T4 bakteriofag og E. coli-interaksjon i murtarmen: En prototypisk modell for å studere vertsbakteriofagdynamikk in vivo

Summary

Bakteriofager (fager), virus som infiserer bakterier, er en integrert del av tarmmikrobiomet. Selv om disse symbiotiske innbyggerne driver bakteriell kondisjon og populasjonsdynamikk, forstås lite om hvordan de påvirker tarmhomeostase og sykdom. Denne protokollen studerer isolerte T4-fager i en musemodell, tilpasningsdyktig til andre fagbakterielle par.

Abstract

Bakteriofager (fager) er virus som infiserer bakterier med arts- og stammenivåspesifisitet og er de mest tallrike biologiske enhetene på tvers av alle kjente økosystemer. Innenfor bakteriesamfunn, som de som finnes i tarmmikrobiotaen, er fager involvert i å regulere mikrobiotapopulasjonsdynamikk og drive bakteriell evolusjon. Det har vært fornyet interesse for fagforskning i det siste tiåret, delvis på grunn av de vertsspesifikke drapsegenskapene til lytiske fager, som tilbyr et lovende verktøy for å motvirke den økende trusselen om antimikrobielle resistente bakterier. Videre tyder nyere studier som viser at fager holder seg til tarmslim på at de kan ha en beskyttende rolle i å forhindre bakteriell invasjon i det underliggende epitelet. Det er viktigere, som bakterielle mikrobiomer, forstyrrede fagomer har vært assosiert med forverrede utfall i sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom. Tidligere studier har vist at fager kan modulere mikrobiomet til dyr og mennesker gjennom fekale filtrattransplantasjoner, til fordel for vertsens helse. Med denne nylige bølgen av forskning kommer nødvendigheten av å etablere og standardisere protokoller for å studere fager i sammenheng med tarmmikrobiomet. Denne protokollen gir et sett med prosedyrer for å studere isolerte T4-fager og deres bakterielle vert, Escherichia coli, i sammenheng med murine gastrointestinaltraktus. Metodene beskrevet her skisserer hvordan man starter fra et faglysat, administrerer det til mus og vurderer effekter på bakteriell vert og fagnivå. Denne protokollen kan modifiseres og brukes på andre fagbakteriepar og gir et utgangspunkt for å studere vertsfagdynamikk in vivo.

Introduction

Bakteriofager, eller fager, er virus som infiserer og dreper bakterier med arts- og stammenivåspesifisitet¹. Fager spiller viktige roller i komplekse bakteriesamfunn som tarmmikrobiota, hvor de har vært involvert i å regulere populasjonsdynamikk og drive bakteriell kondisjon². Gjennom det siste tiåret har det vært fornyet interesse for fagforskning på grunn av økningen av antimikrobielle resistente patogener³, og potensialet for fagterapi som en alternativ behandlingsstrategi. I de senere år har lytiske fagcocktailer blitt brukt intravenøst med en viss suksess i alvorlige, antibiotikaresistente bakterielle septiske infeksjoner hos mennesker ^3,4. Oral fagterapi har også blitt foreslått som et potensielt alternativ til antibiotika for å behandle tarminfeksjoner og betennelser. Videre har fager vært involvert i suksessen til fekale filtrattransplantasjoner (FFT), som er fekale mikrobiotapreparater som har blitt filtrert for å fjerne bakterier, i behandlingen av tilbakevendende Clostridioides difficile-infeksjon (rCDI) ^5,6, inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) ^7,8 og nekrotiserende enterokolitt hos premature griser⁹. Gitt disse resultatene, er det viktig å vurdere interaksjoner både mellom fager og tarmmikrobiota, og fager og pattedyrverten, da tilsetning av nye fager i et eksisterende samfunn kan ha indirekte effekter på samfunnet som helhet, og ikke bare målbakteriene ^2,10.

Studien av faginteraksjoner med deres målbakterier in vitro har vist seg nyttig for å forstå mekanismene og virkningene av- og bakterieinteraksjoner i tarmen. I denne innstillingen har det blitt vist at Escherichia coli-spesifikke T4-fager av rekkefølgen Caudovirales krever immunoglobulin (Ig) -lignende domener lokalisert i svært antigene ytre kapsidproteiner (Hoc) på virionoverflaten for å feste seg til tarmslim¹¹. I tillegg har transwellanalyser vist at T4-fager er i stand til å interagere med epitelcellekulturer og translokere gjennom cellelag ved makropinocytose^12,13. Disse resultatene støtter hypotesen om at fager kan samhandle med deres metazoan vert, selv om de ikke er i stand til å infisere eukaryote celler. Disse modellene, selv om de er nyttige, mangler hele spekteret av komplekse interaksjoner som forekommer i et tarmøkosystem som kreves for en omfattende utforskning av trepartsinteraksjonen mellom fager, bakterier og metazoan-verten.

Musemodeller er et viktig verktøy for å undersøke fager i komplekse miljøer. En ønskelig anvendelse av fagadministrasjon er som en alternativ strategi for å behandle antimikrobielle resistente infeksjoner eller pathobionter assosiert med kroniske inflammatoriske sykdommer, inkludert IBD. Fremvoksende litteratur antyder imidlertid at fagadferd in vitro ikke fullt ut representerer in vivo-funksjoner. Buttimer et ^al.14 viste at en fagcocktail var i stand til å tømme de målrettede bakteriene i et forenklet humant mikrobiotakonsortium in vitro, men kunne ikke replikeres in vivo i gnotobiotiske mus kolonisert med det samme bakteriefagkonsortiet. Videre, i et konvensjonelt musemikrobiom, førte T7-til selektiv uttømming av måltarmbakteriene, selv om gradvis gjenoppretting ble observert over tid, noe som indikerer utviklet motstand¹⁵. Andre studier har vist sameksistens av oralt administrerte fager og deres målbakteriestammer in vivo ^2,16. Faktisk, utover / bakterie sameksistens, førte fagadministrasjon til utbredte endringer i total mikrobiota samfunnssammensetning og funksjon ^2,16. Dette er relevant i sykdomsinnstillinger, da flere studier har funnet sammenhenger mellom økt relativ overflod av Caudovirales og IBD ^7,8,17 som var uavhengige av endringer i bakteriell overflod⁷. Det er fortsatt ukjent om dette er en driver eller konsekvens av sykdomspatogenesen.

Det historiske fokuset på fagundersøkelse har vært rundt forholdet mellom en og dens målbakterie. Det er imidlertid også viktig å vurdere potensielle interaksjoner mellom og slimhinnen, epitelet og immunsystemet til metazoanverten. Disse interaksjonene spiller alle en viktig rolle i den generelle responsen på tarmfaginfeksjon. For å demonstrere dette har fager blitt studert ved hjelp av bakteriefrie (GF) mus for å belyse deres innvirkning på immunsystemet uten forstyrrelser fra mikrobiota⁸. I dette systemet ble fagnukleinsyrer detektert av Toll-lignende reseptorer (TLR) lokalisert i endosomer av fagocytiske immunceller (makrofager og dendrittiske celler). Dette aktiverte nedstrøms signalering og stimulerte T-celleavhengig produksjon av interferon (IFN)-^{γ 8} eller type I IFN¹⁸. Videre impliserte Fluckiger et ^al.19 minne CD8 ⁺ T-celler i anerkjennelsen av fagkodede (profag) antigener, noe som resulterte i T-celle kryssreaktivitet med tumorantigener, noe som resulterte i redusert tumorbelastning. Endelig har fagspesifikk antistoffproduksjon blitt dokumentert i musestudier hvor fager ble levert til dyremodeller på en kontinuerlig måte gjennom drikkevann ^8,20, eller ved gjentatt oral gavage over flere måneder²⁰, som demonstrerer kapasiteten til fagproteiner for å fremme humorale immunresponser. Selv om disse modusene for faginokulasjon tillater optimal og kontinuerlig priming av immunsystemet, kan de ikke representere de naturlig forekommende interaksjonene mellom fager og tarmmiljøet, og heller ikke kinetikken til oralt anvendt fagterapi. Så langt har et begrenset antall studier undersøkt samspillet mellom og en enkelt bakterieart i monokoloniserte musemodeller²¹. Imidlertid viste monokoloniserte mus seg å være kritiske for å dechiffrere mikrobespesifikke effekter av individuelle arter på gastrointestinale (GI) -kanaler og immunutvikling 22,23,24, og de kan ennå vise seg å være nyttige for å forstå trepartsinteraksjoner mellom fager, deres målbakterier og metazoan-verten.

Spennende er det fortsatt mye å lære om samspillet mellom tarmfag og tarmkommensale bakterier, samt samspillet som oppstår mellom metazoan-verten og fagene som bor i den. Denne protokollen gir et sett med prosedyrer for å studere isolert T4-og dens bakterielle motstykke, E. coli (K-12, BW25113), ved hjelp av en gnotobiotisk musemodell. Disse standardiserte prosedyrene gir også grunnlag for å optimalisere andre-/bakteriedyader ved å tilpasse vekstparametrene til interesseparene. Metodene beskrevet her skisserer: (1) Fremstilling av T4 og kjøretøylysater for oral gavage av mus; (2) Oral administrering av T4-til E. coli monokoloniserte gnotobiotiske mus; (3) Overvåking av T4 fagnivåer i mus avføring og vev over tid.

For de representative resultatene som presenteres her, ble rensede T4-faglysater forplantet fra fagbankbestander vedlikeholdt av Rohwer Lab. Phage-on-Tap-metoden for forplantning av T4-ble tilpasset²⁵, som referert i denne protokollen. Metoden gir høye titer, endotoksin-lave fagbestander innen tre dager. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble det rutinemessig samlet inn 10 ml ≥¹⁰ plakkdannende enheter (pfu)/ml T4-med < 0,5 endotoksinenheter (EU)/ml. De anbefalte endotoksinnivåene for oral eller intravenøs administrering til mus er henholdsvis ≤ 20 EU/ml og ≤ 5 EU/kg/time (eller 0,1 EU administrert over 1 time for en 20 g mus), noe som gjør dette til en egnet metode for fagfremstilling for in vivo inokulering. Alle fagbestandene ble lagret ved 4 °C i fagbuffer for saltvann magnesium (SM) (oppskrift gitt i trinn 1.1.5.1). E. coli ble dyrket i LB media. For ulike-bakteriepar kan ulike kulturmedier og vekstbetingelser tilpasses fra denne protokollen. Fager kan også hentes fra miljøet, for eksempel avløpsvann, marint vann, jord og tarminnhold og kan isoleres og renses i henhold til Sambrook og Russell²⁶ før forberedelse ved hjelp av passende vekst- og forplantningsbetingelser for hvert fagvertpar^{av interesse 25}. Alternativt kan fager fås fra kommersielle kilder (se materialtabell) eller fra fagbanker.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av UBC Animal Care Committee og Biosafety Committee-godkjente protokoller (A23-0113, B19-0038). Mus ble plassert ved University of British Columbia under patogenfrie forhold ved Center for Disease Modelling. C57BL/6 mus ble avlet i anlegget i en steril fleksibel filmisolator, utstyrt med steril musediett, vann, sengetøy og hekkemateriale. Musene ble opprettholdt på en 12 timers dag / natt syklus. Eksperimentelle mus, både mannlige og kvinnelige, ble…

Representative Results

For å undersøke interaksjonene mellom T4-fagen/E. coli-dyaden i murintarmen ble T4-og kjøretøylysater fremstilt, rengjort og renset (figur 1A). T4 faglysater ble titerert ved plakkanalyse og fortynnet til 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/mus) i SM-buffer. Kjøretøylysater ble også titered for å bekrefte ingen levedyktig fagtilstedeværelse og fortynnet i samme volum av SM-buffer som T4-faglysatet. Endotoksinnivåene ble kvantifisert i fortynnede lysater ved b…

Discussion

Studien av fager i mikrobiomet gir en betydelig utfordring sammenlignet med deres bakterielle kolleger. Spesielt inneholder fager ikke en konservert fylogenetisk markør som er felles for alle fager som ligner på 16S og 18S ribosomale underenheter som muliggjør enkel sekvensering og identifisering av henholdsvis prokaryote og eukaryote arter, henholdsvis⁴². Imidlertid, med fremskritt innen neste generasjons sekvenseringsmetoder, inkludert økende leselengder, gjennomstrømning og reduserte kostn…

Materials

1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100