هنا يتم تقديم بروتوكول مفصل لعزل وتوصيف مجموعات البيئة الدقيقة لنخاع العظم من نماذج الفئران لمتلازمات خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد. تحدد هذه التقنية التغيرات في مكانة نخاع العظم غير المكونة للدم ، بما في ذلك الخلايا اللحمية البطانية واللحمة المتوسطة ، مع تطور المرض.
تتكون البيئة المكروية لنخاع العظم من مجموعات خلايا متميزة ، مثل الخلايا اللحمية المتوسطة ، والخلايا البطانية ، وخلايا النسب العظمي ، والخلايا الليفية ، والتي توفر الدعم للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). بالإضافة إلى دعم HSCs الطبيعية ، تلعب البيئة المكروية لنخاع العظم أيضا دورا في تطوير اضطرابات الخلايا الجذعية المكونة للدم ، مثل متلازمات خلل التنسج النقوي (MDS) وسرطان الدم النخاعي الحاد (AML). تؤدي الطفرات المرتبطة ب MDS في HSCs إلى كتلة في التمايز وفشل نخاع العظم التدريجي ، خاصة عند كبار السن. يمكن أن تتطور متلازمات خلل التنسج النقي في كثير من الأحيان إلى ابيضاض الدم النقوي الحاد المقاوم للعلاج، وهو مرض يتميز بالتراكم السريع للأرومات النخاعية غير الناضجة. من المعروف أن البيئة المكروية لنخاع العظم تتغير في المرضى الذين يعانون من هذه الأورام النخاعية. هنا ، يتم وصف بروتوكول شامل لعزل وتوصيف الخلايا البيئية الدقيقة لنخاع العظم من نماذج الفئران لمتلازمة خلل التنسج النقوي وسرطان الدم النخاعي الحاد. يمكن أن يساعد عزل وتوصيف التغيرات في مجموعات نخاع العظم المتخصصة في تحديد دورها في بدء المرض وتطوره وقد يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة تستهدف التغيرات المعززة للسرطان في مجموعات انسجة نخاع العظم.
تتكون البيئة المكروية لنخاع العظم من خلايا مكونة للدم ، وخلايا انسجة غير مكونة للدم ، ومصفوفة خارج الخلية 1,2. يمكن لهذه البيئة المكروية أن تعزز التجديد الذاتي للخلايا الجذعية المكونة للدم ، وتنظيم تمايز النسب ، وتوفير الدعم الهيكلي والميكانيكي للأنسجة العظمية1،2،3،4،5. يشمل مكانة اللحمية خلايا النسب العظمي والخلايا الليفية والخلايا العصبية والخلايا البطانية6 ، بينما يتكون مكان المكونة للدم من السكان اللمفاويين والنخاعيين1،2،3. بالإضافة إلى دعم HSCs الطبيعية ، يمكن أن تلعب البيئة المكروية لنخاع العظم أيضا دورا في تطوير اضطرابات الخلايا الجذعية المكونة للدم مثل MDS و AML7،8،9،10،11. وقد تبين أن الطفرات في خلايا السلالة العظمية تعزز تطور متلازمات خلل التنسج النقي وابيضاض الدم النقوي وغيرها من الأورام التكاثريةالنقوية 10،12،13،14.
متلازمات خلل التنسج النقوي هي مجموعة من اضطرابات ما قبل اللوكيميا التي تنشأ من طفرات في الخلايا الجذعية المكونة للدم. كثيرا ما يرتبط متلازمات خلل التنسج النقي بكتلة في تمايز HSC وإنتاج خلايا خلل التنسج، والتي يمكن أن تؤدي غالبا إلى فشل نخاع العظم. متلازمات خلل التنسج النقي هي أكثر الأورام النخاعية التي يتم تشخيصها شيوعا في الولايات المتحدة وترتبط بمعدل بقاء لمدة 3 سنوات من 35٪ -45٪ 15. غالبا ما يرتبط متلازمات خلل التنسج النقي بارتفاع خطر التحول إلى ابيضاض الدم النخاعي الحاد. يمكن أن يكون هذا من المضاعفات القاتلة ، حيث أن ابيضاض الدم النقوي الحاد المشتق من متلازمات خلل التنسج النقي مقاوم لمعظم العلاجات ومن المحتمل أن ينتكس. ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) الذي ينشأ من جديد بسبب عمليات النقل أو الطفرات في الجذع والأسلاف المكونة للدم غالبا ما يكون مقاوما للعلاج الكيميائي القياسي16,17. نظرا لأن MDS و AML هما في المقام الأول أمراض كبار السن ، حيث يتم تشخيص الغالبية فوق سن 60 عاما ، فإن معظم المرضى غير مؤهلين لعمليات زرع نخاع العظم العلاجية. وبالتالي ، هناك حاجة كبيرة لتحديد المنظمين الجدد لتطور المرض. نظرا لأن البيئة المكروية لنخاع العظم يمكن أن توفر الدعم للخلايا الخبيثة14 ، فإن تحديد التغييرات في مكانة نخاع العظم مع تطور المرض قد يؤدي إلى تحديد علاجات جديدة تهدف إلى تثبيط إعادة تشكيل مكانة الورم. لذلك ، هناك حاجة كبيرة لتحديد منظمات جديدة لتطور المرض. تحقيقا لهذه الغاية ، من الأهمية بمكان تحديد وتوصيف التغيرات في مجموعات الخلايا اللحمية في نخاع العظم التي قد توفر الدعم للخلايا الخبيثة.
تم إنشاء العديد من نماذج الفئران من AML و MDS ويمكن استخدامها لدراسة التغيرات في البيئة المكروية لنخاع العظم أثناء بدء المرض وتطوره6،1،19،20،21،22. هنا ، يتم وصف بروتوكولات لتحديد التغيرات في مجموعات الخلايا اللحمية في نخاع العظم باستخدام نماذج الفئران من AML 6,20 المستحث بالفيروسات القهقرية ، بالإضافة إلى نموذج Nup98-HoxD13 (NHD13) المتاح تجاريا من MDS عالية الخطورة لتحويلAML 19. الفئران المزروعة بخلايا دي نوفو AML تستسلم للمرض في 20-30 يوما6. تصاب الفئران NHD13 بنقص الخلايا وخلل التنسج في نخاع العظم حوالي 15-20 أسبوعا ، والذي يتحول في النهاية إلى AML ، ويستسلم ما يقرب من 75٪ من الفئران للمرض حوالي 32 أسبوعا. لتحليل مجموعات البيئة المكروية لنخاع العظم النموذجية للفئران ، يتم حصاد العظام ، ويتم هضم نخاع العظم والشويكات العظمية باستخدام الهضم الأنزيمي ، ثم يتم إثراء الخلايا ل CD45- / Ter119- المجموعات غير المكونة للدم عن طريق الفرز المغناطيسي. في حين تم وصف تحليلات مماثلة سابقا11،13،22،23،24،25 ، فإنها غالبا ما تركز على نخاع العظم أو العظم ولا تدمج خلايا من كلا المصدرين في تحليلاتها. يمكن أن يوفر التوصيف المشترك لهذه المجموعات ، جنبا إلى جنب مع تحليلات التعبير الجيني ، فهما شاملا لكيفية توفير البيئة المكروية المكونة للدم الخلوية الدعم لبدء المرض وتطوره (الشكل 1). بينما يركز البروتوكول الموضح أدناه على نموذج AML المستحث بالفيروسات القهقرية ونموذج MDS الوراثي ، يمكن تكييف هذه الاستراتيجيات بسهولة لدراسة التغيرات في مكانة نخاع العظم لأي نموذج فأر مهم.
تم استخدام نماذج سرطان الدم الفئران على نطاق واسع لتحديد الإشارات الجوهرية للخلايا والمتخصصة التي تعزز تطور سرطان الدم النخاعي العدواني6،19،21. هنا ، يتم تقديم بروتوكول شامل قائم على قياس التدفق الخلوي لتحديد التركيب الخلوي للبيئة الدقيق…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر نواة قياس التدفق الخلوي URMC. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة الجمعية الأمريكية لعلماء أمراض الدم ، وجائزة مؤسسة أبحاث اللوكيميا ومنح المعاهد الوطنية للصحة R01DK133131 R01CA266617 منح ل JB
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |