Um exemplo clássico é a descoberta de que bactérias filamentosas segmentadas (SFB) são potentes indutoras de células T helper CD4⁺ 17 em camundongos²⁴. No que se refere ao muco, há efeitos micróbio-específicos sobre a transcrição do gene do muco⁵¹e a espessura do muco⁵⁰. Embora limitados, camundongos monocolonizados oferecem oportunidades para investigar o impacto de um par fago-bactéria no hospedeiro mamífero em um modelo controlado. É importante ressaltar que os fagos podem, e devem, ser investigados no contexto de uma microbiota complexa. Até o momento, poucos estudos abordaram os impactos da predação de fagos de espécies bacterianas comensais dentro de um microbioma convencional. Esta é uma futura aplicação dos protocolos apresentados neste artigo, que poderão ser adaptados para facilitar esses estudos.

Utilização de comandos de veículos adequados
Controles apropriados são essenciais em qualquer experimento. Aqui, foi definido um veículo adequado para administração oral em camundongos que controla a limpeza e purificação em várias etapas de lisados de fagos T4. Um requisito importante é que o controle do veículo contenha um nível igual de endotoxinas bacterianas que o lisado de fago, para controlar qualquer resposta imune mediada por endotoxinas. Clorofórmio e 1-octanol são adicionados ao lisado como parte do processo de purificação e subsequentemente removidos. Para controlar as potenciais respostas imunes que podem ser geradas para rastrear os níveis desses produtos químicos, um lisado bacteriano livre de fagos pode ser produzido como um veículo de controle. Os lisados de fago e veículo T4 continham uma concentração muito baixa de endotoxinas bacterianas, bem abaixo dos níveis permitidos na água potável²⁵ (Figura 1B). Controles alternativos podem ser usados e podem ser modificados para se adequar à pergunta de pesquisa pretendida. Mais simplesmente, o tampão de fago contendo uma quantidade equivalente de endotoxina pode ser usado, embora isso não seja responsável pelos processos de limpeza e purificação de várias etapas. Gogokhia et ^al.8relataram o uso de fagos inativados pelo calor como controle para saber se a proteína do fago sem DNA era suficiente para provocar uma resposta imune. Em nossas mãos, o fago inativado pelo calor apresentou níveis mais baixos de endotoxina do que o lisado de fago T4 (Figura 1B) e, portanto, não foi usado para controlar os níveis de endotoxina neste estudo. No entanto, encorajamos o teste de ambos os protocolos para determinar qual método é mais adequado para fins experimentais individuais. Se o veículo e os lisados de fago T4 diferirem significativamente na quantidade de endotoxina presente, o lisado contendo os níveis mais baixos pode ser suplementado com endotoxina purificada. O 1-octanol é adicionado aos lisados durante o processo de purificação, mas inativa o teste do kit de quantificação de endotoxinas cromogênicas. É importante testar a inibição do produto por substâncias potencialmente interferentes na amostra para garantir que as medições de endotoxinas sejam precisas. Se houver suspeita de inibição do produto, é possível que a amostra não tenha sido aspirada por tempo suficiente. Se os problemas persistirem, a diálise pode ser usada para remover o 1-octanol²⁵ restante.

Via de administração e dose
Devido à capacidade de ligação do muco do fago T4, modelos de camundongos foram inoculados em dose única de gavagem oral. O objetivo foi monitorar a duração da coabitação do trato gastrointestinal entre fago e E. coli; no entanto, outras abordagens para estudar fagos em modelos in vivo têm sido relatadas. Por exemplo, água potável enriquecida com fagos tem sido usada para fornecer um suprimento contínuo de fago para camundongos ^8,20. O benefício desse método de administração é que os fagos são continuamente reabastecidos, mesmo na ausência de um hospedeiro bacteriano, como demonstrado por Gogokhia et al.⁸. Este desenho experimental permitiu avaliar a resposta imune a fagos na ausência de bactérias e proporcionou estimulação imune contínua ao longo do experimento. Fisiologicamente, este método não representa um curso natural de infecção por fagos ou colonização por fagos de um ambiente intestinal, mas fornece informações importantes sobre como a exposição repetida a fagos pode estimular o sistema imunológico. Isso tem importância no contexto do desenvolvimento da fagoterapia, já que coquetéis de fagos podem ser administrados como um curso de tratamento para tratar infecções bacterianas intestinais, semelhante aos regimes de antibióticos. No contexto do par T4-E. coli, determinou-se que a diminuição da dose de fago T4 aplicada por via oral em camundongos monocolonizados não alterou os níveis de fagos fecais ou bactérias (Figura 2D, E). Portanto, neste caso, a dose de inoculação do fago T4 não é crucial para a manutenção da colonização estável do fago T4-E. coli no intestino de camundongos bicolonizados. Nota-se que a menor dose administrada foi de 200 pfu/camundongo, e a maior dose foi de 2 x 10⁶ pfu/camundongo (conforme Hsu et al.) ². Portanto, dados que suportem a cinética de T4 fago-E. coli fora dessa faixa não estão disponíveis neste estudo.

Títulos de fagos pontuais e de placas inteiras
Para a mensuração dos níveis de fagos T4 em fezes e tecidos, os protocolos aqui descritos baseiam-se em técnicas de spotplating em vez de ensaios de placa inteira, o que pode contribuir para a variabilidade nos níveis de fago entre camundongos (Figura 2B). Nas técnicas de placas inteiras, as placas são contadas em uma área maior, permitindo uma quantificação mais precisa. No entanto, uma diluição adequada de cada amostra deve normalmente ser pré-determinada por plaqueamento pontual. Uma vez que as amostras foram ensaiadas no dia da coleta, o spot plating foi considerado o método mais apropriado para uma abordagem de alto rendimento. Portanto, a resolução desses dados é representada de forma mais precisa pela ordem de grandeza do fago em cada amostra. Para medições precisas de fago, há considerações adicionais para cada fago. Medições mais precisas podem ser obtidas por ensaios em placas inteiras ou usando intervalos menores de diluição em série para cada amostra. Se esses métodos ainda resultarem em contagens variáveis de fagos ou bactérias-alvo, seria prudente avaliar se interações únicas entre o fago e as bactérias poderiam explicar as diferenças entre camundongos individuais por meio de sequenciamento metagenômico ou outros métodos para avaliar experimentalmente a coevolução e a resistência. De acordo com Bonilla et ^al.25, ao preparar ágar mole para ensaios de placa, é importante ser consistente com a quantidade de hospedeiro bacteriano adicionada²⁵. Como mostrado na Figura 3, mesmo mudanças relativamente pequenas nos tempos de cultivo das bactérias (Figura 3A) e densidade (Figura 3B) podem afetar a acurácia dos ensaios de placa. Esses achados podem ser diferentes para outros pares de fagos-bactérias, e experimentos semelhantes são recomendados ao começar com novos organismos. Adicionalmente, para novos pares fago-bactérias, experimentos exploratórios devem ser realizados para determinar as características de crescimento de cada um. Por exemplo, curvas de crescimento podem ser realizadas para determinar a defasagem, as fases exponencial e estacionária e a taxa de crescimento das bactérias. O experimento de crescimento em uma etapa pode ser usado para determinar o período latente (tempo para lise) e o tamanho de explosão (número de fagos liberados na lise da bactéria) dos fagos^52,53.

Medição alternativa de fago T4 por qPCR
A quantificação do fago pode ser realizada com ensaios de placa, como descrito acima, ou via reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Essas duas abordagens têm uma distinção importante: ensaios de placa determinam o número de fagos viáveis capazes de infectar e matar seus hospedeiros bacterianos, enquanto a qPCR quantifica material genético fago-específico (como um proxy do número de fagos presentes), mas não fornece informações sobre a viabilidade e infectividade do fago. qPCRs foram realizadas para comparar a quantificação de cópias gênicas de fagos com placas formadas em ensaios de placa usando primers descritos por Hsu et ^al.2 (Figura 4). DNA de fago T4 foi extraído e amplificado do conteúdo cecal de camundongos bicolonizados com T4 fago/E. coli . Na maioria dos camundongos, os ensaios de qPCR e placa detectaram níveis semelhantes de fago T4 no conteúdo cecal (Figura 4A, B). Enquanto alguma amplificação foi detectada no conteúdo cecal inoculado com veículo, as cópias gênicas/g calculadas estavam abaixo do limite de detecção (LOD) (Figura 4A). A ausência de fagos quantificáveis nessas amostras foi confirmada por eletroforese em gel. Produtos do gene do fago T4 (96 pb) foram prontamente visualizados no DNA isolado do conteúdo cecal de camundongos inoculados com T4, mas estavam ausentes nos controles do veículo (Figura 4C).

Nesses testes, cópias do gene do fago T4 foram detectadas no conteúdo cecal de um camundongo T4 colonizado por fagos por qPCR (Figura 4A, seta), apesar da incapacidade de detectar T4 em ensaios de placa da mesma amostra (Figura 4B, seta). Estes resultados sugerem que partículas virais que não formam placas podem surgir in vivo, seja devido à produção de partículas virais defeituosas ou co-evolução de fagos e/ou bactérias. Técnicas de plaqueamento bacteriano em ágar duro podem ser utilizadas para determinar a suscetibilidade de bactérias fecais ao fago¹⁴. Sugerimos que a detecção mediada por qPCR pode ser uma adição valiosa aos fluxos de trabalho de fagos in vivo , pois pode ser mais robusta para a evolução de fagos dentro do ambiente intestinal, uma vez que tem como alvo sequências gênicas curtas e conservadas. Abordagens não tendenciosas, como a metagenômica, são valiosas para examinar a coevolução fago-bacteriana e a abundância relativa, mas podem, em última análise, ser mais caras.

Figura 4: Detecção de fago T 4 por qPCR. (A,B) As cargas fagogicas de T4 foram medidas via (A) qPCR absoluto ou (B) ensaio de placa no conteúdo cecal de camundongos C57BL/6 colonizados por E. coli no dia 29 pós-inoculação com fago ou veículo T4. A seta indica resultados de um camundongo individual que tinha cópias detectáveis do genoma de T4, mas não vírus plaaquável no conteúdo cecal. (C) Eletroforese em gel de produtos de PCR mostrando a presença da banda de 96 pb em amostras cecais inoculadas com fagos T4, mas não em amostras inoculadas em veículos. Utilizou-se uma escada de DNA de 100 pb. LOD = limite de detecção. As barras de erro representam a média e o SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aplicativos
Os bacteriófagos representam mais de 90% das partículas semelhantes a vírus presentes no microbioma⁴⁴; no entanto, o impacto dos fagos no microbioma intestinal é pouco compreendido. Estudos iniciais investigando o componente bacteriano do microbioma o fizeram isolando espécies particulares e estudando seu impacto na maturação imunológica^22,24. Interrogações semelhantes do fageoma apresentam uma tarefa assustadora, mas necessária, e um requisito para obter uma compreensão abrangente do multibioma⁴⁶. Embora o foco do desenvolvimento da fagoterapia tenda a ser voltado para a cura de infecções bacterianas sépticas, é importante entender como a adição de um coquetel de fagos ao trato gastrointestinal pode alterar o ecossistema intestinal. Além disso, a segurança dos coquetéis terapêuticos de fagos deve ser avaliada gerando um perfil imunológico. Fagos têm sido investigados como potenciais tratamentos para infecções bacterianas intestinais como C. difficile⁵ e Salmonella enterica sorovar Typhimurium⁵⁴. Estudos recentes também demonstraram que os FFTs são igualmente ou mais eficazes no tratamento da enterocolite necrosante em suínos prematuros⁹, sugerindo que o componente viral dos transplantes de microbiota fecal (FMTs) pode desempenhar um papel ativo na redução da doença. Estudos contínuos investigando o papel dos fagos no microbioma são necessários para promover o desenvolvimento de terapias fagogênicas contra patógenos intestinais, mas também para informar melhor os FMTs como tratamento para doenças. Ao padronizar métodos para o estudo de fagos in vivo, a transparência e a reprodutibilidade na pesquisa de fagos serão aumentadas, juntamente com a orientação para aqueles que estendem seu trabalho em modelos de camundongos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Unidades de Filtro de Aspirador Descartáveis Estéreis	Millipore Sigma
Agarose (Baixo Grau de EEO/Multiuso/Biologia Molecular)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 dispositivo de filtro centrífugo, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubos, SST	BD Medical	365967
Bioexclusão gaiolas herméticas (gaiolas ISO)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Termociclador com Módulo de Reação Rápida de 96 Poços	BioRad	1851196
Cloreto de Cálcio Dihidratado (Cristais Brancos para Pó)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks Para Tubo de 1.5ML 100/pk	Andwin Scientific
Clorofórmio (Etanol como Conservante/ACS Certificado)	Fisher	C298-500
Contas de aço revestidas de cobre (4,5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Kit de Tecidos (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Solução de sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), para biologia molecular, 0,5 M em H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Pó / Flocos, BioReagentes Fisher™	Bioreagentes Fisher	BP1423-500
BioReagentes Fisher™ Meios de Microbiologia: Caldo LB (Pó) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
Filtros HEPA para tampas de isocage, FILTROS AUTOCLAVÁVEIS H14 PARA LINHA ISO- IRRADIADO	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Sulfato de magnésio heptahidratado	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Meio de Microbiologia: LB Caldo (Pó) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Tubos de Microcentrífuga com Tampa de Travamento, 2ml	Fisher	14-666-315
Filme de vedação de parafilme	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Dieta do Rato 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Kit Quant de Endotoxina Cromogênica	Thermo Scientific
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
Conjunto DNase livre de RNase	Qiagen	79254
Bicarbonato de Sódio (Pó Branco Fino)	Fisher Chemical	BP328-500
Cloreto de Sódio (Cristalino/Certificado ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (modelo de sonda CL-18; modelo de fonte de alimentação FB50)	Fisher scentific	n/a
Isolador de filme flexível estéril	Classe Biologicamente Limpa	n/a
SYBR™ Mancha de Gel DNA Segura	Invitrogen	S33102
T100 Termociclador	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, Solução 1M, pH 8.0, Grau de Biologia Molecular, Ultrapure	Thermo Scientific
Água, (DNASE, livre de RNASE)	BioReagentes Fisher	BP2484100