Summary
生体適合性のあるリグニンマイクロおよびサブミクロン粒子の合成と特性評価の新しい簡単な方法について説明します。これらの製剤は、ヘテロポリマーを利用するための容易なアプローチを提供するだけでなく、生物医学、製薬技術、および食品産業への適用性が期待できる多機能キャリアマトリックスの合理的な設計の代替手段を提供します。
Abstract
ヒト、獣医学、製薬、および食品技術におけるバイオポリマーマイクロ/ナノテクノロジーの適用可能性は、効果的なキャリアシステムとしてのバイオポリマーベースの粒子の大きな可能性により急速に成長しています。革新的なマイクロ/サブミクロン製剤の設計のための基本的なヘテロポリマーバイオマトリックスとしてリグニンを使用することで、生体適合性の向上を達成でき、さまざまな活性官能基を提供し、さまざまな用途向けに製剤の物理化学的特性と生物活性をカスタマイズする機会を提供します。本研究の目的は、マイクロミクロンおよびサブミクロンサイズのリグニン粒子を合成するためのシンプルで環境に優しい方法論を開発することでした。それらの物理化学的、スペクトル的、および構造的特性を評価すること。また、生物学的に活性な分子をカプセル化する能力と、シミュレートされた胃腸培地でのバイオフラボノイドの in vitro 放出の可能性を調べること。提示された方法論は、安価で環境に優しい溶媒を適用します。簡単な、わかりやすい、迅速で感度の高いプロセスで、わずかな機器、無毒の物質、およびそれらの特性評価、難水溶性の生理活性化合物であるモリンとケルセチンに対するカプセル化能力の決定、リグニンマトリックスの in vitro 放出の可能性など、簡単な方法が必要です。
Introduction
今日では、セルロース、キトサン、コラーゲン、デキストラン、ゼラチン、リグニンなどの生体高分子が、カスタマイズ可能なサイズ、物理化学的特性、および生体機能性を備えたマイクロ/サブミクロン担体を設計するための前駆体として、組織工学、3Dバイオプリンティング、in vitroでの適用性により、生物医学、製薬、および食品技術業界で増加しています疾患モデリングプラットフォーム、包装産業、エマルジョン調製、栄養素送達など1,2,3.
新しい研究は、食品包装材料5、エネルギー貯蔵6、化粧品7、疎水性分子の送達のための熱/光安定剤、強化材料、および薬物担体マトリックス8、UVバリアの改善9に使用される有利な媒体として、リグニンベースのハイドロゲルおよびマイクロおよびナノ製剤4の側面を強調しています、ナノ複合材料の強化剤として、および最近のいくつかの安全性の問題による無機ナノ粒子の代替として10,11,12。この傾向の背後にある理由は、天然ヘテロ生体高分子の生体適合性、生分解性、および非毒性、ならびにリグニン-抗酸化能およびラジカル捕捉活性、抗増殖活性、および抗菌活性の証明された生物活性である13,14,15,16,17。
科学文献では、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N、N-ジメチルホルムアミド(DMF)、アセトンなどの高価で有害な溶媒の適用、および多くの機器と有毒物質を使用する複雑で間接的で退屈なプロセスを含む、リグニンベースのマイクロ/ナノスケール製剤の特性評価のためのさまざまな方法(自己組織化、抗溶媒沈殿、酸沈殿、溶媒シフト)18、およびリグニンベースのマイクロ/ナノスケール製剤の特性評価が報告されています12、19,20。
後者の欠点を克服するために、以下のプロトコルは、安価でグリーンな溶媒を使用してリグニンベースのマイクロ/サブミクロン粒子を合成するための新しい方法論を提示します。簡単な、わかりやすく、迅速で、敏感なプロセスで、わずかな機器、無毒の物質、およびそれらの特性評価と、難水溶性の生理活性化合物に対するカプセル化能力とリグニンマトリックスの in vitro 放出電位の決定のための簡単な方法が必要です。提示されたラボスケールの製造方法は、生物医科学や食品技術のさまざまな分野で応用できる簡単な特性評価手順と環境に優しい化学物質を利用して、調整可能なサイズ、高いカプセル化能力、および持続可能な in vitro 放出挙動を備えた機能性リグニン担体の製造に有利です。リグニン粒子にカプセル化された標的分子として、モリンを微粒子に、ケルセチンをサブミクロン粒子に、2つのフラボノイドを適用しました。両方のフラボノイドの構造の違い B-芳香族環の2番目の-OH基の位置だけです:-OH基はモリンの2'位とケルセチンの3'位にあるため、両方の有機化合物は位置異性体です。後者の事実は、カプセル化および/または放出の過程における両方の生理活性天然化合物の同様の挙動を推定する。
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Protocol
1. リグニン微粒子の合成
- マグネチックスターラーで50 mLの超純水に2.5 gのアルカリリグニンを溶解し、50 mg/mLのアルカリリグニン水溶液を調製します。
- 1 mLのTween 80を100 mLの超純水に溶解して、1%Tween 80溶液を調製します。
- 6.65 mLの67% HNO3(密度= 1.413 g/mL)を超純水で希釈し、最終容量50 mLまで希釈して、HNO3の2 M溶液を調製します。
- 1% Tween 80溶液15 mLを50 mg/mLアルカリリグニン溶液50 mLにゆっくりと加えます。
- 界面活性剤が十分に分散するように、500rpmで10分間マグネチックスターラーで混合物を攪拌します。
- 20 mLの2 M HNO3 をシリンジで約150 μL/sの流速で滴下して混合物に加えます。
- 暗褐色の溶液が微粒子の薄茶色の懸濁液に変換されるときに、混合物を30分間攪拌し続けます。
- 懸濁液を1.5〜2mLの試験管に移し、10°Cの超遠心分離機で15,000× g で30分間遠心分離します。
- さらなる分析のために上清を収集し、微粒子を超純水ですすいでください。
- すすぎ/超遠心分離手順を3回繰り返します。
- 超音波均質化の前に、微粒子を含む容器を氷浴に浸します。
- 超音波ホモジナイザーで93%の強度で4分間微粒子をホモジナイズします。
- 微粒子を凍結乾燥機で-64°Cの温度で凍結乾燥し、さらに使用するためにエキシケーターに保管します。
2. リグニンサブミクロン粒子の合成
- マグネチックスターラーでアルカリリグニン125mgを超純水25mLに溶解し、5mg/mLのアルカリリグニン水溶液を調製します。
- アルカリリグニン溶液に96%EtOH1mLをゆっくりと加えます。
- マグネチックスターラーで500rpmで3分間攪拌します。
- クエン酸0.5gを超純水に溶解し、最終容量50mLまでクエン酸1%溶液50mLを調製します。
- 7 mLの1%クエン酸をシリンジで約4 mL / minの流速で滴下して混合物に加えます。.
- 茶色の透明な溶液がサブミクロン粒子の濁った薄茶色の懸濁液に変わるまで、混合物を10分間攪拌し続けます。
- 懸濁液を試験管に移し、10°Cの超遠心分離機で15,000 × g で30分間遠心分離します。
- さらなる分析のために上清を収集し、微粒子を超純水ですすいでください。
- すすぎ/超遠心分離手順を3回繰り返します。
- 超音波均質化の前に、微粒子を含む容器を氷浴に浸します。
- 超音波ホモジナイザーで96%の強度でそれぞれ4分間の2サイクルでマイクロ粒子を超音波でホモジナイズする。
- 最初のサイクルの後、容器を1分間冷却します。
- 微粒子を凍結乾燥機で-64°Cの温度で凍結乾燥し、さらに使用するためにエキシケーターに保管します。
3. 天然フラボノイド内包リグニンマイクロ/サブミクロン粒子の合成
- 微粒子について手順1.1〜1.5を繰り返します。
- 0.08gのモリンを秤量し、1mLのEtOHに溶解し、このエタノール溶液を混合物に加える。
- マグネチックスターラーで500rpmで20分間混合液を撹拌します。
- 20 mLの2 N HNO3 をシリンジで約150 μL/sの流速で滴下します。
- 混合物を60分間攪拌し続けます。
- 手順1.8〜1.13を繰り返します。
- サブミクロン粒子について手順2.1を繰り返します。
- ケルセチン0.04gを重量で、1mLのEtOHに溶解し、このエタノール溶液をアルカリリグニン水溶液に加える。
- マグネチックスターラーで500rpmで10分間混合物を攪拌します。
- 手順2.4〜2.13を繰り返します。
4. リグニン微小・超微粒子の内包効率の決定
- 両方のタイプのフラボノイドカプセル化リグニン粒子の合成手順中に添加された生理活性物質の含有量を計算します。
- 96%EtOHで希釈した後、ステップ1.9および2.8で得られた上清中のフラボノイドの吸収を分光光度法で測定します。
- フラボノイドの検量線を用いて、非捕捉モラン/ケルセチンの濃度を計算します。
- 式(1)を使用して、天然フラボノイドに対するリグニン微粒子のカプセル化効率(EE、%)を計算します。
(1)
ここで、wo は添加された生理活性物質の総量(mg)であり、wf は遊離非捕捉フラボノイドの量(mg)である。 - 式(2)を使用して、薬物負荷容量(DLC、%)-担体系の単位重量あたりの粒子中の薬物の量を表す重要なパラメーター-を計算します。
(2)
ここで、wp は凍結乾燥後に得られるリグニンマイクロ/サブミクロン粒子の総量(収率)(mg)です。
(1)
(2)5. リグニンマイクロおよびサブミクロン粒子の特性評価
- 粒子数、サイズ、サイズ分布の決定
- ビーズカウントのオプションを備えた自動セルカウンターを使用して、サンプルの粒子サイズと粒子サイズ分布を評価します。マイクロピペットで、操作に必要な計数スライドのウェル内の超純水中にリグニン/フラボノイドマイクロ/サブミクロン粒子懸濁液1μLを加えます。
- 懸濁液1mL中の粒子数、およびそれらの数とサイズごとの分布が自動セルカウンターのディスプレイに表示されるのを待ちます。
注意: この装置では、USBフラッシュにデータを保存できます。自動セルカウンター専用ソフトウェアにより、保存されたデジタルファイルや写真ファイルをさらに処理することができます。
- 電位差滴定によるリグニン粒子の表面酸性/塩基基の含有量の測定
- 重量:0.04 gの無負荷/フラボノイドカプセル化リグニン粒子。
- それらを三角フラスコに移し、0.1 M HClを10 mL加え、フラスコを250 rpmのマグネチックスターラーに置きます。
- 50 mLビュレットに滴定剤NaOHの0.1 M標準溶液を充填します。
- 滴定を開始する前に、ベンチpHメーターで三角フラスコ内の溶液の初期pHを測定します。
- 滴定を開始し、滴定液を0.5 mL添加するごとに分析溶液のpHを測定します。
- 実験データは、適用された滴定液の量と対応するpHの値を含む表に保存されます。
- 滴定液の量を増やして、pHがほぼ一定になったら滴定を中止します。
- 実験データをゼロ、1次、2次導関数の微分滴定曲線の形式でプロットします。
- 使用する滴定液の等価点と対応する等価量を決定します。
- 式(3)と(4)を使用して、無負荷およびフラボノイドを担持したリグニン粒子の表面上の酸性AaおよびAb塩基の含有量を計算します。
, MGEQ/G (3)
MGEQ/G (4)
ここで、Veqi は等価体積(mL)です。NT 滴定液の正規性 (mgeqv/mL);VT 測定手順に使用した滴定液の容量(mL);m 分析したサンプルの重量(g)。
- 固体添加法によるリグニン系粒子のゼロチャージのpH点(pHPZC)の決定。
- NaClの0.1M水溶液60mLを調製します。
- 5つの栓付き円錐フラスコのそれぞれに0.1 M NaCl溶液9 mLを加え、0.1 M HClまたは0.1 M NaOHのいずれかを添加して、pHをpHi = 2、4、7、10、および12(ここで、i = 1〜5は対応する溶液の数を示す)にそれぞれ調整します。同じ強度のNaCl溶液を添加して、各フラスコ内の溶液の総量を10mLに正確に調整します。
- 各フラスコに40mgの乾燥リグニン粒子(無負荷、フラボノイドを充填したマイクロ/サブミクロン)を加え、フラスコにしっかりと蓋をします。
- フラスコをオービタルシェーカーに直立させて固定し、24時間振とうし続けます。
- 30分間平衡化し、その後、各フラスコの上清の最終pH(pHf)を測定します。
- 対応する初期pH値(pHi)に対してpHf値をプロットします。
- 電荷がゼロの点(pHPZC)は、曲線ΔpH対pHi が座標(pHi; pHi)と直線と交差するpH値として定義されます。
- リグニン粒子の総フェノール含有量(TPC)の測定
注:マイクロ/サブミクロンリグニン粒子の総フェノール含有量(TPC)は、修正されたFolin-Ciocalteu比色法によって決定されます。- 濃度500 μg/mLの粒子水懸濁液200 μLを、600 μLの超純水および200 μLのFolin-Ciocalteu試薬(1:1、v/v)と混合します。
- 5分後、1.0 mLの8% Na2CO3 と1.0 mLのMilli-Q水を加え、断続的に攪拌しながら水浴中で40°Cの暗所で30分間インキュベートします。
- 懸濁液を5,300 × g で2分間遠心分離します。
- パーティクルを含まないブランクを準備します。
- 10mmの石英キュベットに3.5mLの上清を移し、ブランクに対して760nmの可視領域でUV/Vis分光光度計で吸光度を測定します。
- 手順5.3.1〜5.3.5に従って、標準没食子酸の検量線を調製します。リグニン粒子懸濁液の200μLの代わりにのみ、初期濃度10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、および200μg / mLの没食子酸のエタノール溶液を使用してください。
- 微粒子の実験データを没食子酸当量mgとして、乾燥サンプルのグラム当たりミリグラム(mg GAE / g)で表します。
- 式 (5) を使用して TPC を計算します。
mgGAE/g(5)
ここで、CGA は、酸のキャリブレーションプロットから得られた標準没食子酸の濃度に相当するサンプルの濃度です(μg GA / mL)。Cs はサンプルの濃度で、乾燥サンプルの質量を溶媒の容量(μg/mL)で割った値に等しくなります。
, MGEQ/G (3)
MGEQ/G (4)
mgGAE/g(5)6. リグニン粒子のin vitro放出能の測定
- 0.1 M HCl を含む標準 PBS 溶液の pH を pH = 1.2 に調整して、250 mL のシミュレートされた酵素を含まない胃培地を調製します。
- 標準PBS溶液のpHを0.1 M NaOH/0.1 M HClでそれぞれpH = 6.8および7.4に調整することにより、2つの模擬腸液溶液をそれぞれ250 mL調製します。
- 機械式攪拌機が付属するガラスバッチリアクター内のシミュレートされた酵素を含まない胃媒体50mLに25mgのフラボノイドカプセル化マイクロ/サブミクロン粒子を加え、T = 37 ± 0.2 °Cの一定温度の温泉水浴に入れます。
- 攪拌機を液量の2/3の深さに浸して、固相と液相が完全に混合されるようにし、停滞ゾーンなしで最大の物質移動を確保します。
- 10分ごとに90分まで リアクターから1mLのサンプルを取り出し、すぐに1mLの新鮮な模擬流体溶液をリアクターにピペットで入れて、総量の変化を防ぎ、シンクの状態を確保します。
- pH = 6.8と7.4の両方のシミュレートされた腸液溶液で、それぞれ200分間、ステップ6.3〜6.6を含む同じ手順を繰り返します。
- 3つのシミュレートされた媒体で無負荷のリグニン粒子を使用して同様の実験を行い、サンプルを分光光度計をゼロにするためのブランクとして使用します。
- ステップ6.7のブランクサンプルに対してサンプルをろ過し、96%EtOHで希釈した後、サンプルの吸収を分光光度法で決定し、pH = 1.2、6.8、および7.4でそれぞれ得られたモリンの対応する検量線を使用して、対応するフラボノイド濃度を計算します。
- 式(6)を使用してバイオフラボノイドの累積放出(CR)をμg/mLで計算し、累積放出率(CRP)を式(7)で計算します。
(6)
ここで、Ci および Ci+1 は、i番目 と (i+1) 番目の サンプル中のモリン/ケルセチンの濃度 (μg/mL) です。Vs バッチリアクターから採取したサンプル量(mL);V シミュレートされた培地の総容量(mL)。
(7)
ここで、Cmax は担体中の生物学的に活性な化合物の最大濃度(μg/mL)です。
(6)
(7)7. 統計解析
- 実験データを、3つの独立した測定値の平均±標準偏差(SD)として表します。
- 事後検定として分散分析検定を実行することにより、実験結果の統計的有意性を決定します。pの値は、0.05<統計的に有意であると考えてください。
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Representative Results
抗溶媒沈殿技術を実行して、アルカリリグニンマイクロ/サブミクロン粒子を生成しました。希釈無機酸 - 硝酸/有機酸 - クエン酸の水溶液を、環境に優しい界面活性剤/エタノールで濃縮したアルカリリグニン水溶液に分散させ、その結果、生体高分子溶質が徐々に沈殿し、超音波処理後、コンパクトなマイクロ/サブミクロン粒子の懸濁液が最終的に生成された(図1)。
図1:リグニン粒子の均質化(A)合成されたリグニンサブミクロン粒子の超音波均質化。(B)均質化されたモリン担持および非負荷のリグニン微粒子。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
無負荷およびモリンカプセル化されたリグニンマイクロキャリアのサイズ、数、およびサイズ分布を決定しました(図2)。実験データでは、バイオフラボノイドをロードしたマイクロキャリア(1×107 particles/mL(2,037 particles/μL)の濃度が7.4 × 6 6 particles/mL(1,474 particles/μL)、平均サイズが5.7 μm(図2A)の無負荷マイクロキャリアよりも高濃度(1 107 particles/μl)と平均サイズ(6.1 μm)が高いことが証明されました。サイズ範囲3〜6μm内の両方のタイプの粒子のサイズ分布の割合は、無負荷で75.2%、モリンカプセル化マイクロキャリアで69.3%、7〜10μmの範囲内でそれぞれ20.2%と25.2%でした。抗溶媒である硝酸の量、濃度、および流量は、粒子のサイズに不可欠です。酸の濃度が高く、量が多いほど粒子が大きくなり、流速が高いと懸濁液の凝集が引き起こされます。
図2:粒度分布(A)パーティクルカウンターの懸濁液ソフトウェア1μL中の無負荷リグニン微粒子の実際の粒度分布。(B)粒子カウンターの懸濁ソフトウェア1μL中のモリンカプセル化アルカリリグニン微粒子の実際のサイズ分布。(C)無負荷リグニン微粒子の分布の粒子対顕微鏡写真;(d)モリン内包アルカリリグニン微粒子の分布の粒子対顕微鏡写真。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3は、エタノールモリン溶液、アルカリリグニン水溶液、および初期濃度の異なるモリンとリグニンを含む混合物のUV/Vis吸収スペクトルを示しています。明らかに、純粋なリグニンとバイオフラボノイドの吸収ピークは一致せず、フラボノイドをポリマーマイクロキャリアに封入した後、およびin vitro放出実験中に、液相中のモリン濃度を決定するための適用された分光光度法中に、ヘテロポリマーは破壊的な影響を及ぼしません。アルカリリグニンの存在による培地のpHの上昇の結果として、二成分混合物中のモリンの最大吸収は、λmax=359nmからλmax=395nmへとより高い波長にシフトした。可視領域における吸収極大の後者の偏差は、培地の様々なpH値におけるモリンの検量線の設計の必要性を誘発した(図4A)。非常に強い線形相関を特徴とする3つの標準曲線は、モリン濃度範囲Co = 2.5〜100μg / mL内の回帰係数(R2 > 0.99)の高い値によって証明されました。同様に、図4Bに示す3つのシミュレートされた生理学的区画におけるケルセチンの3つの標準曲線は、同じ濃度範囲内で高い直線性を示した。
図3:モリンのエタノール溶液、アルカリリグニン水溶液、および初期濃度の異なるモリンとリグニンを含む混合物のUV / Visスペクトルの比較。 純粋なリグニンとモリンのスペクトルは一致せず、ヘテロポリマーは破壊的な影響を与えません。モリンにリグニンを添加すると、モリンの最大吸収がλmax =359nmからλmax =395nmへと、より高い波長にシフトします。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:エタノールフラボノイド溶液の検量線(A)モリンおよび(B)ケルセチン、pH = 1.2(青)(模擬胃液に対応)、pH = 6.8(赤)(模擬小腸液に対応)、pH = 7.4(緑)(模擬結腸液に対応)の濃度範囲Co = 2.5-100μg/mL内。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
無負荷および負荷のアルカリリグニン粒子の表面における酸性および塩基性の活性部位/官能基の相対濃度は、電位差滴定によって決定された。計算は、2次微分差滴定曲線によって決定された等価滴定液量に基づいて行われました(図5)。決定されたpKaの値、酸性(強、弱、全)官能基の濃度、およびマイクロミクロン粒子とサブミクロン粒子のpHとpHpzc を 表1に示します。
図5:無負荷および負荷リグニンマイクロ/サブミクロン粒子の2次微分電位差滴定曲線。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | リグニン微粒子 | モリンカプセル化リグニン微粒子 | リグニンサブミクロン粒子 | ケルセチン内包リグニンサブミクロン粒子 |
| V式、mL | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa(強い)、mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa(弱い)、mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (合計)、mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH(水性懸濁液) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
表1:滴定液の等価体積(Veq)、酸解離定数の負塩基-10対数(pKa)、酸性(強、弱、全)官能基の濃度(Aa、 mgeq / g)、pHおよび無負荷および装填リグニンマイクロおよびサブミクロン粒子のゼロ電荷点(pHpzc)。 マイクロミクロンおよびサブミクロン、無負荷およびフラボノイドを含むリグニン粒子は、pHがpH pzc>ため、負に帯電しています。
修正Folin-Ciocalteu比色法によって測定され、没食子酸当量として計算された総フェノール含有量(TPC)は、78.2 mg GAE / gであり、同じ濃度のモリンカプセル化マイクロキャリアのTPCの値は2.3倍高かった(183.43 mg GAE / g)。後者は、ヘテロ生体高分子粒子がフラボノイド分子の取り込みにより追加のフェノール基で濃縮されることを示しています。フラボノイドカプセル化効率は、モリンで98.1%、ケルセチンで97.6%でした。薬物封入能力は、モリンを含有する微粒子で28.2%、ケルセチンを封入したサブミクロン粒子で39.0%であった。
モリンおよびケルセチンのin vitro累積放出は、シミュレートされた胃腸酵素を含まない培地(それぞれpH = 1.2、6.8、および7.4の胃液、小腸液、および結腸液)で調査されました(図6)。pH = 6.8で30〜40分後に約24%の最高の放出効率を達成しました。実験結果によると、模擬小腸培地中の遊離フラボノイドの量は、模擬結腸環境で放出されたフラボノイドの量の2倍、胃で決定された遊離効率の3倍でした。pH = 7.4でSIFで確立されたケルセチン放出の最高範囲は34%であり、SGF(pH = 1.2)およびSIF(pH = 6.8)のフラボノイドの累積放出である23.5%および18%をそれぞれ上回りました。
図6:模擬生理培地中のリグニンマイクロおよびサブミクロン粒子からのモリンおよびケルセチンの累積 in vitro 放出効率の比較分析。 モリン放出の最も高い程度は、シミュレートされた小腸培地で達成されました。ケルセチンの最高の放出効率は、シミュレートされた結腸液で記録されました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生体高分子に基づく薬物担体製剤の設計のための現代の合成方法論の主な重要な問題の中には、有害な有機試薬 - テトラヒドロフラン、アセトン、メタノール、さらには高濃度のDMSOなどの揮発性および可燃性溶媒 - の適用であり、毒性作用の発現の可能性により、生物医学、製薬産業、および食品技術への適用が制限される20。21、22、23、24。もう一つの重要な点は、合成手順中の複雑な化学反応(エステル化、重合など)または高価な装置の関与です。現在の原稿で提示されている両方の技術は、代替溶媒(水)と界面活性剤(Tween 80)や架橋剤(エタノール、クエン酸)などの非毒性化合物を含意することにより、後者の制限を克服し、「グリーン」合成法として分類します。さらに、これらの方法論は、生理活性物質の生分解性、生物活性、および生体適合性の担体テンプレートとして機能する、リグニン粒子を設計するための安価で環境に優しく持続可能な手順の開発に対する重要な必要性と衝動を満たすソリューションを提供します25。
所望のサイズのリグニン粒子を得るために、リグニン粒子のサイズに影響を与える2つの変数であるため、リグニン濃度が高く(50 g / L)で抗溶媒剤として硝酸が1つ、もう1つはリグニン濃度が低い(5 g / L)リグニン粒子と架橋剤の2つの変数であるため、抗溶媒剤としてエタノールとクエン酸が同時に役割を果たす2つの製造条件が選択されました。両方の手順の流量は、より小さな粒子を提供し、それらの凝集を防ぐために低く保たれました。合成プロトコルのための無機酸および有機酸の選択に関して考慮されなければならないいくつかの重要なポイントがある。
硝酸を選んだのは、強無機酸であり、アルカリリグニンの析出量が多く、その添加粒子の速度を制御することで所望のサイズ範囲内で得られるからである。さらに、HNO3 の添加は、以下に関連するリグニン構造の可能性のある化学変化により、ヘテロポリマー粒子の修飾を提供する可能性があると予想されます:-NO2 基を持つベンゼン環中のH原子のニトロ化置換反応のプロセス。脂肪族-OH基のエステル化およびエステル官能基の形成;および/またはフェノール-OHおよび-OCH3 基の酸化により、キノン構造が形成されます。合成粒子のサイズに対する沈殿剤とリグニン濃度の役割については、一方では、強硝酸(pKa = -1.4)の添加と組み合わせた初期リグニン濃度が高く、アルカリヘテロポリマーの無機酸への溶解度が限られているため、マイクロメートル範囲内の粒子が生成されました。一方、低濃度のアルカリリグニンの水溶液にエタノールを添加すると、アルカリリグニンのアルコールへの部分溶解性により、微細な懸濁液が形成されます。さらに、その後のクエン酸の添加は、有機酸が硝酸よりも弱く(pKa1 = 3.13)、その結果、より低い沈殿延長を提供するため、ナノメートル範囲内の粒子の生成につながった。
ナノサイズ医薬品の基本的な特性としては、薬物循環、特定の部位の剤形からの薬物放出、生体膜からの吸収などがあります。これらの特性は、ナノ粒子担体の物理的および化学的特性、およびカプセル化された薬物分子の影響を大きく受けます。
生体高分子担体の物理化学的特性:界面活性酸性基および塩基基の濃度、ゼロ電荷点(pHPZC)、サイズ、粒子サイズ分布、および生理活性物質の取り込み前後の粒子のスペクトル特性は、官能基、反応性を評価する際に考慮しなければならない重要なパラメータです。 粒子の安定性と均質性10.
粒子サイズ、粒子サイズ分布、電荷、および形態は、これらの評価に影響を与える主要な要因の1つです。粒子サイズは、それらの安定性、反応性、および薬物放出挙動に影響を与えます26。粒子が小さいほど、物質移動面積が大きくなり、薬物放出速度が高くなります。対照的に、大きな粒子の物質移動表面積が小さいため、これらの粒子内の薬物拡散速度が低下します。
固体表面上に存在する酸性および塩基性サイトおよび官能基を決定するための基本的な技術としての滴定法の適用は絶えず拡大しています。電位差滴定の主な利点には、時間と労力の節約、高精度、および参照標準と高価な装置の排除が含まれます。この方法は、ロードおよびアンロードされたバイオポリマー担体27の表面に存在する活性部位の性質および数を定性的および半定量的に決定することにより、バイオポリマー粒子の特性評価を可能にするため、本研究に適用された。
生物学的および医療用のマイクロ/ナノキャリアの表面電荷は、細胞の取り込みに重要な役割を果たします28。pHPZC は、ゼロ表面電荷密度、つまりプロトン平衡によって発生する負電荷と正電荷の等量に対応します。これらの値の決定は、吸着29の特異性に関する情報を提供する。しかし、パラメータ等電点は懸濁液中の粒子の外面電荷のみを表し、電荷がゼロの点は粒子の総正味表面電荷(外部および内部)に応じて変化するため、pHpzc プロトコルは、生体高分子薬物担体の特性評価のための簡単で効果的な方法として本研究で初めて適用されました。pHpzcの概念によれば、pHpzcを超えるpHでは、生体高分子粒子の表面は主に負に帯電し、懸濁液のpHがpH pzcを下回ると正味の正電荷が観察されます。 表1に示す実験データから、マイクロミクロンおよびサブミクロン、無負荷およびフラボノイドを担持したリグニン粒子は、pHがpH pzc>ため、負に帯電していると結論付けることができます。
フラボノイドの負荷効率は、カプセル化効率と薬物負荷容量の影響を受けます。カプセル化効率(E、%)は、製剤中の全量に対する粒子に組み込まれた薬物の量の比率として定義されます。封止効率は、薬物特性、溶媒、および担体30によって影響を受ける。
しかし、生理活性物質の効率的な送達は、その分子がキャリアマトリックスから放出される方法と程度に依存します。したがって、薬物放出メカニズムおよび放出速度を考慮することが非常に重要である31,32,33。バイオフラボノイドの生体高分子マイクロ/ナノ担体からのin vitro放出機構を解明することにより、実際の生理学的培地でのフラボノイドと担体の挙動をシミュレートおよび予測し、バイオアベイラビリティを改善した医薬品製剤の設計を最適化することができます。この研究で得られた実験的なin vitroの結果は、胃環境中のリグニンサブミクロンおよび微粒子からのモリン/ケルセチン放出の程度が低いため、革新的な生体高分子粒子が経口投与に適していることを証明しているため、臨床診療に役立ちます生理活性物質の直接経口投与と比較して胃刺激のリスクが低いため。革新的な生体高分子微粒子は、生理活性物質の直接経口投与と比較して胃刺激のリスクが低いため、経口投与に適しています。さらに、サブミクロン粒子は、そのサイズが小さく、放出能が大きいため、注射用製剤として適用できます。さらに、新しいリグニンマイクロおよびサブミクロン担体は、腸管内で飽和溶液を形成する傾向に起因する、高用量の特定のバイオフラボノイドの経口投与に関連する困難に関連して他の科学者によって報告された制限を克服する機会を提供します。
合成の容易さ、得られた粒子の生体適合性、ならびに現在のプロトコルのカスタマイズの可能性は、提示された方法論の主な利点を表す。粒子のサイズは、意図した用途に最適であり、治療薬や標的部分の付着に十分な表面積を提供し、目標投与量を達成するためにより多くの粒子を投与する必要がありません。革新的な粒子を合成するための基本的なヘテロポリマーマトリックスとしてリグニンを使用することで、生体適合性が向上し、さまざまな活性官能基が提供され、さまざまな用途向けに粒子をカスタマイズする機会が得られます。
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Disclosures
著者には、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、契約番号 KΠ-06 H59/3 に基づくブルガリア科学基金と、トラキア大学の科学プロジェクト No. 07/2023 FVM の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
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