שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר
Summary
חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.
Abstract
מאמר פרוטוקול זה נועד לספק לחוקרים החדשים את הפרטים המלאים של השימוש ב- Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) כדי ליצור פרופיל של המיקומים הגנומיים של גורמים קושרי כרומטין, סימני היסטון ווריאנטים של היסטון. פרוטוקולי CUT&Tag מתפקדים היטב עם מיובלסטים של עכברים ותאי גזע שריריים שזה עתה בודדו (MuSCs). הם יכולים בקלות להיות מיושמים על סוגי תאים רבים אחרים כל עוד התאים יכולים להיות משותקים על ידי חרוזי Concanavalin-A. בהשוואה ל- CUT&Tag, מבחני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP) הם ניסויים הגוזלים זמן. בדיקות ChIP דורשות טיפול מקדים בכרומטין לפני שניתן יהיה להשתמש בחומר הכרומטי עבור משקעים חיסוניים. ב- cross-linking ChIP (X-ChIP), טיפול מקדים בכרומטין כולל קישור צולב וסוניקציה כדי לשבור את הכרומטין. במקרה של ChIP מקורי (N-ChIP), הכרומטין המקוטע מושג בדרך כלל על ידי עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase). הן סוניקציה והן עיכול MNase מציגים הטיה מסוימת לניסויי ChIP. בדיקות CUT&Tag יכולות להסתיים תוך פחות שלבים ודורשות הרבה פחות תאים בהשוואה ל- ChIPs אך מספקות מידע בלתי משוחד יותר על גורמי שעתוק או סימני היסטון במיקומים גנומיים שונים. CUT&Tag יכול לתפקד עם עד 5,000 תאים בלבד. בשל רגישותו הגבוהה יותר ואות הרקע הנמוך יותר מאשר ChIPs, החוקרים יכולים לצפות לקבל נתוני שיא אמינים רק מכמה מיליוני קריאות לאחר ריצוף.
Introduction
בדיקת CUT&Tag הומצאה כדי לפצות על כמה פגמים גלויים של ChIPs1. שני החסרונות העיקריים של ChIPs הם 1) ההטיה המוצגת בעת פיצול כרומטין 2) חוסר היכולת לעבוד עם מספרי תאים נמוכים. מבחני X-ChIP מסתמכים על סוניקציה או על עיכול MNase כדי לקבל מקטעי כרומטין, בעוד N-ChIP משתמש בעיקר בעיכול MNase כדי לקבל נוקלאוזומים. סוניקציה מראה הטיה לכיוון מיקומי כרומטין רגועים כגון אזורי מקדם2, וככל הנראה, עיכול MNase עובד ביעילות רבה יותר גם על סיבי כרומטין רגועים. יתר על כן, חלקם דיווחו כי עיכול MNase מראה גם הטיה תלוית רצף DNA3. לכן, בשלב הכנת הקלט של בדיקות ChIP, אי אפשר לקבל קטעי כרומטין מכל מיני מיקומים גנומיים באופן אקראי לחלוטין. יתר על כן, מבחני ChIP בדרך כלל מייצרים אותות רקע גבוהים יותר בהשוואה ל- CUT&Tag ודורשים מעל 10 קיפולים יותר קריאות מאשר CUT&Tag כדי להדגיש היכן הפסגות הן 1,4,5. זה מסביר מדוע ניסויי ChIP צריכים להתחיל עם הרבה יותר תאים מאשר CUT&Tag. זו אינה בעיה כאשר חוקרים קווי תאים מכיוון שניתן לעבור אותם שוב ושוב כדי להשיג מספר תאים גבוה מאוד. עם זאת, בדיקת ChIP היא בהחלט לא כלי אפיגנטי חזק לחקר אוכלוסיות נדירות או יקרות ערך של תאים ראשוניים, אם כי לתאים ראשוניים יש כמובן השלכות מעשיות ורפואיות יותר.
בעוד הליך ChIP ארוך ומסובך מרתיע כמה חוקרים ללמוד או להשתמש בטכניקה זו, אנשים מרגישים נוח יותר עם בדיקות קלות יותר כגון immunocytochemistry (ICC) או immunofluorescence (IF). בדיקת CUT&Tag דומה במהותה לתהליך של ניסויי ICC ו-IF, אך מתרחשת רק במבחנה. CUT&Tag אינו זקוק לכרומטין מקוטע מלכתחילה, ובמקום זאת, הגנום חייב להיות שלם עבור קשירת נוגדנים1. ביום הראשון של ניסוי ChIP, החוקרים בדרך כלל מבלים עד 4 שעות בהכנת הכרומטין המקוטע מגרעינים עם סוניקציה או עיכול MNase לפני שניתן לערבב את חתיכות הכרומטין הקצרות עם חרוזי נוגדנים 4,5. בניגוד יוצא דופן, עומס העבודה ביום הראשון של הליך CUT&Tag הוא פשוט לשתק את התאים לחרוזי Concanavalin-A ולאחר מכן להוסיף את הנוגדן העיקרי לחרוזי התא. זה דורש רק ~ 40 דקות1.
ראוי להזכיר כי מחשוף תחת מטרות ושחרור באמצעות Nuclease (CUT&RUN) הוא חלופה חשובה CUT&Tag. CUT&RUN הוקמה על בסיס מנגנון עבודה דומה לזה של CUT&Tag. ב-CUT&Tag, הנוגדנים מנחים את הטרנספוזאז pA/G-Tn5 לכל המקומות שבהם כל אחד מהאנזים יחתוך פיסת כרומטין ובינתיים יתייג אותה עם מתאמי ספרייה, בעוד שב-CUT&RUN, תפקיד ה-pA/G-Tn5 ממלא ה-pA/G-MNase שמבצע רק את החלק החותך של העבודה6. לכן, בהשוואה ל- CUT&Tag, CUT&RUN דורש שלב נוסף שהוא להדביק את מתאמי יצירת הספרייה על חתיכות ה- DNA המקוטעות pA/G-MNase 7,8. בשל הדמיון הרב בין CUT&Tag ו- CUT&RUN, חוקרים המכירים את CUT&Tag יתאימו את עצמם בקלות לביצוע CUT&RUN במיומנות. עם זאת, יש לציין כי קיימים כמה הבדלים קלים בין CUT&Tag לבין CUT&RUN. פרוטוקולי CUT&RUN משתמשים בדרך כלל בריכוז הפיזי של מלח (~ 150 מילימול) בשלבי הכביסה, בעוד שב- CUT&Tag, מאגר השטיפה 300-Dig עשיר במלח. לכן, CUT&Tag טוב בשליטה על הרקע בעת יצירת פרופיל של סימנים/וריאנטים של היסטון או גורמי שעתוק, מכיוון שחלבונים אלה קושרים ישירות ובחוזקה את DNA1. CUT&Tag עלול להיתקל בבעיות בעת יצירת פרופיל של גורמים הקשורים לכרומטין, שאינם קושרים ישירות את ה- DNA ומראים זיקה חלשה לכרומטין. שלבי שטיפת מלח גבוהים ב- CUT&Tag עשויים להסיר גורמים הקשורים לכרומטין, ולא לגרום לאותות בפלט הסופי. למרות שישנם מקרים מוצלחים בהם ניתן להשתמש ב- CUT&Tag כדי ליצור פרופיל של חלבונים מסוימים שאינם היסטון/גורמים שאינם שעתוק9, אנו עדיין ממליצים על CUT&RUN over CUT&Tag כדי ליצור פרופיל חלבונים הקשורים לכרומטין.
לאחר שהיונקים מגיעים לבגרות, רקמות שרירי השלד שלהם עדיין מכילות תאי גזע שריריים. במהלך פגיעה בשריר, תאי גזע אלה יכולים להיות מופעלים ולעבור הרחבה והתמיינות של מספר התאים כדי לחדש סיבי שריר פגומים10. תאי גזע אלה ידועים בשם תאי גזע שריר / לוויין (MuSCs). לאחר ש-MuSCs מבודדים מבעלי חיים או מופעלים על ידי פגיעה בשרירים, הם מתחילים להתרבות והופכים למיובלסטים.
כדי לקבל MuSCs מעיכול שרירי השלד של עכברים, סמני פני השטח של MuSC כגון Vcam1 (Cd106), Cd34 ו-α7-integrin (Itga7) משמשים לעתים קרובות בנפרד או בשילובים כדי להעשיר MuSCs במהלך מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS)11. הוכח כי Cd31–/Cd45–/Sca1–/Vcam1+ הוא כנראה שילוב הסמן הטוב ביותר לקבלת >95% MuSCsטהורים 12. FACS יכול לבודד MuSCs טהורים מיד לאחר עיכול שרירים טריים. עם זאת, אם התכנון הניסיוני אינו דורש MuSCs טהורים ממש בבידוד שלהם, ציפוי מראש הוא חסכוני יותר מאשר FACS כדי להשיג >90% מיובלסטים טהורים (צאצאי MuSC).
MuSCs שבודדו זה עתה מעכברים אינם מתרבים ביעילות במדיה F10 של Ham בתוספת נסיוב בקר עוברי (FBS). כדי להרחיב טוב יותר את מספר התאים של MuSCs ולקבל מספיק מיובלסטים, יש להשתמש בסרום גידול בקר (BGS) במקום FBS. עם זאת, אם BGS אינו זמין, ניתן לערבב את המדיה המלאה F10 של Ham (המכילה כ-20% FBS) עם נפח שווה של מדיה מותנית של תאי T כדי לקדם באופן דרמטי את הרחבת מיובלסט13. לכן, פרוטוקול זה יתאר גם את הכנת מדיה מותנית של תאי T MuSC.
והכי חשוב, פרוטוקול זה מספק דוגמה מלאה לביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר. שים לב שפרוטוקול זה חל גם על סוגי תאים אחרים וסימני היסטון ווריאנטים של היסטון, והקוראים צריכים רק למטב את מספרי התאים או את כמויות הנוגדנים עבור המקרים שלהם בהתבסס על העשרת סימני ההיסטון הספציפיים או הווריאנטים שהם חוקרים.
על מנת להשתמש ב- CUT&Tag או CUT&RUN, יש להתיך את ה- Tn5 או ה- MNase עם חלבון A או חלבון G כדי ליצור pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase או pG-MNase. ככל הנראה, גם חלבון A וגם חלבון G יכולים להתיך על אנזימים אלה בו זמנית כדי ליצור pA/G-Tn5 או pA/G-MNase. חלבון A וחלבון G מראים זיקות שונות ל-IgGs ממינים שונים. לכן, התכה של חלבון A וחלבון G יחד עם האנזים יכולה להתגבר על בעיה זו ולהתאים את האנזים לנוגדנים ממינים רבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר התא הספציפי הנדרש בתגובת CUT&Tag מסוימת מסתמך לחלוטין על העשרת הסימנים/וריאנטים של ההיסטון או חלבונים קושרי כרומטין, שיש לבדוק. בדרך כלל עבור סימני היסטון מועשרים מאוד כגון H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac וכו ‘, 25,000-50,000 מיובלסטים מספיקים למדי לתגובת CUT&Tag אחת. עם זאת, כמה חלבונים נדירים קושרי כרומטין, עשויי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDA16020400 ל- PH); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170804 ל-PH).
Materials
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
| Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
| Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
Referências
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
- Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
- Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
- Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
- Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
- Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
- Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
- Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
- Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
- Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
- Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
- Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
- Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
