Her presenteres en detaljert protokoll for å isolere og karakterisere benmargens mikromiljøpopulasjoner fra murine modeller av myelodysplastiske syndromer og akutt myelogen leukemi. Denne teknikken identifiserer endringer i den ikke-hematopoietiske benmargnisjen, inkludert endotel- og mesenkymale stromale celler, med sykdomsprogresjon.
Benmargens mikromiljø består av forskjellige cellepopulasjoner, som mesenkymale stromale celler, endotelceller, osteolineageceller og fibroblaster, som gir støtte til hematopoietiske stamceller (HSC). I tillegg til å støtte normale HSC, spiller benmargens mikromiljø også en rolle i utviklingen av hematopoietiske stamcelleforstyrrelser, som myelodysplastisk syndrom (MDS) og akutt myelogen leukemi (AML). MDS-assosierte mutasjoner i HSC fører til en blokk i differensiering og progressiv benmargssvikt, spesielt hos eldre. MDS kan ofte utvikle seg til terapiresistent AML, en sykdom preget av en rask akkumulering av umodne myeloide blaster. Benmargens mikromiljø er kjent for å være endret hos pasienter med disse myeloide neoplasmene. Her beskrives en omfattende protokoll for å isolere og fenotypisk karakterisere benmargsmikromiljøceller fra murinmodeller av myelodysplastisk syndrom og akutt myelogen leukemi. Isolering og karakterisering av endringer i benmargens nisjepopulasjoner kan bidra til å bestemme deres rolle i sykdomsinitiering og progresjon, og kan føre til utvikling av nye terapeutiske midler rettet mot kreftfremmende endringer i benmargsstromale populasjoner.
Benmargens mikromiljø består av hematopoietiske celler, ikke-hematopoietiske stromale celler og den ekstracellulære matriksen 1,2. Dette mikromiljøet kan fremme hematopoietisk stamcellefornyelse, regulere avstamningsdifferensiering og gi strukturell og mekanisk støtte til beinvevet 1,2,3,4,5. Den stromale nisjen inkluderer osteolineageceller, fibroblaster, nerveceller og endotelceller6, mens den hematopoietiske nisjen består av lymfoide og myeloide populasjoner 1,2,3. I tillegg til å støtte normale HSC-er, kan benmargens mikromiljø også spille en rolle i utviklingen av hematopoietiske stamcelleforstyrrelser som MDS og AML 7,8,9,10,11. Mutasjoner i osteolineære celler har vist seg å fremme utviklingen av MDS, AML og andre myeloproliferative neoplasmer 10,12,13,14.
Myelodysplastisk syndrom er en gruppe pre-leukemiske lidelser som oppstår fra mutasjoner i hematopoietiske stamceller. MDS er ofte forbundet med en blokk i HSC-differensiering og produksjon av dysplastiske celler, noe som ofte kan føre til benmargssvikt. MDS er den mest diagnostiserte myeloide neoplasma i USA og er forbundet med en 3-års overlevelse på 35% -45%15. MDS er ofte forbundet med høy risiko for transformasjon til akutt myelogen leukemi. Dette kan være en dødelig komplikasjon, da MDS-avledet AML er motstandsdyktig mot de fleste terapier og sannsynligvis vil komme tilbake. AML som oppstår de novo på grunn av translokasjoner eller mutasjoner i hematopoietisk stamme og forfedre er også ofte resistent mot standard kjemoterapi16,17. Siden MDS og AML primært er sykdommer hos eldre, med flertallet diagnostisert over 60 år, er de fleste pasienter ikke kvalifisert for kurative benmargstransplantasjoner. Det er derfor et betydelig behov for å identifisere nye regulatorer av sykdomsprogresjon. Siden benmargens mikromiljø kan gi støtte til ondartede celler14, kan definering av endringer i benmargsnisjen med sykdomsprogresjon føre til identifisering av nye terapier som tar sikte på å hemme tumornisjeremodellering. Det er derfor et betydelig behov for å identifisere nye regulatorer av sykdomsprogresjon. For dette formål er det avgjørende å identifisere og karakterisere endringer i benmargsstromale cellepopulasjoner som kan gi støtte til de ondartede cellene.
Flere murine modeller av AML og MDS har blitt generert og kan brukes til å studere endringer i benmargens mikromiljø under sykdomsstart og progresjon 6,1,19,20,21,22. Her beskrives protokoller for å identifisere endringer i benmargsstromale cellepopulasjoner ved bruk av murine modeller av retroviralt indusert AML 6,20, samt den kommersielt tilgjengelige Nup98-HoxD13 (NHD13) modellen av høyrisiko MDS til AML transformasjon19. Mus transplantert med de novo AML-celler bukker under for sykdommen i 20-30 dager6. NHD13-musene utvikler cytopenier og benmargsdysplasi rundt 15-20 uker, som til slutt forvandles til AML, og nesten 75% av musene bukker under for sykdommen rundt 32 uker. For å analysere murine modellen benmarg mikromiljø populasjoner, blir bein høstet, benmarg og bein spicules fordøyes ved hjelp av enzymatisk fordøyelse, og cellene blir deretter beriket for CD45-/Ter119- ikke-hematopoietiske populasjoner ved magnetisk sortering. Mens lignende analyser tidligere er beskrevet 11,13,22,23,24,25, fokuserer de ofte på enten benmargen eller beinet og inkluderer ikke celler fra begge kilder i sine analyser. Den kombinerte karakteriseringen av disse populasjonene, sammen med genuttrykksanalyser, kan gi en helhetlig forståelse av hvordan det cellulære hematopoietiske mikromiljøet gir støtte til sykdomsinitiering og progresjon (figur 1). Mens protokollen beskrevet nedenfor fokuserer på retroviralt indusert AML-modell og en genetisk MDS-modell, kan disse strategiene lett tilpasses for å studere endringer i beinmargnisjen til enhver murine modell av interesse.
Murine leukemi modeller har blitt mye brukt til å identifisere celle inneboende og nisje-drevet signaler som fremmer aggressiv myelogen leukemi progresjon 6,19,21. Her presenteres en omfattende flowcytometribasert protokoll for å definere den cellulære sammensetningen av benmargens mikromiljø i murine modeller av MDS og AML.
Før innhenting av flowcytometriske data fra eksperimentelle prøver er d…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker URMC Flow Cytometry Core. Dette arbeidet ble støttet av American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award og NIH tilskudd R01DK133131 og R01CA266617 tildelt JB
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |