Summary
Внеклеточные везикулы имеют огромные перспективы для биомедицинских применений, но современные методы выделения отнимают много времени и непрактичны для клинического использования. В этом исследовании мы представляем микрофлюидное устройство, которое позволяет напрямую выделять внеклеточные везикулы из больших объемов биожидкостей в непрерывном режиме с минимальными шагами.
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) обладают огромным потенциалом для различных биомедицинских применений, включая диагностику, доставку лекарств и регенеративную медицину. Тем не менее, существующие методики изоляции электромобилей представляют собой значительные проблемы, такие как сложность, затраты времени и необходимость громоздкого оборудования, что затрудняет их клиническую трансляцию. Чтобы устранить эти ограничения, мы стремились разработать инновационную микрофлюидную систему на основе тиол-ена с циклическим сополимером олефинов вне стехиометрии (COC-OSTE) для эффективной изоляции ВВ из образцов большого объема в непрерывном режиме. Используя разделение на основе размера и плавучести, технология, использованная в этом исследовании, позволила добиться значительно более узкого распределения по размерам по сравнению с существующими подходами на основе образцов мочи и клеточных сред, что позволило нацеливаться на конкретные размерные фракции EV в будущих приложениях. Наша инновационная конструкция микрофлюидного устройства COC-OSTE, использующая технологию фракционирования с раздвоением асимметричного потока в поле, предлагает простой и непрерывный подход к изоляции EV для образцов большого объема. Кроме того, потенциал для массового производства этого микрофлюидного устройства обеспечивает масштабируемость и согласованность, что делает возможным интеграцию изоляции электромобилей в рутинную клиническую диагностику и промышленные процессы, где высокая согласованность и пропускная способность являются важными требованиями.
Introduction
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой клеточные мембраносвязанные частицы, состоящие из двух основных типов: экзосомы (30-200 нм) и микровезикулы (200-1000 нм)1. Экзосомы образуются путем почкования эндосомальной мембраны внутрь в мультивезикулярном теле (МВБ), высвобождая внутрипросветные везикулы (РКН) во внеклеточное пространство при слиянии с плазматической мембраной1. Напротив, микровезикулы образуются в результате почкования наружу и деления клеточной мембраны2. ВВ играют решающую роль в межклеточной коммуникации, транспортируя белки, нуклеиновые кислоты, липиды и метаболиты, отражая физиологическое состояние клетки, включая рост, ангиогенез, метастазирование, пролиферацию и резистентность к терапии3. В результате они стали многообещающими биомаркерами и терапевтическими мишенями для лечения заболеваний, включая рак, что подчеркивает их потенциал в системах диагностики и доставки лекарств4.
Для полноценного использования электромобилей в диагностике и лечении заболеваний решающее значение имеет эффективная изоляция от различных биожидкостей5. К распространенным методам относятся ультрацентрифугирование (UC), центрифугирование с градиентом плотности, эксклюзионная хроматография (SEC), фильтрация и иммуноизоляция6. UC является широко используемым методом, но может давать частицы аналогичной плотности, которые не являются ВВ, и могут генерировать агрегаты ВВ7. Компания SEC завоевала популярность благодаря своей способности предоставлять образцы более высокой чистоты, исключая частицы на основе размера, а не плотности8. Тем не менее, тщательный выбор подходящего размера пор для колонки SEC и оптимизация условий хроматографии имеют важное значение для минимизации совместного выделения нежелательных частиц, таких как хиломикроны и липопротеины низкой плотности8. Несмотря на свою эффективность, оба метода отнимают много времени и сложны в автоматизации, особенно для образцов большого объема, таких как клеточные среды или моча, что ограничивает их масштабируемость для промышленного применения9.
В последние годы асимметричное фракционирование поля потока (A4F) превратилось в мощный метод разделения частиц микро- и нанометровых размеров на основе размера и плавучести10. Принцип действия A4F основан на микрофлюидном канале, в основании которого находится пористая мембрана, создающая силу, действующую на мембрану, называемую поперечным потоком10. В сочетании с броуновским движением и потоком Пуазейля, присущими системе, поперечный поток способствует эффективному разделению частиц за счет изменения положения частиц в динамике потока11. Несмотря на преимущества, этот метод ограничен объемами образцов в пределах микролитрового диапазона12 и требует дополнительной стадии фокусировки, что увеличивает продолжительность процесса10.
За последнее десятилетие микрофлюидика приобрела известность как инструмент для быстрого, эффективного и клинически надежного разделения EV13. Однако большинство микрофлюидных методов, предназначенных для разделения ВВ, оптимизированы для образцов ВВ небольшого объема с высокой концентрацией или зависят от сложных процедур разделения14. Кроме того, в области микрофлюидики полидиметилсилоксан (ПДМС) признан золотым стандартом благодаря своей оптической прозрачности, биосовместимости и простоте использования15. Тем не менее, его известная склонность поглощать небольшие липофильные молекулы, включая ВВ, может быть проблематичной для его применения в области ВВ13.
Циклический сополимер олефинов (КОК) является часто используемым материалом в микрофлюидике из-за биосовместимости, малого поглощения молекул и высокой химической стойкости15. Однако изготовление устройств КОК часто связано со сложными процессами или специализированным оборудованием16. В качестве альтернативы, внестехиометрический тиол-ен (ОСТЭ) является многообещающей альтернативой PDMS из-за снижения абсорбции малых молекул, превосходной химической стабильности, простоты изготовления и масштабируемого процесса изготовления17,18. Однако из-за сложных соединений с трубками устройства могут быть подвержены утечкам19.
Целью данного исследования было спроектировать и изготовить микрофлюидное устройство, сочетающее в себе OSTE и COC и раздвоенный принцип A4F для отделения EV от образцов большого объема, таких как моча или клеточные среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Отбор проб был одобрен Комиссией по этике исследований в области жизни и медицины Латвийского университета (решение N0-71-35/54)
ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, использованные в этом исследовании, включены в файл Table of Materials .
1. Изготовление трехмерных (3D) печатных пресс-форм
- Спроектируйте в программном обеспечении САПР двойную негативную форму в форме змея со следующими размерами для верхнего канала: высота 0,5 мм, ширина 1 мм и длина 210 мм. Для нижнего канала используйте такую же конструкцию шириной 1,5 мм, высотой 0,6 мм и длиной 210 мм. Такие размеры, как ширина, длина, высота и изометрическая иллюстрация конструкции, показаны на рисунке 1. Сохраните дизайн в формате .stl.
- Подготовьте файл в Z-Suite; Поддержка не требуется. Напечатайте формы с помощью 3D-принтера на ультрафиолетовом жидкокристаллическом дисплее (УФ-ЖК) с прочной черной смолой.
- После печати осторожно снимите формы с поверхности принтера. Вымойте формы в изопропаноле (IPA) при ультразвуковой обработке в течение 20 мин.
- Высушите формы феном с помощью N2.
- Подвергните формы воздействию воды с помощью фильтра ND33 в течение 810 с, затем поместите их в духовку при температуре 60 °C на 48 часов.
2. Подготовка пресс-форм PDMS
- Весьте PDMS в соотношении 10:1 (для каждой формы используйте 16 г эластомерной основы и 1,6 г сшивающего агента). Смешайте компоненты в планетарном центробежном смесителе, перемешивая в течение 1 мин при 500 об/мин.
- Разлить смешанный PDMS в формы, напечатанные на 3D-принтере, и дегазировать в вакуумном эксикаторе при давлении -800 мбар в течение 30 минут или до тех пор, пока не исчезнут пузырьки.
- Осторожно поместите поливинилхлоридный вкладыш толщиной 100 мкм поверх жидкого PDMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наносите лайнер медленно с одной стороны на другую, чтобы избежать образования пузырьков. - Вставьте пресс-форму с PDMS в приспособление для пресс-формы и затяните зажимной приспособление с помощью динамометрического ключа, установленного на 0,3 Нм.
- Поместите приспособление в духовку при температуре 60 °C на 3 часа для отверждения PDMS.
- Разберите приспособление с помощью шестигранного ключа и извлеките из него напечатанную на 3D-принтере форму.
- Осторожно извлеките пресс-формы PDMS из мастер-форм, напечатанных на 3D-принтере, проведя по краям формы скальпелем, затем удалив форму пинцетом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более легкого удаления пресс-формы можно использовать IPA; однако после этого формы необходимо нагревать до 60 °C в течение 10 минут, чтобы испарить излишки изопропилового спирта.
3. Подготовка верхнего канала OSTE-COC
- Масса ОСТЭ при соотношении 1,09:1 w/w (для 5 приборов необходимо 1,56 г части А и 1,44 г части B). Смешайте компоненты в планетарном центробежном смесителе: перемешивайте в течение 5 минут при 750 об/мин, затем дегазируйте в течение 5 мин при 750 об/мин.
- Переложите смешанный ОСТЭ в центрифужную пробирку и дегазируйте при -800 мбар в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин.
- Очистите предметные стекла COC с помощью 2 x 16 мини-коннекторов Луэра с помощью ультразвуковой обработки в изопропиловом спирте в течение 10 минут. Тщательно просушите предметные стекла с помощью N2.
- Поместите чистые предметные стекла COC в плазменный ашер так, чтобы плоская поверхность была размещена вверх, и обработайте поверхность кислородной плазмой 800 SCCM в течение 2 минут при мощности 700 Вт и давлении 0,133 мбар.
- Поместите предметное стекло окисленного КОК на форму PDMS для верхнего канала так, чтобы обработанная поверхность соприкасалась со структурированной поверхностью PDMS. Поместите узел в приспособление Mold-in-Place, затянув его динамометрическим ключом на 0,3 Нм.
- Подключите систему давления к трубопроводу сжатого воздуха под давлением 6 бар. Возьмите центрифужную трубку с дегазированной OSTE и соберите ее в соответствии с инструкциями по напорной системе с помощью трубки из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с внутренним диаметром (ID) 0,8 мм.
- Подсоедините трубку из ПТФЭ ко входному отверстию пресс-формы PDMS и, используя давление 1000 мбар, поддерживаемое пьезоэлектрическим насосом, расположенным в системе давления, заполните устройство. Поместите приспособление стеклянной стороной вверх в выравниватель маски и экспонируйте с дозой 850 мДж с помощью фильтра ND33.
- После выдержки разберите приспособление с помощью шестигранного ключа и осторожно извлеките предметное стекло COC со структурированным слоем OSTE из пресс-формы PDMS.
- Приведите структурированный OSTE в контакт с мембраной размером 25 мм x 75 мм с порами 50 нм и плотностью пор 11,8% так, чтобы каналы были полностью покрыты мембраной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно важно, чтобы мембрана была как можно более прямой в процессе нанесения. - Поместите узел на горячую плиту, установленную на 60 ° C, стороной мембраны вверх, поместите чистый предметной стекло поверх мембраны и приложите сверху давление 1,6 кПа, чтобы обеспечить равномерное склеивание. Нагревайте сборку в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага особенно важно оценить характеристики склеивания и деформацию канала.
4. Подготовка донного канала OSTE-COC и сборка устройства
- Смешайте ОСТЭ в соотношении 1,09:1 (для 5 устройств необходимо 1,56 г части А и 1,44 г части В). Смешайте компоненты в планетарном центробежном миксере: перемешивайте в течение 5 минут при 750 об/мин, затем дегазируйте в течение 5 минут при 750 об/мин.
- Переложите смешанный ОСТЭ в трубку Falcon и дегазируйте при -800 мбар в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин.
- Очистите предметные стекла COC ультразвуком в изопропиловом спирте в течение 10 минут. Тщательно просушите предметные стекла с помощью N2.
- Поместите чистые предметные стекла COC в плазменный ашер и обработайте поверхность кислородной плазмой 800 SCCM в течение 2 минут при мощности 700 Вт и давлении 0,133 мбар.
- Поместите окисленный предметный стеклопластик на форму PDMS для нижнего канала так, чтобы обработанная поверхность соприкасалась со структурированной поверхностью PDMS. Поместите узел в приспособление Mold-in-Place, затянув его динамометрическим ключом на 0,3 Нм.
- Возьмите трубку Falcon с дегазированной OSTE и соберите ее в соответствии с инструкциями по системе давления с помощью трубки из ПТФЭ с внутренним диаметром 0,8 мм.
- Подсоедините трубку из ПТФЭ ко входному отверстию пресс-формы PDMS и, используя давление 1000 мбар, заполните устройство. Поместите приспособление стеклянной стороной вверх в выравниватель маски и экспонируйте с дозой 1100 мДж с помощью фильтра ND33.
- После выдержки разберите приспособление с помощью шестигранного ключа и осторожно извлеките предметное стекло COC со структурированным слоем OSTE из пресс-формы PDMS.
- Комбинируйте структурированный слой OSTE с верхним канальным узлом так, чтобы конструкция верхнего и нижнего слоев были выровнены друг с другом, а нижний слой OSTE находился в контакте с мембраной.
- Вставьте конструкцию в приспособление Mold-in-Place и с помощью зажимов-бульдогов равномерно приложите к устройству давление 1,6 кПа. Поместите отсадку в духовку при температуре 60°C на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неравномерное расположение зажимов может привести к неравномерному склеиванию.
5. Оценка устройства
- После склеивания визуально оцените приборы с помощью микроскопа на предмет визуальных дефектов, например, деформации канала или неудачного склеивания.
- Проверьте устройства на отсутствие дефектов, пропустив через каналы отфильтрованную деионизированную воду размером 0,02 мкм с давлением 30 мбар. Следите за утечками в проточном канале и порту Луэра, а также за потоком воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если утечка не обнаружена и поток в канале не прерывается, устройства считаются пригодными для дальнейших экспериментов.
6. Настройка устройства
- Наполните два шприца по 5 мл 2 мл 20 нм, отфильтрованного 3%H2O2 и установите их на шприцевой насос (используйте стрелки движения на необходимое расстояние, вставьте шприцы и зафиксируйте их на месте с помощью верхней планки).
ОСТОРОЖНОСТЬ! Всегда будьте осторожны при обращении сH2O2. Наденьте лабораторный халат, защитные резиновые перчатки и средства защиты глаз. - Подсоедините трубку из ПТФЭ длиной 14 см длиной 800 мкм к шприцам с помощью игл для шприцев и к входным отверстиям устройства с помощью соединителей Луэра.
- Подсоедините к выходным отверстиям трубку длиной 200 мкм с внутренним диаметром 200 мкм.
- Подсоедините другой конец трубки PEEK к контейнеру для отходов. Настройка показана на рисунке 3.
- Запустите шприцевой насос со скоростью потока 500 мкл/мин для каждого входного отверстия (на экране прибора: Настройки > Набор системы > Шприц (производитель: медицинский шприц, шприц: 5 мл) > Кнопка «Назад » > Параметры (Выберите: настаивать, Повторить: 1, Объем: 1,5 мл, Расход: 500 мкл/мин) > Кнопка «Назад » > кнопка «Назад »). Соберите проточный контейнер в контейнер для отходов.
- Наполните два новых шприца объемом 5 мл 2 мл 20 нм отфильтрованного 70% этанола.
- Замените предыдущие шприцы шприцами, заполненными этанолом, и запустите шприцевой насос, используя те же параметры, что описаны в шаге 6.5.
- Используйте новые шприцы объемом 5 мл и наполните их 5 мл 20 нм фильтрованного фосфатно-солевого буфера (PBS).
- Замените предыдущие шприцы шприцами, наполненными PBS, и промойте устройство 4 мл PBS, повторив шаги 6.1. и 6.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно измените параметры настройки системы на Объем: 4 мл (на экране прибора: Настройки > Параметры > (Выберите: Объем: 4 мл). - Отсоедините трубку от устройства и закройте каждый вход и выход заглушками Люэра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте PBS в устройстве и избегайте захвата воздуха, добавив дополнительный PBS на каждое входное и выходное отверстие с помощью микропипетки перед закрытием. - Оставьте устройство на ночь в темном месте при комнатной температуре (RT).
- На следующий день промойте устройство, заполненное PBS, 4 мл PBS с длиной волны 20 нм (как описано в шаге 6.8).
- Соберите последний 1 мл проточной жидкости из обоих выходов в пробирку объемом 2 мл с низким связыванием белка и храните при температуре 4 °C в качестве заготовки для частиц, вводимых устройством.
- Извлеките шприцы, наполненные PBS, и замените их новыми шприцами объемом 5 мл, наполненными воздухом.
- Продувайте устройство 4 мл воздуха до тех пор, пока вся жидкость не выйдет из устройства и трубки.
7. Тестирование устройства со стандартизированными латексными шариками
- Подготовьте стандартизированный образец валика, используя гранулы полистирола размером 1,0 мкм и карбоксилатные гранулы размером 0,1 мкм. В пробирку объемом 15 мл добавьте 500 мкл стандартов полистирольных шариков 1,0 мкм, 1 мкл стандартов карбоксилатных шариков 0,1 мкм и 9499 мкл 20-нм фильтруемого PBS (конечная концентрация смеси 1,0 и 0,1 мкм будет 5 × 108 шариков/мл и 3,6 × 1010 шариков/мл соответственно).
- Встряхните образец шарика в течение 30 секунд и храните его при температуре +4 °C, когда он не используется.
- Наполните один новый шприц объемом 5 мл 1,5 мл стандартизированной смеси гранул, а другой – 1,5 мл 20 нм, отфильтрованного PBS.
- Снимите ранее прикрепленные шприцы и присоедините шприц с шариковой смесью к первой входной трубке, а другую — ко второй.
- Снимите контейнер для отходов и подготовьте не менее пяти пробирок для микроцентрифуг объемом 0,5 мл для каждой выпускной трубки.
- Измените параметры запуска системы шприцевого насоса на Объем: 1 мл; Расход: 250 мкл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от потребностей пользователя можно установить различные скорости потока, такие как 250 мкл/мин, 200 мкл/мин, 150 мкл/мин, 100 мкл/мин и 50 мкл/мин. Рекомендуется провести предварительное исследование, чтобы выбрать наиболее благоприятную скорость для желаемого результата. - Запустите шприцевой насос и соберите отток - от 5 до 6 капель в каждую пробирку микроцентрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если одно и то же устройство используется несколько раз, промойте устройство, как описано в шаге 6.8, и замените все разъемы, вилки и иглы. Вымойте использованные разъемы, вилки и иглы, оставив их в 20 нм отфильтрованном 70% этаноле не менее чем на 30 минут. Затем переместите все части в пробирку с отфильтрованной деионизированной водой 20 нм, тщательно встряхните пробирку и перенесите их в чашку Петри, содержащую 20 мл отфильтрованной деионизированной воды 20 нм. Оставьте чашку Петри на шейкере не менее чем на 30 минут при 100 оборотах в минуту, затем дайте вещам высохнуть в сухой чашке Петри (не менее 12 часов) перед повторным использованием.
8. Тестирование прибора с образцами мочи
- Подготовьте устройство, как описано в шагах 6.1-6.15.
- Собрать 100 мл утренней мочи на одного донора с помощью стерильных контейнеров для мочи и доставить в лабораторию для обработки в течение 2 часов после сбора.
- Разделите каждый образец мочи на две пробирки по 50 мл и центрифугируйте при 2'000 x g в течение 15 мин при RT.
- Соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу.
- Центрифугируйте надосадочную жидкость при 10'000 x g в течение 30 минут при RT, чтобы избавиться от крупных частиц и клеточного мусора.
- Соберите надосадочную жидкость и выбросьте гранулу.
- Вымойте устройство, как описано в 6.6.
- Замените шприцы объемом 5 мл на шприц объемом 20 мл, заполненный подготовленным образцом мочи для входа в образец, и еще один шприц объемом 20 мл, заполненный 20 мл фильтра DEPC-PBS с длиной волны 20 нм, для входного отверстия буфера. Измените настройки шприцевого насоса на BDPlastipak; Шприц: cc; Объем: 20 мл; Расход: 250 мкл/мин (оптимальный расход), аналогично описанному в шаге 6.2. Запустите шприцевой насос и соберите проточную жидкость из каждого выпускного отверстия в отдельные пробирки по 50 мл.
- Концентрируйте каждую проточную пробирку отдельно, используя 100 000 молекулярных отсечных концентрационных пробирок по 100 мкл каждая при 3 000 x g при 4 °C.
- Перелейте концентраты в пробирки для микроцентрифуг объемом 0,5 мл.
- Концентрированные образцы встряхивайте в течение 30 секунд, затем вращайте в течение 10 секунд.
- Аликвотируют образцы, перенося 25 мкл образца на пробирку, маркируют их и замораживают при -80 °C для длительного хранения.
9. Тестирование устройств на кондиционированных средах
- Подготовьте устройство, как описано в шагах 6.1–6.15.
- Культивирование клеток в 5%-ной среде с содержаниемCO2 при 37 °C до тех пор, пока общее количество не достигнет 100 миллионов, согласно Bajo-Santos et al.20 Проведите клетки в одну суспензионную колбу T175 в 100 мл среды, не содержащей сыворотки, с добавлением 2% добавки заменителя сыворотки B-27 и культивирование в 5%-ной среде с содержаниемCO2 при 37 °C в течение дополнительных 48 ч.
- Соберите клеточную суспензию и центрифугируйте ее при 300 x g в течение 5 мин при RT, чтобы избавиться от клеток.
- Соберите и снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 3 000 x g в течение 30 минут при +4 °C, чтобы избавиться от крупных частиц и клеточного мусора.
- Соберите надосадочную жидкость и храните ее при температуре +4°C до момента отделения, но не более 3 ч.
- Замените шприцы объемом 5 мл на шприцы по 20 мл, заполненные подготовленной кондиционированной средой для входа в образец и заполненные 20 мл 20 мл фильтруемой PBS для входа в буфер.
- Установите настройки на насосной станции, как описано в шаге 7.8.
- Запустите шприцевой насос и соберите проточную жидкость из каждого выпускного отверстия в отдельную пробирку объемом 50 мл.
- Концентрируйте каждую проточную пробирку отдельно, используя 100 000 пробирок для концентрации с отсечкой молекулярной массы по 150 мкл каждая при 3 000 x g при +4 °C.
- Перелейте концентраты в пробирки для микроцентрифуг объемом 0,5 мл.
- Вихревые концентрированные образцы в течение 30 с.
- Отжим концентрированные образцы в течение 10 с.
- Аликвотируйте образцы, перенося 25 мкл образца на пробирку, маркируйте их и замораживайте при -80 °C для длительного хранения.
10. Изоляция электромобилей с помощью ультрацентрифугирования
- Центрифуга 20 мл мочи или кондиционированной клеточной среды при 100 000 x g в течение 70 мин при +4 °C с помощью центрифуги с ротором с фиксированным углом наклона.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 20 мл 20 нм отфильтрованного PBS.
- Снова центрифуга, как описано в 10.1.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 12 мл 20 нм отфильтрованного PBS.
- Центрифуга при 100 000 x g в течение 70 мин при +4 °C с помощью поворотного ротора.
- Выбросьте надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этот раз будьте осторожны при выбросе надосадочной жидкости. Делать это рекомендуется с помощью пипетки. - Повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл PBS, отфильтрованной с длиной волны 20 нм.
- Аликвотируют образец и переходят к настройке 12 для определения характеристик EV. В противном случае хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
11. Изоляция электромобилей с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC)
- Концентрируйте 20 мл мочи или кондиционированной клеточной среды до 500 мкл с помощью центробежных фильтров с молекулярной массой 100 кДа (MWCO) при 3 000 x g при +4 °C в течение 15 минут.
- Перенесите концентрат на колонку SEC (диапазон нагрузки 35 нм).
- Вылейте 20 нм отфильтрованный PBS на колонку и соберите 15 фракций по 0,5 мл.
- Анализируйте фракции с помощью системы динамического рассеяния света (DLS) в соответствии с инструкциями производителя.
- Объедините выбранные дроби. Выбирайте фракции с аттенюатором ниже 11 и не менее 30% от общего количества частиц размером более 40 нм.
- Концентратируйте отобранные фракции до 100 мкл с помощью центробежных фильтров с молекулярной массой 3 кДа (MWCO) при 14 000 x g при +4 °C в течение 15 минут.
- Аликвотируйте образец и переходите к разделу 12 для определения характеристик EV. В противном случае хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
12. Определение характеристик электромобиля
- Возьмите образец для характеристики из морозильной камеры и медленно разморозьте его (на блоке льда или при +4 °C).
- Выполните анализ отслеживания наночастиц (NTA) для определения распределения частиц по размерам и количества13. Для подтверждения наличия ВВ в образцах проводят двухсэндвич-анализ иммуноферментного анализа с высоким аффинным мембранным белком Т-клеток 4 (TIM-4) (dsELISA)14 .
13. НТА
- Вихрь размороженный образец EV в течение 30 с и отжим в течение 10 с, затем переложите 1 мкл на 999 мкл 20 нм отфильтрованного PBS в пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл, чтобы разбавить его в 1000 раз. Сохраните 1 мл дополнительного PBS, используемого для разведения, чтобы убедиться, что он не содержит частиц. Храните все при температуре +4 °C до измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием отфильтруйте PBS через фильтр 0,02 нм. - Встряхните образец или заготовку EV в течение 30 с и введите ее в модуль с помощью шприца. Заполните модуль примерно 0,7 мл образца и поместите его в прибор.
- Измерьте образец с помощью анализатора наночастиц в соответствии с инструкциями производителя.
14. dsELISA для маркеров EV
- Приготовьте раствор 1 мкг/мл белка TIM4-Fc. Покрыть лунки 96-луночного ИФА-планшета, перенеся 100 мкл раствора в каждую необходимую лунку, и инкубировать в течение ночи при +4 °С, встряхивая при 200 об/мин.
- На следующий день приготовьте промывочный раствор (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 мМ CaCl2).
- Выбросьте всю жидкость в каждую лунку. Промыть каждую лунку, добавив 200 мкл промывочного раствора, встряхнуть при 200 об/мин в течение 5 мин при RT и выбросить. Повторите этот шаг дважды.
- Приготовьте блокирующий раствор (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% бычий сывороточный альбумин. Добавьте 200 мкл раствора для блокировки в каждую лунку и инкубируйте при RT в течение 1 ч при встряхивании при 200 об/мин.
- Промойте каждую лунку, как описано в шаге 14.3.
- Приготовьте 220 мкл каждого разведения образца в промывочном буфере (оптимальная концентрация ЭВ 2,7 ×10,5 ЭВ/мкл). Добавьте 100 мкл разбавленного образца на лунку и выполните два повторения. Инкубируют при RT в течение 90 мин при встряхивании при 200 об/мин.
- Промойте каждую лунку, как описано в шаге 14.3.
- Добавьте 100 мкл соответствующих антител в каждую лунку. Используйте надлежащие маркеры EV для подтверждения EV и загрязняющих веществ4. Инкубируют при RT в течение 2 ч при встряхивании при 200 об/мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются вторичные антитела, повторите шаги 14.7-14.8. Однако сократите инкубационный период вторичных антител до 1 ч.
- Промойте каждую лунку, как описано в шаге 14.3.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл субстрата пероксидазы хрена, перемешайте планшет в течение 1 мин и инкубируйте при RT в течение 30 мин.
- Добавьте 1 M H2SO4 в каждую лунку, чтобы остановить реакцию.
- С помощью микропланшетного ридера измерьте поглощение на длине волны 450 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы изготовили микрофлюидное устройство с использованием напечатанной на 3D-принтере пресс-формы с двойным негативом (рис. 1) с помощью мягкой литографии (рис. 2A) для высокопроизводительного разделения EV на основе принципа раздвоения A4F (рис. 2B, C). Для установки требуется насос и проточная станция, как показано на рисунке 3, для автоматической изоляции электромобилей. Во-первых, для оценки правильности концепции устройств была приготовлена смесь полистирольных шариков диаметром 100 нм и 1000 нм, представляющих собой везикулы и мелкие клеточные обломки соответственно10. Были проведены эксперименты с различными расходами для шариковой смеси, как с раздвоением, так и без него, для изучения влияния линейной скорости на эффективность сепарации. Во всех экспериментах извлечение мелких шариков оставалось стабильным и превышало 90%10, что свидетельствует о потенциале устройства для восстановления электромобилей.
Затем мы оценили и сравнили потенциал устройства COC-OSTE в выделении ВВ из больших объемов (>1 мл) из сложных биожидкостей с минимальной предварительной обработкой. Таким образом, моча 10 здоровых доноров (Рисунок 4) и клеточная среда из двух разных клеточных линий предстательной железы (Рисунок 5) были использованы в качестве шаблона для одновременного выделения ВВ после трех различных процедур: ультрацентрифугирования (ЯК), эксклюзионной хроматографии (SEC) и устройства OSTE-COC на основе микрофлюидики A4F. После выделения общее количество частиц и их распределение по размерам оценивали с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA). В среднем, устройство OSTE-COC показало лучшее общее извлечение частиц из биожидкостей по сравнению с ЯК, но статистическая значимость была достигнута только при объединении номеров частиц из обоих портов (рис. 4A). Для того, чтобы сравнить производительность устройства с другими системами, следует принять во внимание R&L outlet. Как показано на рисунке 4, производительность L и R при восстановлении EV превосходит UC и SEC. Отдельно L-порт был разработан для захвата небольшой фракции EV, в то время как R-порт был разработан для сбора большей фракции EV с другими молекулами аналогичного размера. Интересно, что восстановление с использованием R-PORT устройства OSTE-COC было несколько выше, чем только SEC и UC (рис. 4A). Экспрессия CD63 показала аналогичную картину (рис. 4C). Этот результат указывает на то, что устройство OSTE-COC было более эффективным в полном восстановлении EV. Эквивалентное распределение по размерам было обнаружено между различными методологиями, за исключением UC, которая показывает большее распределение частиц по размерам (рис. 4B).
Сопоставимые результаты наблюдались в культурах клеточных сред. В обоих сценариях полное извлечение частиц из обоих портов устройства продемонстрировало более высокую производительность по сравнению с методологиями SEC или UC (как показано на рисунке 5A, B). Примечательно, что ВВ, полученные из клеток PC3, продемонстрировали отчетливое распределение по размерам с большей однородностью распределения L-PORT по сравнению с другими экспериментальными группами (рис. 5C, D). Кроме того, анализ экспрессии CD63 подтвердил более высокую скорость восстановления ВВ, достигнутую с помощью устройства COC-OSTE (как показано на рисунке 5E, F). Сводка, сравнивающая характеристики изоляции различных методологий, рассмотренных в данном исследовании, приведена в таблице 1.
Рисунок 1: Размеры 3DP змеевидной формы с двойным негативом и изометрический вид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микрофлюидное устройство COC-OSTE. (A) Схема различных основных этапов изготовления устройства OSTE-COC. (Б) Принцип работы устройства. (C) Изображение готового устройства. Масштабная линейка: 15 мм. Эта цифра была изменена с разрешения Priedols et al.10 и Bajo-Santos et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Экспериментальная конфигурация устройства. Слева находится шприцевой насос, посередине — устройство OSTE-COC, справа — станция восстановления. Эта цифра была изменена с разрешения Priedols et al.10 и Bajo-Santos et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Распределение EV в моче по размерам и извлечение частиц у 10 доноров с помощью ультрацентрифугирования (ЯК), эксклюзионной хроматографии (SEC) и устройства COC-OSTE. (A) Количество частиц, извлеченных из каждого метода выделения с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA). Данные представлены в виде среднего значения +/- стандартного отклонения. Статистическая значимость обозначается * (p<0,05). (B) Ящичковые диаграммы отображают среднее распределение частиц по размерам среди всех образцов мочи, оцененных NTA, с усами, указывающими минимальные и максимальные значения. P-значения были получены в результате сравнения с ЯК, при этом **** указывает на высокую статистическую значимость (p<0,0001). (C) Медиана и диапазон среднего количества CD63, оцененные с помощью двухслойного иммуноферментного анализа (dsELISA), для каждого метода выделения были рассчитаны для всех образцов. L-порт: Левый порт; R-порт: Правый порт. Эта цифра была изменена с разрешения Bajo-Santos et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Определение характеристик ВВ, выделенных из клеток PC3 и LNCaP, с использованием различных методов. (A) Количество частиц, извлеченных из среды PC3 с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA), представленное средним значением +/- стандартное отклонение. (B) Количество частиц, извлеченных из клеточных сред LNCaP с использованием NTA, представленное в виде среднего значения +/- стандартного отклонения. (C) Медианное распределение частиц по размерам EV из культур PC3, а также диапазон были определены NTA. (D) Медианное распределение по размерам электромобилей, выделенных из культур LNCaP с диапазоном. (E) Медиана и диапазон экспрессии CD63 для каждого метода выделения ВВ, полученного из клеточной линии PC3, с использованием двойного сэндвич-иммуноферментного анализа (dsELISA). (F) Медиана и диапазон экспрессии EV CD63, полученного из LNCaP, по данным dsELISA для каждого метода изоляции. UC: Ультрацентрифугирование; SEC: Эксклюзионная хроматография; L-порт: Левый порт; R-порт: Правый порт. Эта цифра была изменена с разрешения Bajo-Santos et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| УНК | СЕК | COC-OSTE | |
| Время обработки/образец | ++/+++ | +++ | + |
| Производительность | ++ | + | +++ |
| Стоимость/образец | + | +++ | ++ |
| Чистота | + | +++ | ++ |
| Автоматизация | ++ | + | +++ |
| Доходность EV | ++ | ++ | +++ |
| Выбор размера | + | ++ | ++ |
Таблица 1. Сравнение изоляционных характеристик ВВ с тремя методами: UC SEC, и устройством COC-OSTE. UC: Ультрацентрифугирование; SEC: Эксклюзионная хроматография. COC-OSTE: тиол-ен с циклическим сополимером олефинов вне стехиометрии. +: низкий; ++: средний; +++: высокий. * Зависит от устройства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленное микрофлюидное устройство предлагает многообещающий метод выделения и экстракции электромобилей из биологических жидкостей, устраняя некоторые критические ограничения существующих методов золотого стандарта, таких как UC и SEC12. UC и SEC, как известно, трудоемки, отнимают много времени и страдают от низкой производительности, что делает их менее подходящими для приложений с высокой пропускной способностью, где требуется большое количество электромобилей21,22. В отличие от этого, описанное микрофлюидное устройство может непрерывно обрабатывать значительный объем до 20 мл биологической жидкости с минимальным вмешательством пользователя, что делает его потенциально революционным для промышленных или клинических условий. Одним из ключевых преимуществ этого микрофлюидного устройства является его способность стандартизировать изоляцию электромобилей и улучшить воспроизводимость по сравнению с традиционными методами, которые включают ручные операции. За счет снижения вариативности производства устройств для изоляции электромобилей за счет массового производства производительность устройства может быть лучше контролируемой и стабильной, что жизненно важно для таких приложений, как терапия и диагностика на основе электромобилей. Кроме того, совместимость устройства с крупносерийным производством путем реакционного литья под давлением подходящих субстратов еще больше повышает его потенциал для масштабирования и более широкого внедрения.
Чтобы обеспечить воспроизводимость и стабильную производительность, необходим обширный и четко определенный протокол, как для производства чипа, так и для его использования в экспериментах. Чип разработан с учетом индустриализации. Однако при изготовлении устройства в лабораторных условиях необходимо уделять внимание предотвращению образования пузырьков, обеспечению точного и прочного сцепления, а также проведению тщательных испытаний при более высоких скоростях потока, чем те, которые ожидаются в реальных экспериментах. Эта мера предосторожности особенно важна для устройств COC-OSTE, так как они могут быть склонны к утечке из-за неудачного склеивания, особенно при более высоких скоростях потока. Кроме того, поскольку OSTE является светочувствительным материалом, изготовление устройства должно выполняться в желтом свете, чтобы избежать ненужного воздействия ультрафиолета. Поскольку эта технология все еще находится на начальных стадиях, исследователи должны экспериментировать с различными скоростями потока, чтобы определить оптимальную настройку для их конкретного применения, поскольку стандартизированные протоколы для этого нового метода еще не созданы, а вязкость жидкости может явно повлиять на эффективность изоляции электромобилей, основываясь на наших результатах. Следуя этим рекомендациям и решая проблемы стандартизации, потенциал этого микрофлюидного устройства для изоляции электромобилей может быть полностью реализован в различных областях исследований и приложениях.
Метод изоляции электромобилей с использованием микрофлюидного устройства позволяет проводить обширные модификации и устранение неполадок для оптимизации производительности. Чтобы улучшить разделение частиц, исследователи могут исследовать более длинные каналы, различные пористости и плотности пор мембраны, а также измененные размеры. Если на выходе для мелких частиц много крупных частиц, может быть полезно испытать более высокую скорость на входе в буфер, а если в выходе для крупных частиц много мелких частиц, рекомендуется поэкспериментировать с более длинным каналом или мембраной с более крупными порами. Решение проблемы поглощения частиц может включать в себя регулировку скорости потока, модификацию поверхности и состав OSTE или изменение времени воздействия УФ-излучения. Для устройств, подверженных нестабильности и утечкам, снижение скорости потока и обеспечение надлежащего склеивания являются важнейшими шагами. Чтобы свести к минимуму повреждение электромобилями, исследователи могут уменьшить скорость потока, более тщательно промыть PBS после стерилизации устройства и рассмотреть возможность использования меньших пор мембраны или альтернативных методов и материалов для проектирования пресс-форм. Благодаря этим настройкам микрофлюидное устройство может быть точно настроено, раскрывая его потенциал для различных применений в исследованиях электромобилей и смежных областях. Кроме того, для оптимизации производительности устройства можно использовать определение характеристик проб на входе, включая измерения плотности и вязкости, для корректировки параметров потока. Кроме того, особое внимание должно быть уделено природе образца, учитывая установленную нестерильность биожидкостей23. Следовательно, стерилизация образцов перед их введением в клиническое применение должна быть должным образом рассмотрена.
Несмотря на эти проблемы, микрофлюидное устройство обладает огромным потенциалом в различных областях исследований. Его способность непрерывно изолировать электромобили от больших объемов сильно разнородных образцов открывает двери для автоматизации, облегчая высокопроизводительные приложения и позволяя проводить более глубокий анализ электромобилей из различных источников. Интеграция этого микрофлюидного модуля в различные устройства, такие как картриджи биореакторов с полыми волокнами или проточные цитометры высокого разрешения, может сделать применение электромобилей более удобным для отрасли и стимулировать инновации в таких областях, как доставка лекарств, диагностика и косметика. В целом, это микрофлюидное устройство представляет собой значительный шаг вперед в области исследований электромобилей, предлагая эффективный и стандартизированный метод изоляции электромобилей с перспективными приложениями в широком спектре исследований и промышленных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
А.А., Г.М. и Р.Р. являются учредителями, членами совета директоров и акционерами Cellbox Labs, LLC
Acknowledgments
Благодарим всех доноров, принявших участие в этом исследовании, сотрудников Латвийской геномной базы данных за предоставленные образцы. Институт физики твердого тела Латвийского университета в качестве Центра передового опыта получил финансирование в рамках рамочной программы Европейского Союза «Горизонт 2020» H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 в рамках грантового договора No 739508, проект CAMART2. Работа выполнена при поддержке Латвийского совета по науке Проект No. lzp-2019/1-0142 и номер проекта: lzp-2022/1-0373.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
| 1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
| 10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
| 5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| 800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
| 96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
| COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
| Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
| Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
| Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
| Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
| PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
| Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
| QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
| Resin Tough Black | Zortrax | ||
| SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
| Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
| Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
References
- Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480 (2022).
- Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955 (2020).
- Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466 (2020).
- Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773 (2021).
- Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789 (2023).
- Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
- Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809 (2020).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
- Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
- Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198 (2022).
- Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
- Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979 (2023).
- Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002 (2015).
- Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
- Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971 (2023).
- Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720 (2021).
- Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145 (2022).
- Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).
