Summary
نحن نصف منهجيات جديدة وبسيطة لتوليف وتوصيف جزيئات اللجنين الدقيقة ودون الميكرونية المتوافقة حيويا. توفر هذه التركيبات نهجا سهلا لاستخدام البوليمر غير المتجانس ، بالإضافة إلى بديل للتصميم العقلاني للمصفوفات الحاملة متعددة الوظائف مع إمكانية التطبيق في الطب الحيوي والتكنولوجيا الصيدلانية وصناعة الأغذية.
Abstract
إن قابلية تطبيق تقنية البوليمر الحيوي الدقيقة / النانوية في تكنولوجيا الإنسان والطب البيطري والأدوية والغذاء تنمو بسرعة بسبب الإمكانات الكبيرة للجسيمات القائمة على البوليمر الحيوي كأنظمة حاملة فعالة. يسمح استخدام اللجنين كمصفوفة حيوية أساسية للبوليمر غير المتجانس لتصميم تركيبات مبتكرة دقيقة / دون ميكرون بتحقيق توافق حيوي متزايد ويوفر مجموعات وظيفية نشطة مختلفة توفر فرصا لتخصيص الخصائص الفيزيائية والكيميائية والأنشطة الحيوية للتركيبات لتطبيقات متنوعة. وكان الهدف من هذه الدراسة هو وضع منهجية بسيطة وصديقة للبيئة لتخليق جسيمات اللجنين ذات الحجم الجزئي ودون الميكروني؛ لتقييم خصائصها الفيزيائية والكيميائية والطيفية والهيكلية ؛ وفحص قدرتها على تغليف الجزيئات النشطة بيولوجيا وإمكانية إطلاق البيوفلافونويدس في المختبر في وسائط الجهاز الهضمي المحاكاة. تطبق المنهجيات المقدمة مذيبات رخيصة وخضراء. عمليات سهلة ومباشرة وسريعة وحساسة تتطلب القليل من المعدات والمواد غير السامة وطرق بسيطة لتوصيفها ، وتحديد قدرة التغليف تجاه المركبات النشطة بيولوجيا ضعيفة الذوبان في الماء مورين وكيرسيتين ، وإمكانية الإطلاق في المختبر لمصفوفات اللجنين.
Introduction
في الوقت الحاضر ، زاد الميل نحو البوليمرات الحيوية مثل السليلوز والشيتوزان والكولاجين والدكستران والجيلاتين واللجنين كسلائف لتصميم ناقلات ميكرو / دون ميكرون ذات حجم قابل للتخصيص ، وخصائص فيزيائية كيميائية ، ووظائف حيوية في الصناعات الطبية الحيوية والصيدلانية وتكنولوجيا الأغذية بسبب قابليتها للتطبيق في هندسة الأنسجة ، والطباعة الحيوية 3D ، في المختبر منصات نمذجة الأمراض ، صناعة التعبئة والتغليف ، تحضير المستحلب ، وتسليم المغذيات من بين أمور أخرى1،2،3.
تسلط الدراسات الجديدة الضوء على جوانب الهلاميات المائية القائمة على اللجنين وكذلك التركيبات الدقيقة والنانوية4 كمركبات مفيدة تستخدم لمواد تغليف المواد الغذائية5 ، تخزين الطاقة6 ، مستحضرات التجميل7 ، مثبتات حرارية / ضوئية ، مواد معززة ، ومصفوفات حاملة للأدوية8 لتوصيل الجزيئات الكارهة للماء ، وتحسين حواجز الأشعة فوق البنفسجية9، كعوامل تقوية في المركبات النانوية ، وكبديل للجسيمات النانوية غير العضوية بسبب بعض قضايا السلامة الأخيرة10،11،12. السبب وراء هذا الاتجاه هو التوافق الحيوي ، والتحلل البيولوجي ، وعدم سمية البوليمر الحيوي الطبيعي غير المغاير ، بالإضافة إلى أنشطته الحيوية المثبتة لإمكانات مضادات الأكسدة اللجنين وأنشطة الكسح الجذرية والمضادة للتكاثر ومضادات الميكروبات13،14،15،16،17.
تشير الأدبيات العلمية إلى طرق مختلفة للتخليق (التجميع الذاتي ، والترسيب المضاد للمذيبات ، والترسيب الحمضي ، وتحويل المذيبات)18 وتوصيف التركيبات الدقيقة / النانوية القائمة على اللجنين ، بما في ذلك تطبيق المذيبات باهظة الثمن أو الضارة مثل رباعي هيدروفوران (THF) ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، N ، N-dimethylformamide (DMF) ، والأسيتون ، والعمليات المعقدة وغير المباشرة والمملة التي تستخدم الكثير من المعدات والمواد السامة12، 19,20.
للتغلب على العيوب الأخيرة ، تقدم البروتوكولات التالية منهجيات جديدة لتخليق الجسيمات الدقيقة / دون الميكرونية القائمة على اللجنين باستخدام مذيبات رخيصة وخضراء. عمليات سهلة ومباشرة وسريعة وحساسة تتطلب القليل من المعدات والمواد غير السامة وطرق بسيطة لتوصيفها وتحديد قدرة التغليف نحو المركبات النشطة بيولوجيا ضعيفة الذوبان في الماء وإمكانية الإطلاق في المختبر لمصفوفات اللجنين. تعد طرق الإنتاج المقدمة على نطاق المختبر مفيدة لتصنيع ناقلات اللجنين الوظيفية ذات الأحجام القابلة للضبط ، وقدرة التغليف العالية ، وسلوك الإطلاق المستدام في المختبر باستخدام إجراءات توصيف بسيطة ومواد كيميائية صديقة للبيئة يمكن أن تجد تطبيقا في مختلف مجالات العلوم الطبية الحيوية وتكنولوجيا الأغذية. تم تطبيق اثنين من مركبات الفلافونويد كجزيئات مستهدفة مغلفة في جزيئات اللجنين: مورين في الجسيمات الدقيقة ، وكيرسيتين في جزيئات تحت الميكرون. الفرق في هياكل كل من مركبات الفلافونويد هو فقط موضع المجموعة الثانية -OH في الحلقة العطرية B: المجموعة -OH في الموضع 2 'في مورين وعلى موضع 3' في كيرسيتين ، وبالتالي فإن كلا المركبين العضويين هما أيزومرات موضعية. تفترض الحقيقة الأخيرة سلوكا مشابها لكل من المركبات الطبيعية النشطة بيولوجيا في عمليات التغليف و / أو الإطلاق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تخليق الجسيمات الدقيقة اللجنين
- تحضير محلول مائي من اللجنين القلوي سعة 50 ملغم / مل عن طريق إذابة 2.5 جم من اللجنين القلوي في 50 مل من الماء عالي النقاء على محرك مغناطيسي.
- قم بإعداد محلول Tween 80 بنسبة 1٪ عن طريق إذابة 1 مل من Tween 80 في 100 مل من الماء عالي النقاء.
- قم بإعداد محلول 2 M من HNO3 عن طريق تخفيف 6.65 مل من 67٪ HNO3 (الكثافة = 1.413 جم / مل) بماء عالي النقاء إلى حجم نهائي قدره 50 مل.
- أضف ببطء 15 مل من محلول Tween 80 1٪ إلى 50 مل من محلول اللجنين القلوي 50 مجم / مل.
- حرك الخليط على محرك مغناطيسي عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق حتى يصبح الفاعل بالسطح مشتتا جيدا.
- أضف 20 مل من 2 M HNO3 بالتنقيط مع حقنة بمعدل تدفق حوالي 150 ميكرولتر / ثانية إلى الخليط.
- استمر في تحريك الخليط لمدة 30 دقيقة عندما يتحول المحلول البني الداكن إلى تعليق بني فاتح للجسيمات الدقيقة.
- انقل التعليق إلى أنابيب اختبار 1.5-2 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 15000 × جم في جهاز طرد مركزي فائق عند 10 درجات مئوية.
- اجمع المادة الطافية لمزيد من التحليلات واشطف الجسيمات الدقيقة بماء فائق النقاء.
- كرر إجراءات الشطف / الطرد المركزي الفائق 3x.
- اغمس الحاوية مع الجسيمات الدقيقة في حمام جليدي قبل التجانس بالموجات فوق الصوتية.
- تجانس الجسيمات الدقيقة لمدة 4 دقائق بكثافة 93٪ على الخالط بالموجات فوق الصوتية.
- قم بتجفيف الجسيمات الدقيقة عند درجة حرارة -64 درجة مئوية في مجفف تجميد وتخزينها في جهاز إكسيكاتور لاستخدامها مرة أخرى.
2. تخليق جزيئات اللجنين تحت الميكرون
- تحضير محلول مائي من اللجنين القلوي 5 ملغم / مل عن طريق إذابة 125 ملغ من اللجنين القلوي في 25 مل من الماء عالي النقاء على محرك مغناطيسي.
- أضف ببطء 1 مل من 96٪ EtOH إلى محلول اللجنين القلوي.
- حرك الخليط على محرك مغناطيسي عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
- تحضير 50 مل من محلول 1٪ من حامض الستريك عن طريق إذابة 0.5 غرام من حامض الستريك في ماء عالي النقاء إلى حجم نهائي قدره 50 مل.
- أضف 7 مل من حمض الستريك 1٪ بالتنقيط مع حقنة بمعدل تدفق حوالي 4 مل / دقيقة إلى الخليط.
- استمر في تقليب الخليط لمدة 10 دقائق عندما يتحول المحلول البني الصافي إلى تعليق بني فاتح غائم لجزيئات دون الميكرون.
- نقل التعليق إلى أنابيب الاختبار وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 15000 × غرام في جهاز طرد مركزي فائق عند 10 درجات مئوية.
- اجمع المادة الطافية لمزيد من التحليلات واشطف الجسيمات الدقيقة بماء فائق النقاء.
- كرر إجراءات الشطف / الطرد المركزي الفائق 3x.
- اغمس الحاوية مع الجسيمات الدقيقة في حمام جليدي قبل التجانس بالموجات فوق الصوتية.
- تجانس الجسيمات الدقيقة بالموجات فوق الصوتية لمدة دورتين مدة كل منهما 4 دقائق بكثافة 96٪ في الخالط بالموجات فوق الصوتية.
- تبريد الحاويات لمدة 1 دقيقة بعد الدورة الأولى.
- قم بتجفيف الجسيمات الدقيقة عند درجة حرارة -64 درجة مئوية في مجفف تجميد وتخزينها في جهاز إكسيكاتور لاستخدامها مرة أخرى.
3. تخليق جزيئات اللجنين الطبيعية المغلفة بالفلافونويد الدقيقة / دون الميكرون
- كرر الخطوات 1.1-1.5 للجسيمات الدقيقة.
- تزن 0.08 غرام من مورين ، تذوب في 1 مل من EtOH ، وتضاف هذا المحلول الإيثانولي إلى الخليط.
- حرك الخليط على محرك مغناطيسي عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
- أضف 20 مل من 2 N HNO3 بالتنقيط مع حقنة بمعدل تدفق حوالي 150 ميكرولتر / ثانية إلى الخليط.
- استمر في تحريك الخليط لمدة 60 دقيقة.
- كرر الخطوات 1.8-1.13.
- كرر الخطوة 2.1 للجسيمات دون الميكرونية.
- وزن 0.04 غرام من كيرسيتين ، قم بحله في 1 مل EtOH وأضف هذا المحلول الإيثانولي إلى محلول اللجنين المائي القلوي.
- حرك الخليط على محرك مغناطيسي عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
- كرر الخطوات 2.4-2.13.
4. تحديد كفاءة تغليف جزيئات اللجنين الدقيقة / sumicro
- احسب محتوى المادة النشطة بيولوجيا المضافة أثناء إجراء تخليق كلا النوعين من جزيئات اللجنين المغلفة بالفلافونويد.
- تحديد قياس طيفي امتصاص الفلافونويد في المادة الطافية التي تم الحصول عليها خلال الخطوتين 1.9 و 2.8 بعد تخفيفه بنسبة 96٪ EtOH.
- احسب تركيز مورين / كيرسيتين غير المحاصر باستخدام منحنيات معايرة مركبات الفلافونويد.
- احسب كفاءة التغليف (EE ، ٪) لجسيمات اللجنين الدقيقة تجاه مركبات الفلافونويد الطبيعية باستخدام المعادلة (1):
(1)
حيث wo هي الكمية الإجمالية للمادة النشطة بيولوجيا المضافة (mg) و wf هي كمية الفلافونويد الحر غير المحبوس (mg). - احسب سعة تحميل الدواء (DLC ، ٪) - معلمة مهمة تمثل كمية الدواء في الجسيمات لكل وحدة وزن للنظام الحامل - باستخدام مكافئ (2):
(2)
حيث wp هي الكمية الإجمالية (العائد) لجزيئات اللجنين الدقيقة / دون الميكرونية التي تم الحصول عليها بعد التجفيد (ملغ).
(1)
(2)5. توصيف جزيئات اللجنين الدقيقة ودون الميكرونية
- تحديد عدد الجسيمات وحجمها وتوزيع الحجم
- قم بتقييم حجم الجسيمات وتوزيع حجم الجسيمات للعينات باستخدام عداد خلية أوتوماتيكي مع خيار عدد الخرزات. أضف مع ماصة دقيقة 1 ميكرولتر من تعليق جزيئات اللجنين / الفلافونويد الدقيقة / دون الميكرون في ماء عالي النقاء في بئر شريحة العد المطلوبة للعملية.
- انتظر حتى يظهر عدد الجسيمات في 1 مل من التعليق ، وكذلك عددها وتوزيعها حسب الحجم في شاشة عداد الخلية التلقائي.
ملاحظة: يسمح الجهاز بتخزين البيانات على فلاش USB. يسمح البرنامج الخاص لعداد الخلايا الأوتوماتيكي بمزيد من المعالجة للملفات الرقمية والصور المحفوظة.
- تحديد محتوى المجموعات السطحية الحمضية/القاعدية لجسيمات اللجنين عن طريق معايرة الجهد
- الوزن 0.04 جم من جزيئات اللجنين المغلفة بالفلافونويد / المفرغة.
- انقلها إلى دورق Erlenmeyer ، وأضف 10 مل من 0.1 M HCl ، وضع القارورة على محرك مغناطيسي عند 250 دورة في الدقيقة.
- املأ سحاحة سعة 50 مل بمحلول قياسي 0.1 M من محلول محلول المعايرة NaOH .
- قم بقياس الرقم الهيدروجيني الأولي للمحلول في دورق Erlenmeyer باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني على مقاعد البدلاء قبل بدء المعايرة.
- ابدأ المعايرة بالتحليل الحجمي وقم بقياس الأس الهيدروجيني للمحلول المحلل بعد كل 0.5 مل مضاف جزء من محلول المعايرة.
- قم بتخزين البيانات التجريبية في جدول يحتوي على حجم محلول المعايرة المطبق والقيمة المقابلة للأس الهيدروجيني.
- أوقف المعايرة عند الوصول إلى قيمة ثابتة تقريبا للأس الهيدروجيني عن طريق زيادة حجم محلول المعايرة.
- ارسم البيانات التجريبية في شكل منحنيات معايرة تفاضلية صفرية ومشتقة أولا وثانيا.
- أوجد النقاط المكافئة والأحجام المناظرة لمقايرات المعايرة المستخدمة.
- احسب محتويات المجموعتين الأساسيتين الحمضيتين Aa و Abعلى سطح جسيمات اللجنين غير المحملة والفلافونويد باستخدام المعادلتين (3) و (4):
، MGEQ / ز (3)
مجيك / ز (4)
حيث Veqi هو الحجم المكافئ (مل) ؛ NT الحالة الطبيعية لمحلول المعايرة (mgeqv / mL) ؛ VT حجم محلول المعايرة المستخدم في إجراء التحديد (مل) ؛ م وزن العينة التي تم تحليلها (جم).
- تحديد نقطة الأس الهيدروجيني للشحنة الصفرية (pHPZC) للجسيمات القائمة على اللجنين بطريقة الإضافة الصلبة.
- تحضير 60 مل من محلول مائي 0.1 M من كلوريد الصوديوم.
- أضف 9 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.1 M في كل من القوارير المخروطية الخمس المتقطعة واضبط الأس الهيدروجيني على الرقم الهيدروجينيi = 2 و 4 و 7 و 10 و 12 (حيث i = 1-5 تدل على رقم المحلول المقابل) ، على التوالي عن طريق إضافة 0.1 M HCl أو 0.1 M NaOH. اضبط الحجم الكلي للمحلول في كل قارورة على 10 مل بالضبط عن طريق إضافة محلول كلوريد الصوديوم بنفس القوة.
- أضف 40 مجم من جزيئات اللجنين الجافة (ميكرون / تحت ميكرون غير محملة بالفلافونويد) إلى كل قارورة وقم بتغطية القوارير بإحكام.
- ثبت القوارير في وضع مستقيم على شاكر مداري واحتفظ بها تهتز لمدة 24 ساعة.
- اسمح بالتوازن لمدة 30 دقيقة ثم قم بقياس الرقم الهيدروجيني النهائي (pHf) للطاف في كل قارورة.
- ارسم قيم الأس الهيدروجينيf مقابل قيم الأس الهيدروجيني الأولية المقابلة (pHi).
- يتم تعريف نقطة الشحنة الصفرية (pHPZC) على أنها قيمة الأس الهيدروجيني التي يتقاطع عندها المنحنى ΔpH مقابل pHi مع الخط المستقيم مع الإحداثيات (pHi ؛ pHi).
- تحديد المحتوى الفينولي الكلي (TPC) لجزيئات اللجنين
ملاحظة: يتم تحديد المحتوى الفينولي الكلي (TPC) لجسيمات اللجنين الدقيقة / دون الميكرونية عبر طريقة قياس الألوان Folin-Ciocalteu المعدلة.- امزج 200 ميكرولتر من معلق مائي للجسيمات بتركيز 500 ميكروغرام / مل مع 600 ميكرولتر من الماء عالي النقاء و 200 ميكرولتر من كاشف Folin-Ciocalteu (1: 1 ، v / v).
- بعد 5 دقائق ، أضف 1.0 مل من 8٪ Na2CO3 و 1.0 مل من ماء Milli-Q إلى الخليط واحتضانه في الظلام عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي مع تحريض متقطع.
- أجهزة الطرد المركزي التعليق في 5300 × غرام لمدة 2 دقيقة.
- تحضير فراغ لا يحتوي على جزيئات.
- نقل 3.5 مل من المادة الطافية في كوفيت كوارتز 10 مم وقياس الامتصاص على مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية في المنطقة المرئية عند 760 نانومتر مقابل الفراغ.
- تحضير منحنى معايرة لحمض الغال القياسي باتباع الخطوات 5.3.1-5.3.5 ؛ فقط بدلا من 200 ميكرولتر من معلق جسيمات اللجنين ، استخدم المحلول الإيثانولي لحمض الغال بتركيزات أولية 10 و 20 و 30 و 40 و 50 و 60 و 70 و 80 و 90 و 100 و 150 و 200 ميكروغرام / مل.
- التعبير عن البيانات التجريبية للجسيمات الدقيقة على أنها ملغ من مكافئات حمض الغال بالملليغرام لكل جرام من العينة الجافة (mg GAE / g).
- احسب TPC باستخدام المعادلة (5):
ملغ GAE / ز (5)
حيث CGA هو تركيز العينة المكافئ لتركيز حمض الغال القياسي الذي تم الحصول عليه من مخطط معايرة الحمض (μg GA / mL) ؛ Cs هو تركيز العينة ، والذي يساوي كتلة العينة الجافة مقسومة على حجم المذيب (ميكروغرام / مل).
، MGEQ / ز (3)
مجيك / ز (4)
ملغ GAE / ز (5)6. تحديد قدرة إطلاق جزيئات اللجنين في المختبر
- قم بإعداد 250 مل من وسط المعدة الخالي من الإنزيم عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول PBS القياسي مع 0.1 M HCl إلى pH = 1.2.
- تحضير 250 مل من كل من محلولي السوائل المعوية المحاكيين عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول PBS القياسي مع 0.1 M NaOH / 0.1 M HCl إلى الرقم الهيدروجيني = 6.8 و 7.4 ، على التوالي.
- أضف 25 مجم من الجسيمات الدقيقة / تحت الميكرون المغلفة بالفلافونويد إلى 50 مل من وسط المعدة المحاكي الخالي من الإنزيم في مفاعل دفعة زجاجية مزود بمحرك ميكانيكي وضعه في حمام مائي حراري عند درجة حرارة ثابتة T = 37 ± 0.2 درجةمئوية.
- اغمس المحرك على عمق 2/3 من حجم السائل لضمان الخلط الكامل للمرحلتين الصلبة والسائلة وضمان أقصى نقل للكتلة دون مناطق راكدة.
- أخرج 1 مل من العينة من المفاعل كل 10 دقائق حتى 90دقيقة وعلى الفور ماصة 1 مل من محلول سائل محاكاة جديد في المفاعل لمنع تغيير الحجم الكلي ولضمان ظروف الحوض.
- كرر نفس الإجراء بما في ذلك الخطوات 6.3-6.6 مع كل من محاليل السوائل المعوية المحاكية مع درجة الحموضة = 6.8 و 7.4 ، على التوالي ، لمدة 200 دقيقة.
- إجراء تجارب مماثلة مع جزيئات اللجنين غير المحملة في الوسائط المحاكاة الثلاثة واستخدام العينات كفراغات لتصفير مقياس الطيف الضوئي.
- تحديد امتصاص العينات طيفيا بعد ترشيح العينات وتخفيفها بنسبة 96٪ EtOH مقابل العينات الفارغة من الخطوة 6.7 وحساب تركيز الفلافونويد المقابل باستخدام منحنيات المعايرة المقابلة للمورين التي تم الحصول عليها عند الرقم الهيدروجيني = 1.2 و 6.8 و 7.4 على التوالي.
- احسب الإطلاق التراكمي (CR) للبيوفلافونويدس باستخدام المعادلة (6) بالميكروغرام / مل ونسبة الإطلاق التراكمي (CRP) بالمعادلة (7):
(6)
حيث Ci و Ci + 1 هي تركيزات مورين / كيرسيتين في العينات ith و (i + 1) th (ميكروغرام / مل) ؛ Vs حجم العينة المأخوذة من مفاعل الدفعات (مل) ؛ V الحجم الكلي للوسائط المحاكاة (مل).
(7)
حيث Cmax هو أقصى تركيز للمركب النشط بيولوجيا في الناقل (ميكروغرام / مل).
(6)
(7)7. التحليلات الإحصائية
- التعبير عن البيانات التجريبية كمتوسط ± الانحرافات المعيارية (SD) لثلاثة قياسات مستقلة.
- تحديد الدلالة الإحصائية للنتائج التجريبية عن طريق إجراء اختبار ANOVA كاختبار لاحق. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تنفيذ تقنية الترسيب المضادة للمذيبات لإنتاج جزيئات اللجنين القلوية الدقيقة / دون الميكرونية. تم تشتيت محلول مائي من حمض النيتريك غير العضوي المخفف / حمض الستريك العضوي في محلول مائي من اللجنين القلوي ، المخصب بخافض للتوتر السطحي / الإيثانول الصديق للبيئة ، مما أدى إلى الترسيب التدريجي لمذاب البوليمر الحيوي ، وبعد صوتنة ، تم أخيرا إنتاج تعليق لجزيئات micro- / submicron المدمجة (الشكل 1).
الشكل 1: تجانس جسيمات اللجنين. (أ) التجانس بالموجات فوق الصوتية لجسيمات اللجنين دون الميكرونية المركبة؛ (ب) جسيمات اللجنين الدقيقة المحملة والمفرغة المتجانسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تحديد حجم وعدد وتوزيع حجم ناقلات اللجنين الدقيقة غير المحملة والمغلفة بالمورين (الشكل 2). أثبتت البيانات التجريبية تركيزا أعلى ، 1 × 107 جسيمات / مل (2037 جسيما / ميكرولتر) ، ومتوسط حجم أعلى ، 6.1 ميكرومتر ، من الناقلات الدقيقة المحملة بالبيوفلافونويد (الشكل 2 ب) من تلك المفرغة بتركيز 7.4 × 106 جسيمات / مل (1474 جسيما / ميكرولتر) ومتوسط حجم 5.7 ميكرومتر (الشكل 2 أ). كانت النسبة المئوية لتوزيع الحجم لكلا النوعين من الجسيمات ضمن نطاق الحجم 3-6 ميكرومتر 75.2٪ للناقلات الدقيقة المغلفة بمورين و 20.2٪ و 25.2٪ على التوالي ، في نطاق 7-10 ميكرومتر. كمية وتركيز ومعدل تدفق حمض النيتريك المضاد للمذيبات ضرورية لحجم الجسيمات. يؤدي التركيز العالي والكمية الأكبر من الحمض إلى جزيئات أكبر ، بينما يؤدي معدل التدفق الأعلى إلى تجميع التعليق.
الشكل 2: توزيع حجم الجسيمات. (أ) التوزيع الفعلي لجسيمات اللجنين الدقيقة المفرغة في 1 ميكرولتر من برنامج التعليق لعداد الجسيمات؛ (ب) التوزيع الفعلي لحجم جسيمات اللجنين القلوية المغلفة بالمورين في 1 ميكرولتر من برنامج التعليق لعداد الجسيمات. (ج) صورة مجهرية مضادة للجسيمات لتوزيع جسيمات اللجنين الدقيقة المفرغة؛ د: صورة مجهرية مضادة للجسيمات لتوزيع جسيمات اللجنين القلوية المغلفة بالمورين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويعرض الشكل 3 أطياف امتصاص الأشعة المرئية/فوق البنفسجية لمحاليل مورين الإيثانول، والمحاليل المائية المصنوعة من اللجنين القلوي، والمخاليط المحتوية على مورين ولينين بتركيزات أولية مختلفة. من الواضح أن قمم امتصاص اللجنين النقي والبيوفلافونويد لا تتطابق ولا يمارس البوليمر غير المتجانس أي تأثير تخريبي أثناء طريقة القياس الطيفي المطبقة لتحديد تركيز مورين في الطور السائل بعد تغليف الفلافونويد في ناقلات البوليمر الدقيقة وأثناء تجارب الإطلاق في المختبر . تحول الحد الأقصى لامتصاص المورين في الخليط المكون من عنصرين إلى طول موجي أعلى ، من λmax = 359 nm إلى λmax = 395 nm ، نتيجة لزيادة درجة الحموضة في الوسط بسبب وجود اللجنين القلوي. أثار الانحراف الأخير لأقصى امتصاص في المنطقة المرئية ضرورة تصميم منحنيات معايرة مورين عند قيم الأس الهيدروجيني المختلفة للوسط (الشكل 4 أ). تم إثبات المنحنيات القياسية الثلاثة التي تتميز بارتباطات خطية قوية جدا من خلال القيم العالية لمعاملات الانحدار (R2 > 0.99) ضمن نطاق تركيز مورين Co = 2.5-100 ميكروغرام / مل. وبالمثل ، أظهرت المنحنيات القياسية الثلاثة للكيرسيتين في المقصورات الفسيولوجية الثلاثة المحاكية ، المعروضة في الشكل 4 ب ، خطية عالية ضمن نفس نطاق التركيز.
الشكل 3: مقارنة بين أطياف الأشعة المرئية/فوق البنفسجية للمحاليل الإيثانولية للمورين، والمحاليل المائية للجنين القلوي، والمخاليط المحتوية على المورين واللجنين بتركيزات أولية مختلفة. لا تتطابق أطياف اللجنين النقي والمورين ولا يمارس البوليمر غير المتجانس أي تأثير تخريبي. تؤدي إضافة اللجنين إلى مورين إلى تحويل الحد الأقصى لامتصاص مورين إلى طول موجي أعلى ، من λmax = 359 nm إلى λmax = 395 nm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: منحنيات معايرة محاليل الفلافونويد الإيثانولية. (أ) مورين و (ب) كيرسيتين ضمن نطاق التركيز Co = 2.5-100 ميكروغرام / مل عند الرقم الهيدروجيني = 1.2 (باللون الأزرق) (المقابل لسائل المعدة المحاكي) ، والرقم الهيدروجيني = 6.8 (باللون الأحمر) (المقابل لسائل الأمعاء الدقيقة المحاكي) ، والرقم الهيدروجيني = 7.4 (باللون الأخضر) (المقابل لسائل القولون المحاكي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تحديد التركيز النسبي للمواقع النشطة الحمضية والأساسية / المجموعات الوظيفية على سطح جزيئات اللجنين القلوية المفرغة والمحملة بواسطة معايرة الجهد. استندت الحسابات إلى أحجام محلول المعايرة المكافئة التي حددتها منحنيات المعايرة التفاضلية المشتقة الثانية (الشكل 5). يتم عرض قيم pKa المحددة ، وتركيزات المجموعات الوظيفية الحمضية (القوية ، الضعيفة ، الكلية) ، ودرجة الحموضة ودرجة الحموضةpzc للجسيمات الدقيقة ودون الميكرونية في الجدول 1.
الشكل 5: منحنيات معايرة الجهد التفاضلي المشتق الثاني لجسيمات اللجنين الدقيقة/دون الميكرونية المفرغة والمحملة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| البارامتر | جسيمات اللجنين الدقيقة | جسيمات اللجنين الدقيقة المغلفة بالمورين | جزيئات اللجنين تحت الميكرون | جزيئات اللجنين تحت الميكرون المغلفة بالكيرسيتين |
| Vمكافئ ، مل | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| بي كا | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| أأ (قوي) ، mgeq / ز | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| أأ (ضعيف) ، mgeq / ز | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| أأ (المجموع) ، mgeq / ز | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| درجة الحموضة (تعليق مائي) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| درجة الحموضةpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
الجدول 1: قيم الحجم المكافئ لمحلول المعايرة (Veq)، واللوغاريتم السالب الأساسي -10 لثابت تفكك الحمض (pKa)، وتركيزات المجموعات الوظيفية الحمضية (القوية والضعيفة والكلية) (Aa، mgeq/g)، والرقم الهيدروجيني ونقطة الشحنة الصفرية (pH pzc) لجسيمات اللجنين الدقيقة ودون الميكرونية المفرغة والمحملة. جزيئات اللجنين الدقيقة والفرعية ، المفرغة والمحملة بالفلافونويد مشحونة سالبة لأن درجة الحموضة >pzc.
كان إجمالي المحتوى الفينولي (TPC) ، الذي تم تحديده بواسطة طريقة القياس اللوني المعدلة Folin-Ciocalteu والمحسوبة كمكافئات لحمض الغال ، 78.2 مجم GAE / g من جزيئات اللجنين غير المحملة ، في حين كانت قيمة TPC للناقلات الدقيقة المغلفة بالمورين بنفس التركيز أعلى 2.3 مرة (183.43 مجم GAE / g). يشير الأخير إلى أن جزيئات البوليمر الحيوي غير المتجانسة يتم تخصيبها بمجموعات فينولية إضافية بسبب دمج جزيئات الفلافونويد. كانت كفاءة تغليف الفلافونويد: 98.1٪ للمورين و 97.6٪ للكيرسيتين. كانت قدرات تغليف الدواء 28.2٪ للجسيمات الدقيقة المحملة بالمورين و 39.0٪ للجسيمات تحت الميكرون المغلفة بالكيرسيتين.
تم التحقيق في الإطلاق التراكمي في المختبر للمورين والكيرسيتين في وسائط محاكاة خالية من إنزيمات الجهاز الهضمي: سوائل المعدة والأمعاء الصغيرة والقولون عند الرقم الهيدروجيني = 1.2 و 6.8 و 7.4 على التوالي (الشكل 6). تم تحقيق أعلى كفاءة إطلاق تبلغ حوالي 24٪ بعد 30-40 دقيقة عند الرقم الهيدروجيني = 6.8. وفقا للنتائج التجريبية ، سادت كمية الفلافونويد المنطلق في الوسط المعوي الدقيق المحاكي مرتين هذا الذي تم إطلاقه في بيئة القولون المحاكية وثلاثة أضعاف كفاءة الإطلاق المحددة في المعدة. كان أعلى مدى لإطلاق الكيرسيتين الذي تم إنشاؤه في SIF عند الرقم الهيدروجيني = 7.4 في الدقيقة 70 - 90 هو 34٪ ، والذي تجاوز الإطلاق التراكمي للفلافونويد في SGF (الرقم الهيدروجيني = 1.2) و SIF (الرقم الهيدروجيني = 6.8) عند 23.5٪ و 18٪ ، باحترام.
الشكل 6: تحليلات مقارنة لكفاءة الإطلاق التراكمية في المختبر للمورين والكيرسيتين من جسيمات اللجنين الدقيقة ودون الميكرونية في الأوساط الفسيولوجية المحاكاة. تم تحقيق أعلى مدى لإطلاق مورين في محاكاة وسط الأمعاء الدقيقة. تم تسجيل أعلى كفاءة إطلاق للكيرسيتين في سائل القولون المحاكي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من بين القضايا الحاسمة الرئيسية لمنهجيات التوليف الحديثة لتصميم تركيبات حاملة للأدوية على أساس البوليمرات الحيوية هو تطبيق الكواشف العضوية الخطرة - المذيبات المتطايرة والقابلة للاشتعال ، مثل رباعي هيدروفوران ، الأسيتون ، الميثانول ، وحتى DMSO بتركيزات عالية - مما يحد من قابليتها للتطبيق في الطب الحيوي ، وصناعة الأدوية ، وتكنولوجيا الأغذية بسبب مظاهر الآثار السامة المحتملة20 ، 21,22,23,24. نقطة أخرى حاسمة هي إشراك تفاعلات كيميائية معقدة (على سبيل المثال ، الأسترة ، البلمرة) أو جهاز باهظ الثمن أثناء إجراء التوليف. تتغلب كلتا التقنيتين الواردتين في المخطوطة الحالية على القيود الأخيرة من خلال تضمين المذيبات البديلة (الماء) والمركبات غير السامة مثل المواد الخافضة للتوتر السطحي (Tween 80) وعوامل الربط المتقاطع (الإيثانول وحامض الستريك) ، وتصنيفها على أنها طرق تخليق "خضراء". علاوة على ذلك ، تقدم المنهجيات حلا يلبي الضرورة الحاسمة والحث على تطوير إجراءات غير مكلفة وصديقة للبيئة ومستدامة لتصميم جزيئات اللجنين ، تعمل كقوالب حاملة قابلة للتحلل البيولوجي ونشطة بيولوجيا ومتوافقة حيويا للمواد الفعالة من الناحية الفسيولوجية25.
للحصول على جزيئات اللجنين بالحجم المطلوب ، تم اختيار شرطين للإنتاج: أحدهما بتركيز عال من اللجنين (50 جم / لتر) وحمض النيتريك كعامل مضاد للمذيبات والآخر بتركيز أقل من اللجنين (5 جم / لتر) ، والإيثانول كمضاد للمذيبات ، وحمض الستريك يلعب دورا مزدوجا كعامل مضاد للمذيبات والربط المتقاطع في وقت واحد ، حيث كان هذان المتغيران يؤثران على حجم جزيئات اللجنين. تم الحفاظ على معدل التدفق خلال كلا الإجراءين منخفضا لتوفير جزيئات أصغر ومنع تجميعها. هناك بعض النقاط الحرجة التي يجب مراعاتها فيما يتعلق باختيار الأحماض العضوية وغير العضوية لبروتوكولات التوليف.
تم اختيار حمض النيتريك لأنه حمض غير عضوي قوي ، والذي يوفر قدرا كبيرا من ترسيب اللجنين القلوي ، ومن خلال التحكم في معدل جزيئات إضافته ضمن نطاق الحجم المطلوب يمكن الحصول عليه. علاوة على ذلك ، من المتوقع أن تؤدي إضافة HNO3 إلى تعديل جزيئات البوليمر غير المتجانس بسبب التغيرات الكيميائية المحتملة لبنية اللجنين المرتبطة بما يلي: عمليات تفاعلات استبدال النيترات لذرات H في حلقات البنزين مع مجموعات -NO2 ؛ أسترة مجموعات الأليفاتية -OH وتشكيل مجموعات وظيفية استر ؛ و / أو أكسدة مجموعات الفينول -OH و -OCH3 مما يؤدي إلى تكوين هياكل كينون. فيما يتعلق بدور تركيز الراسب واللجنين لحجم الجسيمات المركبة ، من ناحية ، أدى تركيز اللجنين الأولي العالي جنبا إلى جنب مع إضافة حمض النيتريك القوي (pKa = -1.4) والذوبان المحدود للبوليمر غير المتجانس القلوي في الحمض غير العضوي إلى إنتاج جزيئات ضمن نطاق الميكرومتر. من ناحية أخرى ، فإن إضافة الإيثانول إلى المحلول المائي للجنين القلوي مع التركيز المنخفض يثير تكوين تعليق جيد بسبب الذوبان الجزئي للجنين القلوي في الكحول. علاوة على ذلك ، أدت الإضافة اللاحقة لحمض الستريك إلى إنتاج جزيئات ضمن نطاق النانومتر لأن الحمض العضوي أضعف (pKa1 = 3.13) من حمض النيتريك ، وبالتالي يوفر امتدادا أقل لهطول الأمطار.
بعض الخصائص الأساسية للمستحضرات الصيدلانية النانوية هي تداول الدواء ، وإطلاق الدواء من أشكال الجرعات في مواقع محددة ، والامتصاص من خلال الأغشية البيولوجية. تتأثر هذه الخصائص بشكل كبير ببعض الخصائص الفيزيائية والكيميائية لناقلات الجسيمات النانوية وجزيئات الدواء المغلفة.
الخصائص الفيزيائية والكيميائية لناقلات البوليمر الحيوي: تركيز المجموعات الحمضية والأساسية النشطة على السطح ، نقطة الشحنة الصفرية (pHPZC) ، الحجم ، توزيع حجم الجسيمات ، وكذلك الخصائص الطيفية للجزيئات قبل وبعد دمج المادة النشطة بيولوجيا ، هي المعلمات الأساسية التي يجب مراعاتها عند تقييم المجموعات الوظيفية ، التفاعل ، الاستقرار ، وتجانس الجسيمات10.
يعد حجم الجسيمات وتوزيع حجم الجسيمات والشحنة والتشكل من بين العوامل الرئيسية التي تؤثر على هذه التقييمات. يؤثر حجم الجسيمات على استقرارها وتفاعلها وسلوك إطلاق الدواء26. توفر الجسيمات الأصغر مساحة أكبر لنقل الكتلة ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل إطلاق الدواء. في المقابل، تؤدي مساحة سطح نقل الكتلة الأصغر للجسيمات الأكبر إلى انخفاض معدل انتشار الدواء داخل هذه الجسيمات.
يتوسع باستمرار تطبيق طرق المعايرة كتقنيات أساسية لتحديد المواقع الحمضية والأساسية والمجموعات الوظيفية الموجودة على الأسطح الصلبة. تشمل المزايا الرئيسية لمعايرة الجهد توفير الوقت والعمالة ، والدقة العالية ، والقضاء على المعايير المرجعية والأجهزة باهظة الثمن. تم تطبيق الطريقة في هذه الدراسة لأنها تسمح بتوصيف جزيئات البوليمر الحيوي عن طريق التحديد النوعي وشبه الكمي لطبيعة وعدد المواقع النشطة الموجودة على سطح ناقلات البوليمرات الحيوية المحملة وغير المحملة27.
تلعب الشحنة السطحية للناقلات البيولوجية والطبية الدقيقة / النانوية دورا مهما في امتصاص الخلايا28. يتوافق الرقم الهيدروجينيPZC مع كثافة شحنة السطح الصفرية ، أي كميات مكافئة من الشحنات السالبة والموجبة التي طورها توازن البروتون. يوفر تحديد هذه القيم معلومات حول خصوصية الامتزاز29. ومع ذلك ، نظرا لأن النقطة المتساوية الكهربية للمعلمة تمثل فقط الشحنات السطحية الخارجية للجسيمات المعلقة ، في حين أن نقطة الشحنة الصفرية تختلف استجابة لإجمالي الشحنة السطحية الصافية (الخارجية والداخلية) للجسيمات ، فقد تم تطبيق بروتوكولpH pzc لأول مرة في هذه الدراسة كطريقة بسيطة وفعالة لتوصيف ناقلات أدوية البوليمر الحيوي. وفقا لمفهومpH pzc ، عند درجة الحموضة فوق الرقم الهيدروجينيpzc ، يكون سطح جزيئات البوليمر الحيوي مشحونا في الغالب سالبا ، بينما يتم ملاحظة شحنة موجبة صافية عندما يكون الرقم الهيدروجيني للتعليق أقل من الرقم الهيدروجينيpzc. من البيانات التجريبية المقدمة في الجدول 1 ، يمكن استنتاج أن جزيئات اللجنين الدقيقة والفرعية ، غير المحملة والفلافونويد مشحونة سالبة لأن درجة الحموضة >pzc.
تتأثر كفاءة تحميل الفلافونويد بكفاءة التغليف وقدرة تحميل الدواء. يتم تعريف كفاءة التغليف (E ، ٪) على أنها نسبة كمية الدواء المدمجة في الجسيمات إلى الكمية الإجمالية في التركيبة. تتأثر كفاءة التغليف بخصائص الدواء والمذيب والناقل30.
ومع ذلك ، فإن التوصيل الفعال للمادة الفعالة من الناحية الفسيولوجية يعتمد على الطريقة ومدى إطلاق جزيئاتها من المصفوفة الحاملة. وبالتالي ، من المهم جدا مراعاة آلية إطلاق الدواء ومعدل الإطلاق31،32،33. من خلال توضيح آلية إطلاق البيوفلافونويد في المختبر من حاملاتها البوليمرية الحيوية الدقيقة / النانوية ، يمكن للمرء محاكاة والتنبؤ بسلوك الفلافونويد والناقل في وسط فسيولوجي حقيقي وتحسين تصميم التركيبات الصيدلانية مع تحسين التوافر البيولوجي. النتائج التجريبية في المختبر التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة مفيدة للممارسة السريرية لأنها تثبت أنه نظرا لانخفاض مدى إطلاق مورين / كيرسيتين من اللجنين تحت ميكرون والجسيمات الدقيقة في بيئة المعدة ، فإن جزيئات البوليمر الحيوي المبتكرة مناسبة للإعطاء عن طريق الفم بسبب انخفاض خطر تهيج المعدة مقارنة بالإعطاء الفموي المباشر للمواد النشطة بيولوجيا. الجسيمات الدقيقة البوليمرية الحيوية المبتكرة مناسبة للإعطاء عن طريق الفم بسبب انخفاض خطر تهيج المعدة مقارنة بالإعطاء الفموي المباشر للمواد النشطة بيولوجيا. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق الجسيمات دون الميكرون ، نظرا لصغر حجمها وإمكانية إطلاقها الكبيرة ، كتركيبات قابلة للحقن. بالإضافة إلى ذلك ، توفر ناقلات اللجنين الدقيقة والفرعية الجديدة فرصة للتغلب على القيود التي أبلغ عنها علماء آخرون فيما يتعلق بالصعوبات المرتبطة بالإعطاء الفموي لجرعات عالية من بعض البيوفلافونويد ، الناتجة عن ميلها إلى تكوين محاليل مشبعة في الأمعاء ، والتي بدورها تعيق عملية الذوبان وارتشافها الفعال.
تمثل سهولة التوليف ، والتوافق الحيوي للجسيمات الناتجة ، وكذلك إمكانية تخصيص البروتوكول الحالي ، المزايا الرئيسية للمنهجية المقدمة. حجم الجسيمات هو الأمثل لتطبيقاتها المقصودة ، مما يوفر مساحة سطح كافية متاحة لمرفقات العلاجات واستهداف الشقوق ، والتي بدورها لا تتطلب إعطاء المزيد من الجسيمات لتحقيق متطلبات الجرعة المستهدفة. يسمح استخدام اللجنين كمصفوفة بوليمر غير متجانسة أساسية لتخليق الجسيمات المبتكرة بزيادة التوافق الحيوي ويوفر مجموعات وظيفية نشطة مختلفة توفر فرصا لتخصيص الجسيمات لتطبيقات متنوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل الصندوق العلمي البلغاري بموجب العقد رقم KΠ-06 H59/3 والمشروع العلمي رقم 07/2023 FVM ، جامعة تراكيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
