Här presenteras ett detaljerat protokoll för att isolera och karakterisera benmärgsmikromiljöpopulationer från murina modeller av myelodysplastiska syndrom och akut myeloisk leukemi. Denna teknik identifierar förändringar i den icke-hematopoetiska benmärgsnischen, inklusive endotel- och mesenkymala stromaceller, med sjukdomsprogression.
Benmärgens mikromiljö består av distinkta cellpopulationer, såsom mesenkymala stromaceller, endotelceller, osteolineageceller och fibroblaster, som ger stöd till hematopoetiska stamceller (HSC). Förutom att stödja normala HSCs spelar benmärgens mikromiljö också en roll i utvecklingen av hematopoetiska stamcellssjukdomar, såsom myelodysplastiska syndrom (MDS) och akut myeloisk leukemi (AML). MDS-associerade mutationer i HSC leder till en blockering av differentiering och progressiv benmärgssvikt, särskilt hos äldre. MDS kan ofta utvecklas till behandlingsresistent AML, en sjukdom som kännetecknas av en snabb ackumulering av omogna myeloida blaster. Det är känt att benmärgens mikromiljö är förändrad hos patienter med dessa myeloida tumörer. Här beskrivs ett omfattande protokoll för att isolera och fenotypiskt karakterisera benmärgens mikromiljöceller från murina modeller av myelodysplastiskt syndrom och akut myeloisk leukemi. Att isolera och karakterisera förändringar i benmärgsnischpopulationerna kan hjälpa till att bestämma deras roll i sjukdomsinitiering och progression och kan leda till utveckling av nya terapier som riktar sig mot cancerfrämjande förändringar i benmärgens stromapopulationer.
Benmärgens mikromiljö består av hematopoetiska celler, icke-hematopoetiska stromaceller och den extracellulära matrixen 1,2. Denna mikromiljö kan främja hematopoetisk självförnyelse av stamceller, reglera härstamningsdifferentiering och ge strukturellt och mekaniskt stöd till benvävnaden 1,2,3,4,5. Den stromala nischen inkluderar osteolineageceller, fibroblaster, nervceller och endotelceller6, medan den hematopoetiska nischen består av de lymfoida och myeloida populationerna 1,2,3. Förutom att stödja normala HSC kan benmärgens mikromiljö också spela en roll i utvecklingen av hematopoetiska stamcellssjukdomar som MDS och AML 7,8,9,10,11. Mutationer i osteolineageceller har visat sig främja utvecklingen av MDS, AML och andra myeloproliferativa tumörer 10,12,13,14.
Myelodysplastiska syndrom är en grupp pre-leukemiska sjukdomar som uppstår på grund av mutationer i hematopoetiska stamceller. MDS är ofta förknippat med en blockering av HSC-differentiering och produktion av dysplastiska celler, vilket ofta kan leda till benmärgssvikt. MDS är den vanligaste diagnostiserade myeloida tumören i USA och är förknippad med en 3-årsöverlevnad på 35%-45%15. MDS är ofta förknippat med en hög risk för omvandling till akut myeloisk leukemi. Detta kan vara en dödlig komplikation, eftersom MDS-härledd AML är resistent mot de flesta behandlingar och sannolikt kommer att återfalla. AML som uppstår de novo på grund av translokationer eller mutationer i hematopoetisk stam och progenitorer är också ofta resistent mot standardkemoterapi16,17. Eftersom MDS och AML främst är sjukdomar hos äldre, med majoriteten diagnostiserade över 60 års ålder, är de flesta patienter inte lämpliga för botande benmärgstransplantationer. Det finns därför ett stort behov av att identifiera nya regulatorer för sjukdomsprogression. Eftersom benmärgens mikromiljö kan ge stöd till maligna celler14, kan bestämning av förändringar i benmärgsnischen med sjukdomsprogression leda till identifiering av nya terapier som syftar till att hämma ombyggnad av tumörnischen. Det finns därför ett stort behov av att identifiera nya regulatorer för sjukdomsprogression. För detta ändamål är det viktigt att identifiera och karakterisera förändringar i benmärgens stromacellspopulationer som kan ge stöd till de maligna cellerna.
Flera murina modeller av AML och MDS har genererats och kan användas för att studera förändringar i benmärgens mikromiljö under sjukdomsinitiering och progression 6,1,19,20,21,22. Här beskrivs protokoll för att identifiera förändringar i benmärgens stromacellspopulationer med hjälp av murina modeller av retroviralt inducerad AML 6,20, samt den kommersiellt tillgängliga Nup98-HoxD13 (NHD13) modellen av högrisk MDS till AML-transformation19. Möss som transplanterats med de novo AML-celler dukar under för sjukdomen inom 20-30 dagar6. NHD13-mössen utvecklar cytopenier och benmärgsdysplasi runt 15-20 veckor, vilket så småningom omvandlas till AML, och nästan 75 % av mössen dukar under för sjukdomen runt 32 veckor. För att analysera musmodellens benmärgsmikromiljöpopulationer skördas ben, benmärg och benspikler smälts med hjälp av enzymatisk nedbrytning, och cellerna anrikas sedan för CD45-/Ter119- icke-hematopoetiska populationer genom magnetisk sortering. Liknande analyser har tidigare beskrivits 11,13,22,23,24,25, men de fokuserar ofta på antingen benmärgen eller benet och tar inte med celler från båda källorna i sina analyser. Den kombinerade karakteriseringen av dessa populationer, i kombination med genuttrycksanalyser, kan ge en omfattande förståelse för hur den cellulära hematopoetiska mikromiljön ger stöd för sjukdomsinitiering och progression (Figur 1). Även om protokollet som beskrivs nedan fokuserar på retroviralt inducerad AML-modell och en genetisk MDS-modell, kan dessa strategier enkelt anpassas för att studera förändringar i benmärgsnischen hos alla musmodeller av intresse.
Modeller för musleukemi har använts i stor utsträckning för att identifiera cellinneboende och nischdrivna signaler som främjar progression av aggressiv myeloisk leukemi 6,19,21. Här presenteras ett omfattande flödescytometribaserat protokoll för att definiera den cellulära sammansättningen av benmärgens mikromiljö i murina modeller av MDS och AML.
Innan flödescytometriska data samlas in …
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka URMC Flow Cytometry Core. Detta arbete stöddes av American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation Award och NIH-anslag R01DK133131 och R01CA266617 som tilldelats J.B.
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |