Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial
Summary
Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.
Abstract
A barreira hematoencefálica (BHE) é uma estrutura fisiológica dinâmica composta por células endoteliais microvasculares, astrócitos e pericitos. Ao coordenar a interação entre o trânsito restrito de substâncias nocivas, a absorção de nutrientes e a depuração de metabólitos no cérebro, a BHE é essencial na preservação da homeostase do sistema nervoso central. A construção de modelos in vitro do BBB é uma ferramenta valiosa para explorar a fisiopatologia de distúrbios neurológicos e criar tratamentos farmacológicos. Este estudo descreve um procedimento para criar um modelo in vitro de células BBB monocamada por semeadura de células bEnd.3 na câmara superior de uma placa de 24 poços. Para avaliar a integridade da função de barreira celular, o voltímetro de células epiteliais convencional foi usado para registrar a resistência elétrica transmembrana de células normais e hipóxicas induzidas por CoCl2 em tempo real. Antecipamos que os experimentos acima fornecerão ideias eficazes para a criação de modelos in vitro de BBB e drogas para tratar distúrbios de doenças do sistema nervoso central.
Introduction
A BHE é uma interface biológica única entre a circulação sanguínea e o tecido nervoso, que é composto por células endoteliais vasculares, pericitos, astrócitos, neurônios e outras estruturas celulares1. O fluxo de íons, produtos químicos e células entre o sangue e o cérebro é estritamente regulado por essa barreira. Essa homeostase protege os tecidos nervosos contra toxinas e patógenos, além de permitir o funcionamento adequado dos nervos cerebrais 2,3. A manutenção da integridade da BHE pode efetivamente prevenir o desenvolvimento e a progressão de distúrbios que afetam o sistema nervoso central, como disfunção neuronal, edema e neuroinflamação4. No entanto, as propriedades fisiológicas únicas da BHE impedem que mais de 98% dos medicamentos de pequenas moléculas e 100% dos fármacos macromoleculares entrem no sistema nervoso central5. Portanto, aumentar a penetração de medicamentos através da BHE durante o desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central é essencial para alcançar a eficácia terapêutica 6,7. Embora a triagem de substratos por simulação computacional tenha aumentado significativamente a probabilidade de candidatos a fármacos cruzarem o BBB, modelos de BBB confiáveis e acessíveis in vitro/in vivo ainda são necessários para atender às necessidades da pesquisa científica8.
Uma técnica rápida e acessível para triagem de fármacos em alto rendimento é o modelo in vitro 9. Para lançar luz sobre os processos fundamentais dos efeitos dos medicamentos na função BBB e sua participação no desenvolvimento e progressão da doença, uma série de modelos simplificados in vitro de BBB foi criada. Atualmente, os modelos de BHE in vitro comuns são os modelos monocamada, co-cultura, dinâmico e microfluídico 10,11,12, construídos por células endoteliais vasculares e astrócitos, pericitos ou micróglia 13,14. Embora as culturas de células 3D estejam mais alinhadas com a estrutura fisiológica do BBB15, sua aplicação como meio de triagem de drogas para BBB ainda é limitada por seu design intrincado e reprodutibilidade inferior. Em contraste, o modelo in vitro de monocamada é o mais frequentemente utilizado para pesquisar a BBB e é aplicável para determinar a expressão de transportadores de membrana e proteínas de junção apertada em células específicas.
A medição da resistência elétrica transmembrana (TEER) é uma técnica para avaliar e monitorar a camada de células através da resistência e avaliar a integridade celular e a permeabilidade da barreira. Inserindo-se simultaneamente dois eletrodos no meio de crescimento ou solução tampão de cada lado da monocamada, é possível medir a corrente alternada ou a impedância elétrica através da camada compacta da célula 16,17. Para determinar se o modelo de BBB in vitro foi adequadamente criado, a mensuração do TEER será usualmente empregada como padrão-ouro18. Por outro lado, a tendência da ação do medicamento sobre a permeabilidade da BHE pode ser predita com precisão medindo-se a mudança na resistência elétrica da camada celular após o envolvimento da droga19. Por exemplo, Feng e col. descobriram que o catalpol (o monômero ativo primário de rehmanniae) poderia efetivamente reverter a regulação negativa induzida por lipopolissacarídeo de proteínas de junção apertada no BBB e aumentar o valor TEER da camada de células endoteliais cerebrais de camundongos20.
A resposta neuroinflamatória costuma ser a principal causa de desequilíbrio da homeostase BBB21. O tratamento hipóxico para induzir lesão neuroinflamatória é o principal método para destruir a barreira hematoencefálica, incluindo principalmente métodos físicos e métodos de reagentes químicos. A primeira utiliza primariamente uma incubadora de três gases para variar o conteúdo de oxigênio no ambiente de crescimento celular para simular condições hipóxicas22, enquanto a segunda é obtida pela introdução artificial de reagentes desoxi como a CoCl2 no meio de cultura celular23. As células permanecerão em uma condição desoxigenada se Fe2+ for substituído por Co2+ no heme. Se o Fe2+ for substituído por Co2+ no grupo catalítico, a atividade da prolina hidroxilase e do aspartato hidroxilase será inibida, resultando em um acúmulo do fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α)24. Sob hipóxia persistente, a desfosforilação do HIF-1α no citoplasma desencadeia a morte celular e ativa o fator de crescimento endotelial vascular, o que, em última instância, eleva a permeabilidade vascular. Em estudos prévios25,26, foi bem demonstrado que a hipóxia pode reduzir significativamente a expressão de proteínas de tight junction endotelial para aumentar a permeabilidade da BHE. Neste estudo, a curva de resistência temporal de células bEnd.3 semeadas em placas de 24 poços foi medida para criar um modelo de BBB simples. Usando este modelo, caracterizamos as mudanças na célula TEER após a intervenção com CoCl2, a fim de construir um modelo celular que possa ser usado para rastrear drogas para proteção BBB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dos órgãos corporais mais desenvolvidos, o cérebro controla uma ampla gama de processos fisiológicos intrincados, incluindo memória, cognição, audição, olfato e movimento27. O cérebro é um dos órgãos mais complicados e doentes do corpo humano ao mesmo tempo. A ocorrência de muitas doenças do sistema nervoso central apresenta tendência crescente ano após ano devido a fatores como poluição do ar, padrões alimentares irregulares e outros fatores 27,28,29…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274207 e 82104533), do Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Ningxia (2023BEG02012) e do Projeto de Promoção de Pesquisa Acadêmica Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
