JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Registrering av barriärfunktionell integritet på bEnd.3 vaskulära endotelceller via transendotelial elektrisk motståndsdetektering

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65938
, , , , , , ,
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy,Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver en pålitlig och effektiv in vitro-modell av hjärnans blodbarriär. Metoden använder cerebrala vaskulära endotelceller bEnd.3 från möss och mäter transmembrant elektriskt motstånd.

Abstract

Blod-hjärnbarriären (BBB) är en dynamisk fysiologisk struktur som består av mikrovaskulära endotelceller, astrocyter och pericyter. Genom att samordna interaktionen mellan begränsad passage av skadliga ämnen, näringsupptag och metaboliteliminering i hjärnan är BBB avgörande för att bevara centrala nervsystemets homeostas. Att bygga in vitro-modeller av BBB är ett värdefullt verktyg för att utforska patofysiologin för neurologiska sjukdomar och skapa farmakologiska behandlingar. Denna studie beskriver en procedur för att skapa en in vitro monolager BBB-cellmodell genom att plantera bEnd.3-celler i den övre kammaren på en 24-håls platta. För att bedöma integriteten hos cellbarriärfunktionen användes den konventionella epitelcellvoltmetern för att registrera det transmembrana elektriska motståndet hos normala celler och CoCl2-inducerade hypoxiska celler i realtid. Vi förväntar oss att ovanstående experiment kommer att ge effektiva idéer för skapandet av in vitro-modeller av BBB och läkemedel för att behandla sjukdomar i centrala nervsystemet.

Introduction

BBB är ett unikt biologiskt gränssnitt mellan blodcirkulation och nervvävnad, som består av vaskulära endotelceller, pericyter, astrocyter, neuroner och andra cellulära strukturer1. Flödet av joner, kemikalier och celler mellan blodet och hjärnan regleras strikt av denna barriär. Denna homeostas skyddar nervvävnaderna mot gifter och patogener samtidigt som den möjliggör lämplig drift av hjärnans nerver 2,3. Att upprätthålla BBB:s integritet kan effektivt förhindra utveckling och progression av sjukdomar som påverkar det centrala nervsystemet, såsom neuronal dysfunktion, ödem och neuroinflammation4. De unika fysiologiska egenskaperna hos BBB förhindrar dock att mer än 98 % av småmolekylära läkemedel och 100 % av makromolekylära läkemedel kommer in i det centrala nervsystemet5. Därför är det viktigt att öka penetrationen av läkemedel genom BBB under utvecklingen av läkemedel för det centrala nervsystemet för att uppnå terapeutisk effekt 6,7. Även om datorsimuleringsscreening av substrat avsevärt har ökat sannolikheten för att läkemedelskandidater passerar BBB, behövs fortfarande tillförlitliga och prisvärda in vitro/in vivo BBB-modeller för att möta behoven av vetenskaplig forskning8.

En snabb och prisvärd teknik för läkemedelsscreening med hög kapacitet är in vitro-modell 9. För att belysa de grundläggande processerna för läkemedels effekter på BBB-funktion och deras roll i utveckling och progression av sjukdom har en serie förenklade in vitro-modeller skapats. För närvarande är de vanliga in vitro BBB-modellerna monolager-, samkultur-, dynamiska och mikrofluidiska modeller 10,11,12, konstruerade av vaskulära endotelceller och astrocyter, pericyter eller mikroglia 13,14. Även om 3D-cellkulturer är mer i linje med den fysiologiska strukturen hos BBB15, är deras tillämpning som ett sätt att screena läkemedel för BBB fortfarande begränsad av deras intrikata design och undermåliga reproducerbarhet. Däremot är monolagermodellen in vitro den som oftast används för att undersöka BBB och är tillämplig för att bestämma uttrycket av membrantransportörer och tight junction-proteiner i vissa celler.

Mätning av transmembrant elektriskt motstånd (TEER) är en teknik för att utvärdera och övervaka cellskiktet över motståndet och utvärdera barriärens cellintegritet och permeabilitet. Genom att samtidigt föra in två elektroder i odlingsmediet eller buffertlösningen på vardera sidan av monolagret är det möjligt att mäta växelströmmen eller den elektriska impedansen genom cellens kompakta skikt16,17. För att avgöra om in vitro-BBB-modellen har skapats på ett korrekt sätt kommer mätningen av TEER vanligtvis att användas som guldstandard18. Å andra sidan kan trenden för läkemedelsverkan på BBB-permeabilitet exakt förutsägas genom att mäta förändringen i celskiktets elektriska motstånd efter läkemedelsinblandning19. Till exempel upptäckte Feng et al. att catalpol (den primära aktiva monomeren av rehmanniae) effektivt kunde vända den lipopolysackaridinducerade nedregleringen av tight junction-proteiner i BBB och höja TEER-värdet i mushjärnans endotelcellslager20.

Det neuroinflammatoriska svaret är vanligtvis den främsta orsaken till BBB-homeostasobalans21. Hypoxisk behandling för att inducera neuroinflammatorisk skada är den huvudsakliga metoden för att förstöra blod-hjärnbarriären, främst inklusive fysikaliska metoder och kemiska reagensmetoder. Den förstnämnda använder främst en tregasinkubator för att variera syrehalten i celltillväxtmiljön för att simulera hypoxiska förhållanden22, medan den senare uppnås genom att artificiellt introducera deoxireagenser såsom CoCl2 till cellodlingsmediet23. Cellerna kommer att förbli i ett syrefattigt tillstånd om Fe2+ ersätts med Co2+ i hemet. Om Fe2+ substitueras med Co2+ i den katalytiska gruppen hämmas prolinhydroxylas- och aspartathydroxylasaktiviteten, vilket resulterar i en ackumulering av hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α)24. Under ihållande hypoxi utlöser defosforyleringen av HIF-1α i cytoplasman celldöd och aktiverar vaskulär endotelial tillväxtfaktor, vilket i slutändan ökar vaskulär permeabilitet. I tidigare studier 25,26 har det väl visats att hypoxi signifikant kan minska uttrycket av endoteliala tight junction-proteiner för att öka permeabiliteten av BBB. I denna studie mättes tidsresistanskurvan för bEnd.3-celler sådda i 24-hålsplattor för att skapa en enkel BBB-modell. Med hjälp av denna modell karakteriserade vi förändringarna i cell-TEER efter CoCl2-intervention för att konstruera en cellmodell som kan användas för att screena läkemedel för BBB-skydd.

Protocol

OBS: Endotelceller från mushjärna.3 (bEnd.3) inokulerades i kamrarna på en 24-hålsplatta för att konstruera en enkel in vitro-modell av BBB under specifika mediumförhållanden. TEER för normala celler och hypoxiska celler mättes med TEER-mätare (figur 1 och figur 2). 1. Beredning av lösningen Bered DMEM-cellodlingsmediet som innehåller FBS (10 %, v/v), 100 E/ml penicillin och 10 mg/ml str…

Representative Results

Detta protokoll gjorde det möjligt att registrera förändringar i cellernas resistansvärden enligt de parametrar som ställts in i transendotelresistormätaren. Viaabiliteten hos bEnd.3-celler (antal levande celler) som behandlades med olika koncentrationer av CoCl2 screenades med CCK-8-analys. Större cellskador orsakade av CoCl2 representerades av lägre cellviabilitet. Vi fann att 300 μM CoCl2 var signifikant cytotoxiskt in vitro, och denna koncentration användes för de …

Discussion

Hjärnan är ett av de mest utvecklade kroppsorganen och styr ett brett spektrum av intrikata fysiologiska processer, inklusive minne, kognition, hörsel, luktoch rörelse. Hjärnan är ett av människokroppens mest komplicerade och sjuka organ på samma gång. Förekomsten av många sjukdomar i centrala nervsystemet visar en ökande tendens från år till år på grund av faktorer som luftföroreningar, oregelbundna matvanor och andra faktorer 27,28,29.<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi uppskattar det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (82274207 och 82104533), Key Research and Development Program of Ningxia (2023BEG02012) och Xinglin Scholar Research Promotion Project vid Chengdu University of TCM (XKTD2022013).

Materials

24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
  2. Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
  3. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
  4. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
  5. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
  6. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
  7. Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
  8. Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
  11. Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
  12. Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
  13. Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
  16. Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
  17. Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
  18. Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
  19. Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
  20. Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
  21. Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
  22. Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
  23. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  24. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
  25. Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
  26. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  27. Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
  28. Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
  29. Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
  30. Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
  31. Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
  32. Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
  33. Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
  34. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  35. Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
  36. Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
  39. Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).

Tags

Blood-brain BarrierBBB ModelBEnd.3 CellsTransendothelial Electrical Resistance (TEER)Barrier IntegrityCell PermeabilityIn Vitro ModelCentral Nervous SystemDrug ScreeningHypoxia
check_url/65938?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image