골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 골수 미세환경 집단 식별
Summary
여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 집단을 분리하고 특성화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 질병 진행에 따라 내피 및 중간엽 기질 세포를 포함한 비조혈 골수 틈새의 변화를 식별합니다.
Abstract
골수 미세환경은 조혈모세포(HSC)를 지원하는 중간엽 기질 세포, 내피 세포, 골계통 세포 및 섬유아세포와 같은 별개의 세포 집단으로 구성됩니다. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 골수이형성 증후군(MDS) 및 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 조혈모세포 질환의 발병에도 중요한 역할을 합니다. HSC의 MDS 관련 돌연변이는 특히 노인에서 분화 및 진행성 골수 부전의 차단을 유발합니다. MDS는 종종 미성숙 골수성 모세포의 빠른 축적을 특징으로 하는 질병인 치료 저항성 AML로 진행될 수 있습니다. 골수 미세환경은 이러한 골수성 신생물 환자에서 변형되는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서는 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병의 쥐 모델에서 골수 미세환경 세포를 분리하고 표현형적으로 특성화하기 위한 포괄적인 프로토콜이 설명됩니다. 골수 틈새 집단의 변화를 분리하고 특성화하면 질병 시작 및 진행에서 이들의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있으며 골수 기질 집단의 암 촉진 변화를 표적으로 하는 새로운 치료법의 개발로 이어질 수 있습니다.
Introduction
골수 미세환경은 조혈 세포, 비조혈 기질 세포 및 세포외 기질 1,2로 구성됩니다. 이 미세환경은 조혈모세포의 자가재생을 촉진하고, 계통 분화를 조절하며, 뼈 조직 1,2,3,4,5에 구조적 및 기계적 지원을 제공할 수 있습니다. 기질 틈새는 골선세포, 섬유아세포, 신경세포, 내피세포6를 포함하며, 조혈 틈새는 림프구와 골수성 집단으로 구성된다 1,2,3. 골수 미세환경은 정상적인 HSC를 지원하는 것 외에도 MDS 및 AML 7,8,9,10,11과 같은 조혈모세포 질환의 발병에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 골혈통 세포의 돌연변이는 MDS, AML 및 기타 골수증식성 신생물의 발달을 촉진하는 것으로 나타났습니다 10,12,13,14.
골수이형성 증후군은 조혈모세포의 돌연변이로 인해 발생하는 백혈병 전단계 질환군입니다. MDS는 종종 HSC 분화 및 이형성 세포의 생성을 차단하는 것과 관련이 있으며, 이는 종종 골수 부전으로 이어질 수 있습니다. MDS는 미국에서 가장 흔하게 진단되는 골수성 신생물이며 3년 생존율은 35%-45%입니다15. MDS는 종종 급성 골수성 백혈병으로 전이될 위험이 높습니다. MDS에서 파생된 AML은 대부분의 치료에 내성이 있고 재발할 가능성이 높기 때문에 이는 치명적인 합병증이 될 수 있습니다. 조혈 줄기 및 전구 세포의 전위 또는 돌연변이로 인해 발생하는 AML은 종종 표준 화학 요법에 내성이 있습니다16,17. MDS와 AML은 주로 노인의 질병이며 대다수가 60세 이상이기 때문에 대부분의 환자는 근치적 골수 이식을 받을 수 없습니다. 따라서 질병 진행의 새로운 조절자를 규명할 필요가 있습니다. 골수 미세환경은 악성 세포를 지원할 수 있기 때문에14, 질병 진행에 따른 골수 틈새의 변화를 정의하면 종양 틈새 리모델링을 억제하는 것을 목표로 하는 새로운 치료법을 식별할 수 있습니다. 따라서 질병 진행의 새로운 조절자를 규명할 필요가 있습니다. 이를 위해서는 악성 세포를 지원할 수 있는 골수 기질 세포 집단의 변화를 식별하고 특성화하는 것이 중요합니다.
AML 및 MDS의 여러 쥐 모델이 생성되었으며 질병 시작 및 진행 중 골수 미세환경의 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 6,1,19,20,21,22. 여기서, 후비랄 유도 AML 6,20의 쥐 모델을 사용하여 골수 기질 세포 집단의 변화를 식별하기 위한 프로토콜과 AML 형질전환(19)의 고위험 MDS의 상업적으로 이용 가능한 Nup98-HoxD13(NHD13) 모델이 설명된다. de novo AML 세포를 이식한 마우스는 20-30일 내에 질병에 굴복한다6. NHD13 마우스는 15-20주 경에 혈구감소증과 골수 이형성증이 발생하여 결국 AML로 전환되며 마우스의 거의 75%가 32주경에 질병에 굴복합니다. 쥐 모델 골수 미세환경 집단을 분석하기 위해 뼈를 채취하고, 효소 소화를 사용하여 골수 및 뼈 스피큘을 소화한 다음, 자기 분류를 통해 CD45-/Ter119- 비조혈 집단에 대해 세포를 농축합니다. 유사한 분석이 이전에 기술되었지만11,13,22,23,24,25 골수 또는 뼈에 초점을 맞추고 두 출처의 세포를 분석에 통합하지 않습니다. 유전자 발현 분석과 함께 이러한 집단의 결합된 특성 분석은 세포 조혈 미세환경이 질병 시작 및 진행을 어떻게 지원하는지에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다(그림 1). 아래에 설명된 프로토콜은 후귀바이러스로 유도된 AML 모델 및 유전적 MDS 모델에 중점을 두고 있지만, 이러한 전략은 관심 있는 쥐 모델의 골수 틈새 시장을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
쥐 백혈병 모델은 공격적인 골수성 백혈병 진행을 촉진하는 세포 고유 및 틈새 유도 신호를 식별하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다 6,19,21. 여기에서는 MDS 및 AML의 쥐 모델에서 골수 미세환경의 세포 조성을 정의하기 위한 포괄적인 유세포 분석 기반 프로토콜을 제시합니다.
실험 샘플에서 유세포 분석 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
URMC 유세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 연구는 미국 혈액학회 학술상, 백혈병 연구 재단 상, NIH 보조금 R01DK133131 및 J.B.에 수여된 R01CA266617의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
| 10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
| 10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
| 1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
| 2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
| 200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
| 25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
| 5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
| 6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
| APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
| BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
| CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
| Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
| Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
| Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
| Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
| Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
| DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
| Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
| Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Incubator | BINDER | C150-UL | |
| Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
| LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
| LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
| LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
| MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
| MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
| mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
| Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
| PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
| PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
| Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
| Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
| TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
Referências
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
- Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).
- Kfoury, Y., Scadden, D. T. Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche. Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Bajaj, J., et al. Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia. Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).
- Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting. J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).
- Kim, Y. W., et al. Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease. Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).
- Walkley, C. R., et al. A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency. Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating β-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
- Raaijmakers, M. H., et al. Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
- Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. Stem cells in cancer initiation and progression. J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).
- Sekeres, M. A., Taylor, J. Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review. Jama. 328 (9), 872-880 (2022).
- Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. Snapshot: Acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).
- Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development. Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).
- Yoshimi, A., et al. Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis. Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Kwon, H. Y., et al. Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia. Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).
- Bajaj, J., et al. An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia. Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).
- Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
- Balderman, S. R., et al. Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome. Blood. 127 (5), 616-625 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. JoVE. 110, e53936 (2016).
- JoVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , (2023).
- Passaro, D., et al. Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response. Blood. 128 (22), 2662 (2016).
- Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).
- Baccin, C., et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).
- Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. Collagen IV in normal skin and in pathological processes. N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).
