Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.
De micro-omgeving van het beenmerg bestaat uit verschillende celpopulaties, zoals mesenchymale stromale cellen, endotheelcellen, osteolineagecellen en fibroblasten, die ondersteuning bieden aan hematopoëtische stamcellen (HSC’s). Naast het ondersteunen van normale HSC’s, speelt de micro-omgeving van het beenmerg ook een rol bij de ontwikkeling van hematopoëtische stamcelaandoeningen, zoals myelodysplastische syndromen (MDS) en acute myeloïde leukemie (AML). MDS-geassocieerde mutaties in HSC’s leiden tot een blokkade in differentiatie en progressief beenmergfalen, vooral bij ouderen. MDS kan vaak evolueren naar therapieresistente AML, een ziekte die wordt gekenmerkt door een snelle accumulatie van onrijpe myeloïde blasten. Het is bekend dat de micro-omgeving van het beenmerg veranderd is bij patiënten met deze myeloïde neoplasmata. Hier wordt een uitgebreid protocol beschreven voor het isoleren en fenotypisch karakteriseren van micro-omgevingscellen in het beenmerg van muizenmodellen van myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie. Het isoleren en karakteriseren van veranderingen in de nichepopulaties van het beenmerg kan helpen bij het bepalen van hun rol bij het ontstaan en de progressie van de ziekte en kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën die gericht zijn op kankerbevorderende veranderingen in de stromale populaties van het beenmerg.
De micro-omgeving van het beenmerg bestaat uit hematopoëtische cellen, niet-hematopoëtische stromale cellen en de extracellulaire matrix 1,2. Deze micro-omgeving kan de zelfvernieuwing van hematopoëtische stamcellen bevorderen, de differentiatie van de afstamming reguleren en structurele en mechanische ondersteuning bieden aan het botweefsel 1,2,3,4,5. De stromale niche omvat osteolineagecellen, fibroblasten, zenuwcellen en endotheelcellen6, terwijl de hematopoëtische niche bestaat uit de lymfoïde en myeloïde populaties 1,2,3. Naast het ondersteunen van normale HSC’s, kan de micro-omgeving van het beenmerg ook een rol spelen bij de ontwikkeling van hematopoëtische stamcelaandoeningen zoals MDS en AML 7,8,9,10,11. Van mutaties in osteolineagecellen is aangetoond dat ze de ontwikkeling van MDS, AML en andere myeloproliferatieve neoplasmata bevorderen 10,12,13,14.
Myelodysplastische syndromen zijn een groep pre-leukemische aandoeningen die voortkomen uit mutaties in hematopoëtische stamcellen. MDS wordt vaak geassocieerd met een blokkade in HSC-differentiatie en de productie van dysplastische cellen, wat vaak kan leiden tot beenmergfalen. MDS is het meest gediagnosticeerde myeloïde neoplasma in de Verenigde Staten en wordt geassocieerd met een 3-jaarsoverleving van 35%-45%15. MDS wordt vaak geassocieerd met een hoog risico op transformatie naar acute myeloïde leukemie. Dit kan een fatale complicatie zijn, aangezien MDS-afgeleide AML resistent is tegen de meeste therapieën en waarschijnlijk terugvalt. AML dat de novo ontstaat als gevolg van translocaties of mutaties in hematopoëtische stam en voorlopercellen is ook vaak resistent tegen standaard chemotherapie16,17. Aangezien MDS en AML voornamelijk ouderenziekten zijn, waarvan de meerderheid ouder dan 60 jaar wordt gediagnosticeerd, komen de meeste patiënten niet in aanmerking voor curatieve beenmergtransplantaties. Er is dus een grote behoefte om nieuwe regulatoren van ziekteprogressie te identificeren. Aangezien de micro-omgeving van het beenmerg ondersteuning kan bieden aan kwaadaardige cellen14, kan het definiëren van veranderingen in de beenmergniche met ziekteprogressie leiden tot de identificatie van nieuwe therapieën die gericht zijn op het remmen van de remodellering van tumorniches. Er is daarom een grote behoefte aan het identificeren van nieuwe regulatoren van ziekteprogressie. Daartoe is het van cruciaal belang om veranderingen in de stromale celpopulaties van het beenmerg te identificeren en te karakteriseren die ondersteuning kunnen bieden aan de kwaadaardige cellen.
Er zijn verschillende muizenmodellen van AML en MDS gegenereerd die kunnen worden gebruikt om veranderingen in de micro-omgeving van het beenmerg te bestuderen tijdens het begin en de progressie van de ziekte 6,1,19,20,21,22. Hier worden protocollen beschreven om veranderingen in de stromale celpopulaties van het beenmerg te identificeren met behulp van muizenmodellen van retroviraal geïnduceerde AML 6,20, evenals het in de handel verkrijgbare Nup98-HoxD13 (NHD13)-model van MDS naar AML-transformatie met een hoog risico19. Muizen die zijn getransplanteerd met de novo AML-cellen bezwijken binnen 20-30 dagen aan de ziekte. De NHD13-muizen ontwikkelen cytopenieën en beenmergdysplasie rond 15-20 weken, die uiteindelijk verandert in AML, en bijna 75% van de muizen bezwijkt rond 32 weken aan de ziekte. Om de micro-omgevingspopulaties van het muizenmodel in het beenmerg te analyseren, worden botten geoogst, worden beenmerg en botspicules verteerd met behulp van enzymatische spijsvertering en worden de cellen vervolgens verrijkt voor CD45-/Ter119-niet-hematopoëtische populaties door magnetische sortering. Hoewel vergelijkbare analyses eerder zijn beschreven 11,13,22,23,24,25, richten ze zich vaak op het beenmerg of het bot en nemen ze geen cellen uit beide bronnen op in hun analyses. De gecombineerde karakterisering van deze populaties, in combinatie met genexpressie-analyses, kan een uitgebreid inzicht verschaffen in hoe de cellulaire hematopoëtische micro-omgeving ondersteuning biedt voor het ontstaan en de progressie van de ziekte (Figuur 1). Hoewel het hieronder beschreven protocol zich richt op retroviraal geïnduceerd AML-model en een genetisch MDS-model, kunnen deze strategieën gemakkelijk worden aangepast om veranderingen in de beenmergniche van elk muizenmodel van belang te bestuderen.
Modellen voor leukemie bij muizen zijn op grote schaal gebruikt om intrinsieke en nichegestuurde signalen van cellen te identificeren die de progressie van agressieve myeloïde leukemie bevorderen 6,19,21. Hier wordt een uitgebreid op flowcytometrie gebaseerd protocol gepresenteerd om de cellulaire samenstelling van de micro-omgeving van het beenmerg in muizenmodellen van MDS en AML te definiëren.
Vo…
The authors have nothing to disclose.
We willen de URMC Flow Cytometry Core bedanken. Dit werk werd ondersteund door de American Society of Hematology Scholar Award, de Leukemia Research Foundation Award en NIH-beurzen R01DK133131 en R01CA266617 toegekend aan JB.
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |