Detta protokoll beskriver en pålitlig och effektiv in vitro-modell av hjärnans blodbarriär. Metoden använder cerebrala vaskulära endotelceller bEnd.3 från möss och mäter transmembrant elektriskt motstånd.
Blod-hjärnbarriären (BBB) är en dynamisk fysiologisk struktur som består av mikrovaskulära endotelceller, astrocyter och pericyter. Genom att samordna interaktionen mellan begränsad passage av skadliga ämnen, näringsupptag och metaboliteliminering i hjärnan är BBB avgörande för att bevara centrala nervsystemets homeostas. Att bygga in vitro-modeller av BBB är ett värdefullt verktyg för att utforska patofysiologin för neurologiska sjukdomar och skapa farmakologiska behandlingar. Denna studie beskriver en procedur för att skapa en in vitro monolager BBB-cellmodell genom att plantera bEnd.3-celler i den övre kammaren på en 24-håls platta. För att bedöma integriteten hos cellbarriärfunktionen användes den konventionella epitelcellvoltmetern för att registrera det transmembrana elektriska motståndet hos normala celler och CoCl2-inducerade hypoxiska celler i realtid. Vi förväntar oss att ovanstående experiment kommer att ge effektiva idéer för skapandet av in vitro-modeller av BBB och läkemedel för att behandla sjukdomar i centrala nervsystemet.
BBB är ett unikt biologiskt gränssnitt mellan blodcirkulation och nervvävnad, som består av vaskulära endotelceller, pericyter, astrocyter, neuroner och andra cellulära strukturer1. Flödet av joner, kemikalier och celler mellan blodet och hjärnan regleras strikt av denna barriär. Denna homeostas skyddar nervvävnaderna mot gifter och patogener samtidigt som den möjliggör lämplig drift av hjärnans nerver 2,3. Att upprätthålla BBB:s integritet kan effektivt förhindra utveckling och progression av sjukdomar som påverkar det centrala nervsystemet, såsom neuronal dysfunktion, ödem och neuroinflammation4. De unika fysiologiska egenskaperna hos BBB förhindrar dock att mer än 98 % av småmolekylära läkemedel och 100 % av makromolekylära läkemedel kommer in i det centrala nervsystemet5. Därför är det viktigt att öka penetrationen av läkemedel genom BBB under utvecklingen av läkemedel för det centrala nervsystemet för att uppnå terapeutisk effekt 6,7. Även om datorsimuleringsscreening av substrat avsevärt har ökat sannolikheten för att läkemedelskandidater passerar BBB, behövs fortfarande tillförlitliga och prisvärda in vitro/in vivo BBB-modeller för att möta behoven av vetenskaplig forskning8.
En snabb och prisvärd teknik för läkemedelsscreening med hög kapacitet är in vitro-modell 9. För att belysa de grundläggande processerna för läkemedels effekter på BBB-funktion och deras roll i utveckling och progression av sjukdom har en serie förenklade in vitro-modeller skapats. För närvarande är de vanliga in vitro BBB-modellerna monolager-, samkultur-, dynamiska och mikrofluidiska modeller 10,11,12, konstruerade av vaskulära endotelceller och astrocyter, pericyter eller mikroglia 13,14. Även om 3D-cellkulturer är mer i linje med den fysiologiska strukturen hos BBB15, är deras tillämpning som ett sätt att screena läkemedel för BBB fortfarande begränsad av deras intrikata design och undermåliga reproducerbarhet. Däremot är monolagermodellen in vitro den som oftast används för att undersöka BBB och är tillämplig för att bestämma uttrycket av membrantransportörer och tight junction-proteiner i vissa celler.
Mätning av transmembrant elektriskt motstånd (TEER) är en teknik för att utvärdera och övervaka cellskiktet över motståndet och utvärdera barriärens cellintegritet och permeabilitet. Genom att samtidigt föra in två elektroder i odlingsmediet eller buffertlösningen på vardera sidan av monolagret är det möjligt att mäta växelströmmen eller den elektriska impedansen genom cellens kompakta skikt16,17. För att avgöra om in vitro-BBB-modellen har skapats på ett korrekt sätt kommer mätningen av TEER vanligtvis att användas som guldstandard18. Å andra sidan kan trenden för läkemedelsverkan på BBB-permeabilitet exakt förutsägas genom att mäta förändringen i celskiktets elektriska motstånd efter läkemedelsinblandning19. Till exempel upptäckte Feng et al. att catalpol (den primära aktiva monomeren av rehmanniae) effektivt kunde vända den lipopolysackaridinducerade nedregleringen av tight junction-proteiner i BBB och höja TEER-värdet i mushjärnans endotelcellslager20.
Det neuroinflammatoriska svaret är vanligtvis den främsta orsaken till BBB-homeostasobalans21. Hypoxisk behandling för att inducera neuroinflammatorisk skada är den huvudsakliga metoden för att förstöra blod-hjärnbarriären, främst inklusive fysikaliska metoder och kemiska reagensmetoder. Den förstnämnda använder främst en tregasinkubator för att variera syrehalten i celltillväxtmiljön för att simulera hypoxiska förhållanden22, medan den senare uppnås genom att artificiellt introducera deoxireagenser såsom CoCl2 till cellodlingsmediet23. Cellerna kommer att förbli i ett syrefattigt tillstånd om Fe2+ ersätts med Co2+ i hemet. Om Fe2+ substitueras med Co2+ i den katalytiska gruppen hämmas prolinhydroxylas- och aspartathydroxylasaktiviteten, vilket resulterar i en ackumulering av hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α)24. Under ihållande hypoxi utlöser defosforyleringen av HIF-1α i cytoplasman celldöd och aktiverar vaskulär endotelial tillväxtfaktor, vilket i slutändan ökar vaskulär permeabilitet. I tidigare studier 25,26 har det väl visats att hypoxi signifikant kan minska uttrycket av endoteliala tight junction-proteiner för att öka permeabiliteten av BBB. I denna studie mättes tidsresistanskurvan för bEnd.3-celler sådda i 24-hålsplattor för att skapa en enkel BBB-modell. Med hjälp av denna modell karakteriserade vi förändringarna i cell-TEER efter CoCl2-intervention för att konstruera en cellmodell som kan användas för att screena läkemedel för BBB-skydd.
Hjärnan är ett av de mest utvecklade kroppsorganen och styr ett brett spektrum av intrikata fysiologiska processer, inklusive minne, kognition, hörsel, luktoch rörelse. Hjärnan är ett av människokroppens mest komplicerade och sjuka organ på samma gång. Förekomsten av många sjukdomar i centrala nervsystemet visar en ökande tendens från år till år på grund av faktorer som luftföroreningar, oregelbundna matvanor och andra faktorer 27,28,29.<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Vi uppskattar det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (82274207 och 82104533), Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) och Xinglin Scholar Research Promotion Project vid Chengdu University of TCM (XKTD2022013).
24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |