Uso del ensayo de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag) en la investigación de mioblastos de ratón
Summary
Los investigadores nuevos en el campo de la epigenética encontrarán en CUT&Tag una alternativa significativamente más fácil que los ensayos ChIP. CUT&Tag ha beneficiado enormemente a los estudios epigenéticos en poblaciones de células raras y primarias, generando datos de alta calidad a partir de muy pocas células. Este protocolo describe la realización de ensayos H3K4me1 CUT&Tag en mioblastos de ratón aislados de músculos de las extremidades posteriores de ratón.
Abstract
Este documento de protocolo tiene como objetivo proporcionar a los nuevos investigadores todos los detalles sobre el uso de Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) para perfilar las ubicaciones genómicas de los factores de unión a la cromatina, las marcas de histonas y las variantes de histonas. Los protocolos CUT&Tag funcionan muy bien con mioblastos de ratón y células madre musculares (MuSC) recién aisladas. Se pueden aplicar fácilmente a muchos otros tipos de células, siempre y cuando las células puedan ser inmovilizadas por perlas de concanavalina-A. En comparación con CUT&Tag, los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) son experimentos que requieren mucho tiempo. Los ensayos ChIP requieren el tratamiento previo de la cromatina antes de que el material cromático pueda utilizarse para la inmunoprecipitación. En la reticulación de la ChIP (X-ChIP), el pretratamiento de la cromatina implica la reticulación y la sonicación para fragmentar la cromatina. En el caso de la ChIP nativa (N-ChIP), las cromatinas fragmentadas se logran normalmente por digestión de nucleasa microcócica (MNasa). Tanto la sonicación como la digestión con MNasa introducen cierto sesgo en los experimentos de ChIP. Los ensayos CUT&Tag se pueden completar en menos pasos y requieren muchas menos células en comparación con los ChIP, pero proporcionan información más imparcial sobre los factores de transcripción o las marcas de histonas en varias ubicaciones genómicas. CUT&Tag puede funcionar con tan solo 5.000 celdas. Debido a su mayor sensibilidad y menor señal de fondo que los ChIPs, los investigadores pueden esperar obtener datos de picos confiables a partir de solo varios millones de lecturas después de la secuenciación.
Introduction
El ensayo CUT&Tag se inventó para compensar algunos defectos evidentes de las ChIPs1. Las dos principales desventajas de los ChIP son 1) el sesgo introducido al fragmentar la cromatina y 2) la incompetencia para trabajar con un número bajo de células. Los ensayos X-ChIP se basan en la sonicación o en la digestión de MNasa para obtener fragmentos de cromatina, mientras que los N-ChIP utilizan principalmente la digestión de MNasa para obtener nucleosomas. La sonicación muestra un sesgo hacia las ubicaciones relajadas de la cromatina, como las regiones promotoras2, y aparentemente, la digestión de la MNasa también funciona de manera más eficiente en las fibras de cromatina relajadas. Además, algunos informaron que la digestión de MNasa también muestra un sesgo dependiente de la secuencia de ADN3. Por lo tanto, en la etapa de preparación de la entrada de los ensayos ChIP, es imposible obtener fragmentos de cromatina de todo tipo de ubicaciones genómicas de una manera perfectamente aleatoria. Además, los ensayos ChIP normalmente generan señales de fondo más altas en comparación con CUT&Tag y requieren más de 10 veces más lecturas que CUT&Tag para acentuar dónde están los picos 1,4,5. Esto explica por qué los experimentos de ChIP tienen que comenzar con muchas más células que CUT&Tag. Esto no es un problema cuando se estudian líneas celulares, ya que se pueden pasar repetidamente para lograr un número de células muy alto. Sin embargo, el ensayo ChIP definitivamente no es una herramienta epigenética fuerte para estudiar poblaciones de células primarias raras o preciosas, aunque las células primarias obviamente tienen implicaciones más prácticas y médicas.
Si bien el largo y complicado procedimiento de ChIP desalienta a algunos investigadores a aprender o usar esta técnica, las personas se sienten más cómodas con ensayos más fáciles como la inmunocitoquímica (ICC) o la inmunofluorescencia (IF). Un ensayo CUT&Tag se asemeja esencialmente al proceso de los experimentos ICC e IF, pero solo tiene lugar en un tubo de ensayo. Para empezar, CUT&Tag no necesita cromatina fragmentada y, en cambio, el genoma debe estar intacto para la unión deanticuerpos. En el primer día de un experimento ChIP, los investigadores normalmente pasan hasta 4 horas preparando las cromatinas fragmentadas de los núcleos con sonicación o digestión de MNasa antes de que los trozos cortos de cromatina puedan mezclarse con perlas de anticuerpos 4,5. En notable contraste, la carga de trabajo del primer día de un procedimiento CUT&Tag consiste simplemente en inmovilizar las células a las perlas de concanavalina-A y luego agregar el anticuerpo primario a las perlas celulares. Esto solo requiere ~ 40 min1.
Vale la pena mencionar que la escisión bajo objetivos y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es una alternativa importante a CUT&Tag. CUT&RUN se estableció sobre la base de un mecanismo de trabajo similar al de CUT&Tag. En CUT&Tag, los anticuerpos guían la transposasa pA/G-Tn5 a todos los lugares donde la enzima cortará cada uno un trozo de cromatina y, mientras tanto, lo marcará con adaptadores de creación de bibliotecas, mientras que en CUT&RUN, el papel de pA/G-Tn5 lo desempeña la pA/G-MNasa que solo realiza la parte de corte del trabajo6. Por lo tanto, en comparación con CUT&Tag, CUT&RUN requiere un paso adicional que consiste en pegar los adaptadores de creación de bibliotecas en las piezas de ADN fragmentadas por pA/G-MNasa 7,8. Debido a las grandes similitudes entre CUT&Tag y CUT&RUN, los investigadores familiarizados con CUT&Tag se adaptarán fácilmente a la ejecución competente de CUT&RUN. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen algunas pequeñas diferencias entre CUT&Tag y CUT&RUN. Los protocolos CUT&RUN normalmente utilizan la concentración física de sal (~150 mM) en las etapas de lavado, mientras que en CUT&Tag, el tampón de lavado 300-Dig tiene un alto contenido de sal. Por lo tanto, CUT&Tag es bueno para controlar el fondo al perfilar marcas/variantes de histonas o factores de transcripción, ya que estas proteínas se unen directa y fuertemente al ADN1. CUT&Tag puede tener problemas al perfilar los factores asociados a la cromatina que no se unen directamente al ADN y muestran una afinidad débil con la cromatina. Los pasos de lavado con alto contenido de sal en CUT&Tag pueden eliminar los factores asociados a la cromatina y no causar señales en el resultado final. Aunque hay casos exitosos en los que CUT&Tag se puede utilizar para perfilar algunas proteínas no histonas / factores de transcripción9, todavía recomendamos CUT&RUN en lugar de CUT&Tag para perfilar proteínas asociadas a cromatina débilmente unidas.
Después de que los mamíferos alcanzan la edad adulta, sus tejidos musculares esqueléticos todavía contienen células madre musculares. Durante la lesión muscular, estas células madre pueden activarse y experimentar una expansión y diferenciación del número de células para regenerarlas fibras musculares dañadas. Estas células madre se conocen como células madre musculares/satélite (MuSC). Después de que las MuSC se aíslan de los animales o una vez activadas por una lesión muscular, comienzan a proliferar y se convierten en mioblastos.
Para obtener MuSCs a partir de la digestión del músculo esquelético de ratón, los marcadores de superficie MuSC como Vcam1 (Cd106), Cd34 y α7-integrina (Itga7) se utilizan a menudo individualmente o en combinaciones para enriquecer MuSCs durante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)11. Se ha demostrado que Cd31–/Cd45–/Sca1–/Vcam1+ es probablemente la mejor combinación de marcadores para obtener MuSCs12 con una pureza del >95%. El FACS puede aislar las MuSC puras justo después de digerir los músculos frescos. Sin embargo, si el diseño experimental no requiere MuSCs puros en su aislamiento, el pre-siembra es más rentable que el FACS para obtener mioblastos >90% puros (progenie de MuSC).
Las MuSC recién aisladas de ratones no proliferan de manera eficiente en el medio F10 de Ham suplementado con suero fetal bovino (FBS). Para expandir mejor el número de células de MuSC y obtener suficientes mioblastos, se debe usar suero de crecimiento bovino (BGS) en lugar de FBS. Sin embargo, si BGS no está disponible, el medio completo F10 de Ham (que contiene aproximadamente un 20% de FBS) se puede mezclar con un volumen igual de medio condicional de células T para promover drásticamente la expansión del mioblasto13. Por lo tanto, este protocolo también describirá la preparación de medios MuSC condicionados por medios de células T.
Y lo que es más importante, este protocolo proporciona un ejemplo completo de la realización de ensayos CUT&Tag H3K4me1 en mioblastos de ratón aislados de los músculos de las extremidades posteriores de ratón. Tenga en cuenta que este protocolo también se aplica a otros tipos de células y marcas de histonas y variantes de histonas, y los lectores solo necesitan optimizar el número de células o las cantidades de anticuerpos para sus casos en función del enriquecimiento de las marcas o variantes de histonas específicas que estudian.
Para poder ser utilizada en CUT&Tag o CUT&RUN, la Tn5 o MNasa debe fusionarse con la proteína A o la proteína G para producir pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNasa o pG-MNasa. Aparentemente, tanto la proteína A como la proteína G pueden fusionarse con estas enzimas al mismo tiempo para generar pA/G-Tn5 o pA/G-MNasa. La proteína A y la proteína G muestran afinidades diferenciales con las IgG de diferentes especies. Por lo tanto, la fusión de la proteína A y la proteína G juntas en la enzima puede superar este problema y hacer que la enzima sea compatible con anticuerpos de múltiples especies.
Protocol
Representative Results
Discussion
El número de células específico requerido en una determinada reacción CUT&Tag depende completamente del enriquecimiento de las marcas/variantes de histonas o proteínas de unión a la cromatina que se van a analizar. Normalmente, para marcas de histonas muy enriquecidas como H3K4me1, H3K4me3 y H3K27ac, etcétera, 25.000-50.000 mioblastos son suficientes para una reacción CUT&Tag. Sin embargo, algunas proteínas raras de unión a la cromatina pueden requerir hasta 250.000 células. El número de células utilizado en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Prioritaria Estratégica de la Academia China de Ciencias (XDA16020400 a PH); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32170804 a PH).
Materials
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
| Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
| Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
Referências
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