JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65938
, , , , , , ,
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy,Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar en efficiënt in vitro model van de bloedbarrière van de hersenen. De methode maakt gebruik van cerebrale vasculaire endotheelcellen bEnd.3 van muizen en meet de transmembraan elektrische weerstand.

Abstract

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een dynamische fysiologische structuur die bestaat uit microvasculaire endotheelcellen, astrocyten en pericyten. Door de interactie tussen beperkte doorvoer van schadelijke stoffen, opname van voedingsstoffen en metabolietklaring in de hersenen te coördineren, is de BBB essentieel voor het behoud van de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Het bouwen van in vitro modellen van de BBB is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van de pathofysiologie van neurologische aandoeningen en het creëren van farmacologische behandelingen. Deze studie beschrijft een procedure voor het maken van een in vitro monolaag BBB-celmodel door bEnd.3-cellen in de bovenste kamer van een plaat met 24 putjes te zaaien. Om de integriteit van de celbarrièrefunctie te beoordelen, werd de conventionele epitheelcelvoltmeter gebruikt om de transmembraan elektrische weerstand van normale cellen en CoCl 2-geïnduceerde hypoxische cellen in realtime vast te leggen. We verwachten dat de bovenstaande experimenten effectieve ideeën zullen opleveren voor het maken van in vitro modellen van BBB en geneesmiddelen voor de behandeling van aandoeningen van ziekten van het centrale zenuwstelsel.

Introduction

BBB is een unieke biologische interface tussen bloedcirculatie en zenuwweefsel, die is samengesteld uit vasculaire endotheelcellen, pericyten, astrocyten, neuronen en andere cellulairestructuren1. De stroom van ionen, chemicaliën en cellen tussen het bloed en de hersenen wordt strikt gereguleerd door deze barrière. Deze homeostase beschermt de zenuwweefsels tegen gifstoffen en ziekteverwekkers en maakt tegelijkertijd de juiste werking van de zenuwen van de hersenen mogelijk 2,3. Het handhaven van de integriteit van de BBB kan de ontwikkeling en progressie van aandoeningen die het centrale zenuwstelsel aantasten, zoals neuronale disfunctie, oedeem en neuro-inflammatie, effectief voorkomen. De unieke fysiologische eigenschappen van de BBB voorkomen echter dat meer dan 98% van de medicijnen met kleine moleculen en 100% van de macromoleculaire geneesmiddelen het centrale zenuwstelselbinnendringen. Daarom is het verhogen van de penetratie van medicijnen via de BBB tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel essentieel voor het bereiken van therapeutische werkzaamheid 6,7. Hoewel computersimulatiescreening van substraten de kans dat kandidaat-geneesmiddelen de BBB overschrijden aanzienlijk heeft verhoogd, zijn betrouwbare en betaalbare in vitro/in vivo BBB-modellen nog steeds nodig om aan de behoeften van wetenschappelijk onderzoek te voldoen8.

Een snelle en betaalbare techniek voor high-throughput drug screening is het in vitro model9. Om licht te werpen op de fundamentele processen van de effecten van geneesmiddelen op de BBB-functie en hun rol in de ontwikkeling en progressie van ziekten, is een reeks vereenvoudigde in vitro BBB-modellen gemaakt. Op dit moment zijn de gebruikelijke in vitro BBB-modellen de monolaag-, co-cultuur-, dynamische en microfluïdische modellen 10,11,12, geconstrueerd door vasculaire endotheelcellen en astrocyten, pericyten of microglia 13,14. Hoewel 3D-celculturen meer in overeenstemming zijn met de fysiologische structuur van BBB15, wordt hun toepassing als middel voor het screenen van geneesmiddelen op BBB nog steeds beperkt door hun ingewikkelde ontwerp en ondermaatse reproduceerbaarheid. Het monolayer in vitro model daarentegen wordt het meest gebruikt om de BBB te onderzoeken en is toepasbaar voor het bepalen van de expressie van membraantransporters en tight junction eiwitten in bepaalde cellen.

Transmembraan elektrische weerstandsmeting (TEER) is een techniek om de cellaag over de weerstand te evalueren en te bewaken en de celintegriteit en permeabiliteit van de barrière te evalueren. Door tegelijkertijd twee elektroden in het groeimedium of de bufferoplossing aan weerszijden van de monolaag te plaatsen, is het mogelijk om de wisselstroom of elektrische impedantie door de compacte laag van de cel te meten 16,17. Om te bepalen of het in vitro BBB-model op de juiste manier is gemaakt, zal de meting van TEER meestal worden gebruikt als de gouden standaard18. Aan de andere kant kan de trend van medicatie-actie op BBB-permeabiliteit nauwkeurig worden voorspeld door de verandering in elektrische weerstand van de cellaag na betrokkenheid van het geneesmiddel te meten19. Feng et al. ontdekten bijvoorbeeld dat catalpol (het primaire actieve monomeer van rehmanniae) de door lipopolysaccharide geïnduceerde neerwaartse regulatie van tight junction-eiwitten in de BBB effectief kon omkeren en de TEER-waarde van de endotheelcellaag20 van de muizenhersenen kon verhogen.

De neuro-inflammatoire reactie is meestal de belangrijkste oorzaak van een verstoring van de BBB-homeostase21. Hypoxische behandeling om neuro-inflammatoir letsel te induceren is de belangrijkste methode om de bloed-hersenbarrière te vernietigen, voornamelijk met inbegrip van fysische methoden en chemische reagensmethoden. De eerste maakt voornamelijk gebruik van een incubator met drie gassen om het zuurstofgehalte in de celgroeiomgeving te variëren om hypoxische omstandigheden te simuleren22, terwijl de laatste wordt bereikt door kunstmatig deoxyreagentia zoals CoCl2 in het celkweekmediumte introduceren 23. De cellen blijven zuurstofarm als Co2+ in het heem wordt vervangen door Fe2+. Als Fe2+ wordt gesubstitueerd door Co2+ in de katalytische groep, wordt de activiteit van prolinehydroxylase en aspartaathydroxylase geremd, wat resulteert in een accumulatie van hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α)24. Bij aanhoudende hypoxie veroorzaakt de defosforylering van HIF-1α in het cytoplasma celdood en activeert de vasculaire endotheliale groeifactor, die uiteindelijk de vasculaire permeabiliteit verhoogt. In eerdere studies 25,26 is goed aangetoond dat hypoxie de expressie van endotheliale tight junction-eiwitten aanzienlijk kan verminderen om de permeabiliteit van BBB te vergroten. In deze studie werd de tijdweerstandscurve van bEnd.3-cellen gezaaid in platen met 24 putjes gemeten om een eenvoudig BBB-model te creëren. Met behulp van dit model hebben we de veranderingen in cel-TEER na CoCl2-interventie gekarakteriseerd om een celmodel te construeren dat kan worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen op BBB-bescherming.

Protocol

OPMERKING: Van de hersenen van muizen afgeleide endotheelcellen.3 (bEnd.3) werden geïnoculeerd in de kamers van een plaat met 24 putjes om een eenvoudig in vitro model van BBB te construeren onder specifieke mediumomstandigheden. De TEER van normale cellen en hypoxische cellen werd gemeten met een TEER-meter (Figuur 1 en Figuur 2). 1. Voorbereiding van de oplossing Bereid het DMEM-celkweekmedium da…

Representative Results

Dit protocol maakte het mogelijk om veranderingen in de weerstandswaarden van cellen te registreren volgens de parameters die waren ingesteld in de transendotheelweerstandsmeter. De levensvatbaarheid van bEnd.3-cellen (aantal levende cellen) die met verschillende concentraties CoCl2 werden behandeld, werd gescreend door middel van een CCK-8-test. Grotere celbeschadiging veroorzaakt door CoCl2 werd vertegenwoordigd door een lagere levensvatbaarheid van de cellen. We ontdekten dat 300 μM CoCl2</…

Discussion

De hersenen zijn een van de meest ontwikkelde lichaamsorganen en regelen een breed scala aan ingewikkelde fysiologische processen, waaronder geheugen, cognitie, gehoor, geuren beweging. De hersenen zijn tegelijkertijd een van de meest gecompliceerde en zieke organen van het menselijk lichaam. Het voorkomen van veel aandoeningen van het centrale zenuwstelsel vertoont jaar na jaar een groeiende tendens als gevolg van factoren zoals luchtvervuiling, onregelmatige eetpatronen en andere factoren 27,28,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We waarderen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82274207 en 82104533), het Key Research and Development Program van Ningxia (2023BEG02012) en het Xinglin Scholar Research Promotion Project van de Chengdu University of TCM (XKTD2022013).

Materials

24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
  2. Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
  3. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
  4. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
  5. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
  6. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
  7. Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
  8. Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
  11. Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
  12. Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
  13. Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
  16. Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
  17. Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
  18. Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
  19. Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
  20. Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
  21. Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
  22. Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
  23. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  24. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
  25. Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
  26. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  27. Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
  28. Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
  29. Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
  30. Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
  31. Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
  32. Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
  33. Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
  34. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  35. Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
  36. Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
  39. Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).

Tags

Keywords: Blood-brain BarrierBBB ModelBEnd.3 CellsTransendothelial Electrical Resistance (TEER)Barrier IntegrityCell PermeabilityIn Vitro ModelCentral Nervous SystemDrug ScreeningHypoxia
check_url/65938?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image