Summary
We beschrijven nieuwe, eenvoudige methodologieën voor synthese en karakterisering van biocompatibele lignine micro- en submicrondeeltjes. Deze formuleringen bieden een gemakkelijke benadering voor het gebruik van het heteropolymeer, evenals een alternatief voor het rationele ontwerp van multifunctionele draagmatrices met potentiële toepasbaarheid in de biogeneeskunde, farmaceutische technologie en de voedingsindustrie.
Abstract
De toepasbaarheid van biopolymeer micro-/nanotechnologie in de humane, diergeneeskunde, farmaceutica en voedingstechnologie neemt snel toe vanwege het grote potentieel van op biopolymeren gebaseerde deeltjes als effectieve draagsystemen. Het gebruik van lignine als een basis heteropolymeer biomatrix voor het ontwerp van innovatieve micro-/submicronformuleringen maakt het mogelijk om een verhoogde biocompatibiliteit te bereiken en biedt verschillende actieve functionele groepen die mogelijkheden bieden voor het aanpassen van de fysisch-chemische eigenschappen en bio-activiteiten van de formuleringen voor diverse toepassingen. Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een eenvoudige en milieuvriendelijke methodologie voor de synthese van ligninedeeltjes met micro- en submicrongrootte; om hun fysisch-chemische, spectrale en structurele kenmerken te evalueren; en om hun vermogen voor inkapseling van biologisch actieve moleculen en het potentieel voor in vitro afgifte van bioflavonoïden in gesimuleerde gastro-intestinale media te onderzoeken. De gepresenteerde methodologieën maken gebruik van goedkope en groene oplosmiddelen; Eenvoudige, ongecompliceerde, snelle en gevoelige processen die weinig apparatuur, niet-toxische stoffen en eenvoudige methoden voor hun karakterisering vereisen, de bepaling van de inkapselingscapaciteit voor de slecht in water oplosbare bioactieve stoffen morin en quercetine, en het in vitro afgiftepotentieel van de ligninematrices.
Introduction
Tegenwoordig is de neiging naar biopolymeren zoals cellulose, chitosan, collageen, dextran, gelatine en lignine als voorlopers voor het ontwerp van micro-/submicrondragers met aanpasbare grootte, fysisch-chemische eigenschappen en biofunctionaliteiten toegenomen in de biomedische, farmaceutische en voedingstechnologie-industrieën vanwege hun toepasbaarheid in weefselmanipulatie, 3D-bioprinten, in vitro Platforms voor ziektemodellering, verpakkingsindustrie, emulsiepreparaat en afgifte van voedingsstoffen onder andere 1,2,3.
Nieuwe studies benadrukken de aspecten van hydrogels op basis van lignine en micro- en nanoformuleringen4 als voordelige voertuigen die worden gebruikt voor voedselverpakkingsmaterialen5, energieopslag6, cosmetica7, thermische/lichte stabilisatoren, versterkte materialen en medicijndragermatrices8 voor de afgifte van hydrofobe moleculen, verbetering van UV-barrières9, als versterkende middelen in nanocomposieten, en als alternatief voor anorganische nanodeeltjes vanwege enkele recente veiligheidsproblemen 10,11,12. De reden achter deze tendens is de biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en niet-toxiciteit van het natuurlijke hetero-biopolymeer, evenals de bewezen bio-activiteiten van lignine-antioxidantpotentieel en radicalenopruimende, antiproliferatieve en antimicrobiële activiteiten 13,14,15,16,17.
In de wetenschappelijke literatuur worden verschillende methoden voor synthese beschreven (zelfassemblage, anti-solvent precipitatie, zure precipitatie en solvent shifting)18 en karakterisering van op lignine gebaseerde formuleringen op micro-/nanoschaal, waaronder de toepassing van dure of schadelijke oplosmiddelen zoals tetrahydrofuraan (THF), dimethylsulfoxide (DMSO), N,N-dimethylformamide (DMF) en aceton, en gecompliceerde, indirecte en vervelende processen waarbij veel apparatuur en giftige stoffen worden gebruikt12,19,20.
Om deze laatste nadelen te ondervangen, presenteren de volgende protocollen nieuwe methodologieën voor de synthese van op lignine gebaseerde micro-/submicrondeeltjes met behulp van goedkope en groene oplosmiddelen; Eenvoudige, ongecompliceerde, snelle en gevoelige processen die weinig apparatuur, niet-toxische stoffen en eenvoudige methoden vereisen voor hun karakterisering en de bepaling van de inkapselingscapaciteit voor slecht in water oplosbare bioactieve stoffen en het in vitro afgiftepotentieel van de ligninematrices. De gepresenteerde productiemethoden op laboratoriumschaal zijn voordelig voor de vervaardiging van functionele ligninedragers met afstembare maten, hoge inkapselingscapaciteit en duurzaam in-vitro-afgiftegedrag met behulp van eenvoudige karakteriseringsprocedures en milieuvriendelijke chemicaliën die toepassing kunnen vinden in verschillende gebieden van de biomedische wetenschappen en voedseltechnologie. Twee flavonoïden werden toegepast als doelmoleculen ingekapseld in de ligninedeeltjes: morin in de microdeeltjes en quercetine in de submicrondeeltjes. Het verschil in de structuren van beide flavonoïden is alleen de positie van de tweede -OH-groep in de B-aromatische ring: de -OH-groep bevindt zich op de 2'-positie in morin en op de 3'-positie in quercetine, dus beide organische verbindingen zijn positionele isomeren. Dit laatste feit veronderstelt vergelijkbaar gedrag van beide bioactieve natuurlijke verbindingen in de processen van inkapseling en/of afgifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van lignine microdeeltjes
- Bereid een waterige oplossing van 50 mg/ml alkalische lignine door 2,5 g alkalische lignine op te lossen in 50 ml ultrapuur water op een magnetische roerder.
- Bereid 1% Tween 80-oplossing door 1 ml Tween 80 op te lossen in 100 ml ultrapuur water.
- Bereid een 2 M-oplossing van HNO3 door 6,65 ml 67% HNO3 (dichtheid = 1,413 g/ml) te verdunnen met ultrapuur water tot een eindvolume van 50 ml.
- Voeg langzaam 15 ml van de 1% Tween 80-oplossing toe aan 50 ml van de 50 mg/ml alkalische lignine-oplossing.
- Roer het mengsel op een magnetische roerder bij 500 tpm gedurende 10 minuten zodat de oppervlakteactieve stof goed wordt verspreid.
- Voeg druppelsgewijs 20 ml 2 M HNO3 met een spuit met een debiet van ongeveer 150 μl/s toe aan het mengsel.
- Blijf het mengsel 30 minuten roeren wanneer de donkerbruine oplossing is omgezet in een lichtbruine suspensie van microdeeltjes.
- Breng de suspensie over in reageerbuisjes van 1,5-2 ml en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 15.000 × g in een ultracentrifuge bij 10 °C.
- Verzamel het supernatans voor verdere analyses en spoel de microdeeltjes af met ultrapuur water.
- Herhaal de spoel-/ultracentrifugatieprocedures 3x.
- Dompel de container met de microdeeltjes in een ijsbad vóór de ultrasone homogenisatie.
- Homogeniseer de microdeeltjes gedurende 4 minuten met een intensiteit van 93% op een ultrasone homogenisator.
- Lyofiliseer de microdeeltjes bij een temperatuur van -64 °C in een vriesdroger en bewaar ze in een exicator voor verder gebruik.
2. Synthese van lignine submicron deeltjes
- Bereid een waterige oplossing van 5 mg/ml alkalische lignine door 125 mg alkalische lignine op te lossen in 25 ml ultrapuur water op een magnetische roerder.
- Voeg langzaam 1 ml 96% EtOH toe aan de alkalische lignine-oplossing.
- Roer het mengsel op een magnetische roerder op 500 tpm gedurende 3 minuten.
- Bereid 50 ml van een 1% -oplossing van citroenzuur door 0,5 g citroenzuur op te lossen in ultrapuur water tot een eindvolume van 50 ml.
- Voeg druppelsgewijs 7 ml 1% citroenzuur toe met een spuit met een stroomsnelheid van ongeveer 4 ml/min aan het mengsel.
- Blijf het mengsel 10 minuten roeren wanneer de bruine heldere oplossing verandert in een troebele lichtbruine suspensie van submicrondeeltjes.
- Breng de suspensie over in reageerbuizen en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 15.000 × g in een ultracentrifuge bij 10 °C.
- Verzamel het supernatans voor verdere analyses en spoel de microdeeltjes af met ultrapuur water.
- Herhaal de spoel-/ultracentrifugatieprocedures 3x.
- Dompel de container met de microdeeltjes in een ijsbad vóór de ultrasone homogenisatie.
- Homogeniseer de microdeeltjes ultrasoon gedurende twee cycli van elk 4 minuten met een intensiteit van 96% in een ultrasone homogenisator.
- Koel de containers 1 minuut na de eerste cyclus.
- Lyofiliseer de microdeeltjes bij een temperatuur van -64 °C in een vriesdroger en bewaar ze in een exicator voor verder gebruik.
3. Synthese van natuurlijke flavonoïde-ingekapselde lignine micro-/submicron deeltjes
- Herhaal stap 1.1-1.5 voor de microdeeltjes.
- Weeg 0,08 g morin af, los het op in 1 ml EtOH en voeg deze ethanoloplossing toe aan het mengsel.
- Roer het mengsel op een magnetische roerder op 500 tpm gedurende 20 minuten.
- Voeg druppelsgewijs 20 ml 2 N HNO3 met een spuit met een debiet van ongeveer 150 μl/s toe aan het mengsel.
- Blijf het mengsel 60 minuten roeren.
- Herhaal stap 1.8-1.13.
- Herhaal stap 2.1 voor de submicrondeeltjes.
- Weeg 0,04 g quercetine af, los het op in 1 ml EtOH en voeg deze ethanoloplossing toe aan de alkalische lignine-waterige oplossing.
- Roer het mengsel op een magnetische roerder op 500 tpm gedurende 10 minuten.
- Herhaal stap 2.4-2.13.
4. Bepaling van de inkapselingsefficiëntie van lignine micro-/sumicro- deeltjes
- Bereken het gehalte aan de toegevoegde bioactieve stof tijdens de procedure voor de synthese van beide soorten met flavonoïden ingekapselde ligninedeeltjes.
- Bepaal spectrofotometrisch de absorptie van het flavonoïde in het supernatans verkregen tijdens stap 1.9 en 2.8 na verdunning met 96% EtOH.
- Bereken de concentratie van het niet-ingesloten morin/quercetine met behulp van de kalibratiecurven van de flavonoïden.
- Bereken de inkapselingsefficiëntie (EE, %) van de lignine-microdeeltjes naar de natuurlijke flavonoïden met behulp van vergelijking (1):
(1)
Waarbij wo de totale hoeveelheid van de toegevoegde bioactieve stof is (mg) en wf de hoeveelheid van de vrije niet-ingesloten flavonoïde (mg). - Bereken de laadcapaciteit van het geneesmiddel (DLC, %) - een belangrijke parameter die de hoeveelheid geneesmiddel in de deeltjes per gewichtseenheid van het dragersysteem vertegenwoordigt - met behulp van eq. (2):
(2)
Waarbij wp de totale hoeveelheid (opbrengst) lignine micro-/submicrondeeltjes is die wordt verkregen na vriesdrogen (mg).
(1)
(2)5. Karakterisering van lignine micro- en submicrondeeltjes
- Bepaling van het aantal, de grootte en de grootteverdeling van het deeltje
- Beoordeel de deeltjesgrootte en de deeltjesgrootteverdeling van de monsters met behulp van een automatische celteller met de optie voor het tellen van de parels. Voeg met een micropipet 1 μL van de lignine/flavonoïde micro-/submicrondeeltjes suspensie in ultrapuur water toe in het putje van het telglaasje dat nodig is voor de operatie.
- Wacht tot het aantal deeltjes in 1 ml van de suspensie, evenals hun aantal en verdeling per grootte wordt weergegeven op het display van de automatische cellenteller.
OPMERKING: Het apparaat maakt het mogelijk om de gegevens op een USB-stick op te slaan. De speciale software voor automatische cellenteller maakt verdere verwerking van de opgeslagen digitale en fotobestanden mogelijk.
- Bepaling van het gehalte aan zware/basische groepen ligninedeeltjes aan het oppervlak door middel van potentiometrische titratie
- Gewicht 0,04 g onbelaste/met flavonoïden ingekapselde ligninedeeltjes.
- Breng ze over in een erlenmeyer, voeg 10 ml 0,1 M HCl toe en plaats de kolf op een magnetische roerder bij 250 tpm.
- Vul een buret van 50 ml met een standaardoplossing van 0,1 m van de titrant NaOH.
- Meet de begin-pH van de oplossing in de erlenmeyer met een pH-meter voor de werkbank voordat u met de titratie begint.
- Start de titratie en meet de pH van de geanalyseerde oplossing na elke 0,5 ml toegevoegde portie van de titrant.
- Sla de experimentele gegevens op in een tabel met het volume van de toegepaste titrant en de bijbehorende pH-waarde.
- Stop de titratie wanneer een ongeveer constante waarde van de pH is bereikt door het volume van de titrantoplossing te vergroten.
- Zet de experimentele gegevens uit in de vorm van nul-, eerste- en tweede-afgeleide differentiële titratiecurves.
- Bepaal de equivalente punten en de overeenkomstige equivalente volumes van de gebruikte titranten.
- Bereken het gehalte van de zure A,aen A, bbasengroepen op het oppervlak van onbelaste en met flavonoïden beladen ligninedeeltjes met behulp van vergelijkingen (3) en (4):
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
Waarbij Veqi het equivalente volume (ml) is; NT de normaliteit van de titrant (mgeqv/ml); VT het volume van de titrant dat voor de bepalingsprocedure is gebruikt (ml); m het gewicht van het geanalyseerde monster (g).
- Bepaling van het pH-punt van nullading (pHPZC) van lignine-gebaseerde deeltjes door middel van de vaste additiemethode.
- Bereid 60 ml 0,1 M waterige oplossing van NaCl.
- Voeg 9 ml van de 0,1 M NaCl-oplossing toe aan elk van de vijf conische kolven met stop en stel de pH in op pHi = 2, 4, 7, 10 en 12 (waarbij i = 1-5 het nummer van de overeenkomstige oplossing aangeeft), respectievelijk door toevoeging van 0,1 M HCl of 0,1 M NaOH. Stel het totale volume van de oplossing in elke kolf precies in op 10 ml door NaCl-oplossing van dezelfde sterkte toe te voegen.
- Voeg 40 mg droge ligninedeeltjes (ongeladen, met flavonoïden beladen micro-/submicron) toe aan elke kolf en sluit de kolven goed af.
- Zet de kolven rechtop op een orbitale schudder en laat ze 24 uur schudden.
- Laat de temperatuur gedurende 30 minuten in evenwicht zijn en meet vervolgens de uiteindelijke pH (pHf) van de supernatanten in elke kolf.
- Zet de pHf-waarden af tegen de overeenkomstige begin-pH-waarden (pHi).
- Het punt van nullading (pHPZC) wordt gedefinieerd als de pH-waarde waarbij de curve ΔpH versus pHi de rechte lijn snijdt met coördinaten (pHi; pHi).
- Bepaling van het totale fenolgehalte (TPC) van ligninedeeltjes
OPMERKING: Het totale fenolgehalte (TPC) van de micro-/submicron ligninedeeltjes wordt bepaald via een gemodificeerde colorimetrische methode van Folin-Ciocalteu.- Meng 200 μl van een waterige suspensie van deeltjes met een concentratie van 500 μg/ml met 600 μl ultrapuur water en 200 μl Folin-Ciocalteu-reagens (1:1, v/v).
- Voeg na 5 minuten 1,0 ml 8% Na2CO3 en 1,0 ml Milli-Q water toe aan het mengsel en incubeer het 30 minuten in het donker bij 40 °C in een waterbad met intermitterende agitatie.
- Centrifugeer de suspensie bij 5.300 × g gedurende 2 minuten.
- Maak een blanco die geen deeltjes bevat.
- Breng 3,5 ml van het supernatans over in een kwartscuvet van 10 mm en meet de extinctie op een UV/Vis-spectrofotometer in het zichtbare gebied bij 760 nm ten opzichte van de blanco.
- Maak een kalibratiecurve van het standaard galluszuur volgens de stappen 5.3.1-5.3.5; gebruik alleen in plaats van 200 μl van de ligninedeeltjessuspensie de ethanoloplossing van galluszuur met beginconcentraties van 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 en 200 μg/ml.
- Druk de experimentele gegevens van de microdeeltjes uit in mg galluszuurequivalenten in milligram per gram droog monster (mg GAE/g).
- Bereken TPC met behulp van vergelijking (5):
mg GAE/g (5)
waarbij CGA de concentratie van het monster is die overeenkomt met de concentratie van het standaard galluszuur uit de kalibratiegrafiek van het zuur (μg GA/ml); Cs is de concentratie van het monster, die gelijk is aan de massa van het droge monster gedeeld door het volume van het oplosmiddel (μg/ml).
, mgeq/g (3)
mgeq/g (4)
mg GAE/g (5)6. Bepaling van het in vitro afgiftevermogen van ligninedeeltjes
- Bereid 250 ml gesimuleerd enzymvrij maagmedium voor door de pH van de standaard PBS-oplossing met 0,1 M HCl aan te passen aan pH = 1,2.
- Bereid 250 ml van elk van de twee gesimuleerde darmvloeistofoplossingen door de pH van de standaard PBS-oplossing aan te passen met 0,1 M NaOH/0,1 M HCl tot pH = respectievelijk 6,8 en 7,4.
- Voeg 25 mg met flavonoïden ingekapselde micro-/submicrondeeltjes toe aan 50 ml van het gesimuleerde enzymvrije maagmedium in een glazen batchreactor die wordt geleverd met een mechanische roerder en plaats deze in een thermaal waterbad bij een constante temperatuur van T = 37 ± 0,2 °C.
- Dompel de roerder onder tot een diepte van 2/3 van het vloeistofvolume om een volledige menging van de vaste en vloeibare fasen te garanderen en een maximale massaoverdracht te garanderen zonder stagnerende zones.
- Haal elke 10 min tot de 90eminuut 1 ml monster uit de reactor en pipetteer onmiddellijk 1 ml verse gesimuleerde vloeistofoplossing in de reactor om verandering van het totale volume te voorkomen en om ervoor te zorgen dat het lichaam in de reactor zinkt.
- Herhaal dezelfde procedure, inclusief stap 6.3-6.6, met beide gesimuleerde darmvloeistofoplossingen met pH = 6.8 en 7.4, respectievelijk, gedurende 200 minuten.
- Voer analoge experimenten uit met onbelaste ligninedeeltjes in de drie gesimuleerde media en gebruik de monsters als blanco's voor het op nul zetten van de spectrofotometer.
- Bepaal de absorptie van de monsters spectrofotometrisch na het filtreren van de monsters en verdunnen met 96% EtOH ten opzichte van de blancomonsters uit stap 6.7 en bereken de overeenkomstige flavonoïdeconcentratie met behulp van de overeenkomstige kalibratiecurven van morin verkregen bij pH = 1,2, 6,8 en 7,4, respectievelijk.
- Bereken de cumulatieve afgifte (CR) van de bioflavonoïden met behulp van vergelijking (6) in μg/ml en het cumulatieve afgiftepercentage (CRP) met vergelijking (7):
(6)
Waarbij Ci en Ci+1 de concentraties morin/quercetine in de ide en (i+1)e monsters (μg/ml) zijn; Vs het monstervolume dat uit de batchreactor is genomen (ml); V het totale volume van de gesimuleerde media (ml).
(7)
Waarbij Cmax de maximale concentratie van de biologisch actieve stof in de drager is (μg/ml).
(6)
(7)7. Statistische analyses
- Druk de experimentele gegevens uit als gemiddelden ± standaarddeviaties (SD) van drie onafhankelijke metingen.
- Bepaal de statistische significantie van de experimentele resultaten door de ANOVA-test uit te voeren als de post-hoctest. Beschouw een waarde van p < 0,05 als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er werd een anti-solvent precipitatietechniek uitgevoerd om alkalische lignine micro-/submicrondeeltjes te produceren. Een waterige oplossing van verdund anorganisch zuur-salpeterzuur/organisch zuur-citroenzuur werd gedispergeerd in een alkalische lignine-waterige oplossing, verrijkt met een milieuvriendelijke oppervlakteactieve stof/ethanol, wat resulteerde in de geleidelijke precipitatie van de biopolymeer opgeloste stof en, na sonicatie, werd uiteindelijk een suspensie van compacte micro-/submicrondeeltjes geproduceerd (Figuur 1).
Figuur 1: Homogenisatie van ligninedeeltjes. (A) Ultrasone homogenisatie van de gesynthetiseerde lignine-submicrondeeltjes; (B) Gehomogeniseerde morin-geladen en ongeladen lignine-microdeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De grootte, het aantal en de grootteverdeling van de onbelaste en in morin ingekapselde lignine-microcarriers werden bepaald (Figuur 2). De experimentele gegevens toonden een hogere concentratie, 1 × 107 deeltjes/ml (2.037 deeltjes/μl), en een hogere gemiddelde grootte, 6.1 μm, van de met bioflavonoïden beladen microcarriers (figuur 2B) dan de onbelaste met een concentratie van 7.4 × 106 deeltjes/ml (1.474 deeltjes/μL) en een gemiddelde grootte van 5.7 μm (figuur 2A). De procentuele grootteverdeling van beide soorten deeltjes binnen het groottebereik van 3-6 μm was 75,2% voor de onbelaste en 69,3% voor de morin-ingekapselde microcarriers en respectievelijk 20,2% en 25,2% binnen het bereik van 7-10 μm. De hoeveelheid, concentratie en stroomsnelheid van het antioplosmiddel, salpeterzuur, zijn essentieel voor de grootte van de deeltjes. De hogere concentratie en grotere hoeveelheid van het zuur leidt tot grotere deeltjes, terwijl de hogere stroomsnelheid aggregatie van de suspensie veroorzaakt.
Figuur 2: Deeltjesgrootteverdeling. (A) Werkelijke grootteverdeling van onbelaste lignine-microdeeltjes in 1 μL suspensiesoftware van de deeltjesteller; (B) werkelijke grootteverdeling van morin-ingekapselde alkali-lignine-microdeeltjes in 1 μL suspensiesoftware van de deeltjesteller. (C) Microscopische foto van de verdeling van de onbelaste lignine-microdeeltjes; (D) microscopische foto van de verdeling van de morin-ingekapselde alkalische lignine-microdeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 toont de UV/Vis-absorptiespectra van ethanol morin-oplossingen, alkali-lignine-waterige oplossingen en de mengsels die morin en lignine bevatten met verschillende beginconcentraties. Het spreekt voor zich dat de absorptiepieken van zuivere lignine en de bioflavonoïde niet samenvallen en dat het heteropolymeer geen verstorende invloed uitoefent tijdens de toegepaste spectrofotometrische methode voor de bepaling van de morinconcentratie in de vloeibare fase na inkapseling van de flavonoïde in de polymeermicrodragers en tijdens de in vitro release-experimenten. De maximale absorptie van morin in het tweecomponentenmengsel verschoof naar een hogere golflengte, van λmax = 359 nm naar λmax = 395 nm, als gevolg van de verhoogde pH van het medium door de aanwezigheid van alkalilignine. Deze laatste afwijking van het absorptiemaximum in het zichtbare gebied maakte het noodzakelijk om kalibratiecurven van morin te ontwerpen bij verschillende pH-waarden van het medium (figuur 4A). De drie standaardcurven die worden gekenmerkt door zeer sterke lineaire correlaties werden bewezen door de hoge waarden van de regressiecoëfficiënten (R2 > 0,99) binnen het morin-concentratiebereik Co = 2,5-100 μg/ml. Evenzo vertoonden de drie standaardcurven van quercetine in de drie gesimuleerde fysiologische compartimenten, gepresenteerd in figuur 4B, een hoge lineariteit binnen hetzelfde concentratiebereik.
Figuur 3: Vergelijking van de UV/VIS-spectra van ethanolische oplossingen van morin, alkalische lignine-waterige oplossingen en mengsels die morin en lignine bevatten met verschillende beginconcentraties. De spectra van pure lignine en morin vallen niet samen en het heteropolymeer oefent geen storende invloed uit. De toevoeging van lignine aan morin leidt tot een verschuiving van de maximale absorptie van morin naar een hogere golflengte, van λmax = 359 nm naar λmax = 395 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kalibratiecurven van ethanolische flavonoïde oplossingen. (A) Morin en (B) quercetine binnen het concentratiebereik Co = 2,5-100 μg/ml bij pH = 1,2 (in blauw) (overeenkomend met gesimuleerde maagvloeistof), pH = 6,8 (in rood) (overeenkomend met gesimuleerde dunne darmvloeistof) en pH = 7,4 (in groen) (overeenkomend met gesimuleerde dikke darmvloeistof). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De relatieve concentratie van zure en basische actieve plaatsen/functionele groepen op het oppervlak van de onbelaste en geladen alkalische ligninedeeltjes werd bepaald door middel van potentiometrische titratie. De berekeningen waren gebaseerd op de equivalente titrantvolumes die werden bepaald door de tweede afgeleide differentiële titratiecurven (figuur 5). De waarden van het bepaalde pKa, de concentraties van zure (sterke, zwakke, totale) functionele groepen, en de pH en pHpzc van de micro- en submicrondeeltjes zijn weergegeven in tabel 1.
Figuur 5: Tweede afgeleide differentiële potentiometrische titratiecurven van de onbelaste en geladen lignine micro-/submicrondeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Parameter | lignine microdeeltjes | Morin-ingekapselde lignine microdeeltjes | lignine submicron deeltjes | quercetine-ingekapselde lignine submicron deeltjes |
| Veq., ml | 10.5 | 2.75 | 2.25 4.3 |
2.75 3.75 |
| pKa | 11.1 | 10.8 | 3.0 8.0 |
4.2 7.0 |
| Aa (sterk), mgeq/g | 26.25 | 6.88 | 16.38 | 16.3 |
| Aa (zwak), mgeq/g | 11.25 | 13.13 | 11.25 | 13.13 |
| Aa (totaal), mgeq/g | 37.5 | 20 | 27.63 | 29.43 |
| pH (waterige suspensie) | 4.45 | 4.1 | 4.54 | 4.13 |
| pHpzc | 2.3 | 2.0 | 3.8 | 3.0 |
Tabel 1: Waarden van het equivalente volume titrant (Veq), de logaritme van de negatieve base -10 van de zure dissociatieconstante (pKa), concentraties van zure (sterke, zwakke, totale) functionele groepen (Aa, mgeq/g), pH en punt van nullading (pHpzc) van de onbelaste en geladen lignine micro- en submicrondeeltjes. De micro- en submicron, onbelaste en met flavonoïden beladen ligninedeeltjes zijn negatief geladen omdat hun pHpzc >.
Het totale fenolgehalte (TPC), bepaald met een gewijzigde colorimetrische methode van Folin-Ciocalteu en berekend als galluszuurequivalenten, bedroeg 78,2 mg GAE/g van de onbelaste ligninedeeltjes, terwijl de waarde van TPC van de morin-ingekapselde microcarriers met dezelfde concentratie 2,3 keer hoger was (183,43 mg GAE/g). Dit laatste geeft aan dat de hetero-biopolymeerdeeltjes worden verrijkt met extra fenolische groepen door de opname van de flavonoïde moleculen. De efficiëntie van de inkapseling van flavonoïden was: 98,1% voor morin en 97,6% voor quercetine. De inkapselingscapaciteit van het geneesmiddel was 28,2% voor de met morin geladen microdeeltjes en 39,0% voor de met quercetine ingekapselde submicrondeeltjes.
De in vitro cumulatieve afgifte van morin en quercetine werd onderzocht in gesimuleerde gastro-intestinale enzymvrije media: maag-, kleine darm- en darmvloeistoffen bij pH = respectievelijk 1,2, 6,8 en 7,4 (Figuur 6). De hoogste afgifte-efficiëntie van ongeveer 24% werd bereikt na 30-40 minuten bij pH = 6,8. Volgens de experimentele resultaten was de hoeveelheid van de vrijgekomen flavonoïde in het gesimuleerde dunne darmmedium twee keer zo groot als de hoeveelheid die vrijkwam in de gesimuleerde darmomgeving en drie keer de afgifte-efficiëntie die in de maag werd bepaald. De hoogste mate van quercetine-afgifte vastgesteld in SIF bij pH = 7,4 op de 70e-90emin was 34%, wat de cumulatieve afgifte van de flavonoïde in SGF (pH = 1,2) en SIF (pH = 6,8) overtrof met respectievelijk 23,5% en 18%.
Figuur 6: Vergelijkende analyses van de cumulatieve in vitro afgifte-efficiëntie van morin en quercetine uit lignine micro- en submicrondeeltjes in gesimuleerde fysiologische media. De hoogste mate van morin-afgifte werd bereikt in een gesimuleerd medium in de dunne darm. De hoogste afgifte-efficiëntie van quercetine werd geregistreerd in gesimuleerde darmvloeistof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een van de belangrijkste kritieke kwesties van moderne synthesemethodologieën voor het ontwerp van formuleringen van geneesmiddeldragers op basis van biopolymeren is de toepassing van gevaarlijke organische reagentia - vluchtige en ontvlambare oplosmiddelen, zoals tetrahydrofuraan, aceton, methanol en zelfs DMSO in hoge concentraties - die hun toepasbaarheid in de biogeneeskunde, de farmaceutische industrie en de voedingstechnologie beperkt vanwege de manifestatie van mogelijke toxische effecten20, 21,22,23,24. Een ander cruciaal punt is de betrokkenheid van gecompliceerde chemische reacties (bijv. verestering, polymerisatie) of dure apparatuur tijdens het syntheseproces. Beide technieken die in het huidige manuscript worden gepresenteerd, overwinnen de laatste beperkingen door de implicatie van alternatieve oplosmiddelen (water) en niet-toxische verbindingen zoals oppervlakteactieve stoffen (Tween 80) en verknopingsmiddelen (ethanol, citroenzuur), en classificeren ze als "groene" synthesemethoden. Bovendien bieden de methodologieën een oplossing die voldoet aan de kritieke noodzaak en drang naar de ontwikkeling van goedkope, milieuvriendelijke en duurzame procedures voor het ontwerp van ligninedeeltjes, die dienen als biologisch afbreekbare, bioactieve en biocompatibele dragersjablonen van fysiologisch actieve stoffen25.
Om ligninedeeltjes met de gewenste grootte te verkrijgen, werden twee productieomstandigheden gekozen: een met een hoge lignineconcentratie (50 g/l) en salpeterzuur als anti-oplosmiddel en een andere met een lagere lignineconcentratie (5 g/l), ethanol als antioplosmiddel en citroenzuur dat tegelijkertijd een dubbele rol speelt van antioplosmiddel en verknopingsmiddel, aangezien dit de twee variabelen waren die de grootte van ligninedeeltjes beïnvloeden. Het debiet tijdens beide procedures werd laag gehouden om kleinere deeltjes te leveren en hun ophoping te voorkomen. Er zijn enkele kritische punten waarmee rekening moet worden gehouden met betrekking tot de keuze van de anorganische en organische zuren voor de syntheseprotocollen.
Salpeterzuur werd gekozen omdat het een sterk anorganisch zuur is, dat een hoge mate van precipitatie van alkali-lignine biedt, en door de snelheid van de toevoeging te regelen, kunnen deeltjes binnen het gewenste groottebereik worden verkregen. Bovendien wordt verwacht dat de toevoeging van HNO3 zou kunnen leiden tot een wijziging van de heteropolymeerdeeltjes als gevolg van waarschijnlijke chemische veranderingen in de ligninestructuur die verband houden met: processen van nitratie-substitutiereacties van H-atomen in de benzeenringen met -NO2-groepen ; verestering van alifatische -OH-groepen en de vorming van esterfunctionele groepen; en/of oxidatie van fenolische -OH- en -OCH3-groepen , resulterend in de vorming van chinonstructuren. Wat betreft de rol van de precipitant en de lignineconcentratie voor de grootte van de gesynthetiseerde deeltjes, enerzijds leidde de hogere initiële lignineconcentratie in combinatie met de toevoeging van het sterke salpeterzuur (pKa = -1,4) en de beperkte oplosbaarheid van het alkaliheteropolymeer in het anorganische zuur tot de productie van deeltjes binnen het micrometerbereik. Aan de andere kant veroorzaakt de toevoeging van ethanol aan de waterige oplossing van alkali-lignine met de lagere concentratie de vorming van een fijne suspensie vanwege de gedeeltelijke oplosbaarheid van alkali-lignine in de alcohol. Bovendien leidde de daaropvolgende toevoeging van citroenzuur tot de productie van deeltjes binnen het nanometerbereik omdat het organische zuur zwakker is (pKa1 = 3,13) dan salpeterzuur, waardoor het een lagere neerslaguitbreiding biedt.
Enkele basiseigenschappen van geneesmiddelen in nanoformaat zijn de circulatie van geneesmiddelen, de afgifte van geneesmiddelen uit doseringsvormen op specifieke plaatsen en de absorptie door biologische membranen. Deze eigenschappen worden aanzienlijk beïnvloed door enkele fysische en chemische kenmerken van de nanodeeltjesdragers en door de ingekapselde geneesmiddelmoleculen.
De fysisch-chemische kenmerken van biopolymeerdragers: concentratie van oppervlakteactieve zure en basische groepen, punt van nullading (pHPZC), grootte, deeltjesgrootteverdeling, evenals de spectrale kenmerken van de deeltjes voor en na de opname van de bioactieve stof, zijn essentiële parameters waarmee rekening moet worden gehouden bij de evaluatie van de functionele groepen, reactiviteit, stabiliteit en homogeniteit van de deeltjes10.
Deeltjesgrootte, deeltjesgrootteverdeling, lading en morfologie behoren tot de belangrijkste factoren die van invloed zijn op deze evaluaties. De deeltjesgrootte beïnvloedt hun stabiliteit, reactiviteit en gedrag bij het vrijkomen van geneesmiddelen26. Kleinere deeltjes bieden een groter massaoverdrachtsgebied, wat leidt tot een hogere afgiftesnelheid van het geneesmiddel. Daarentegen resulteert het kleinere massaoverdrachtsoppervlak van grotere deeltjes in een lagere diffusiesnelheid van het geneesmiddel in deze deeltjes.
De toepassing van titrimetrische methoden als basistechnieken voor de bepaling van zure en basische plaatsen en functionele groepen die aanwezig zijn op vaste oppervlakken breidt zich voortdurend uit. De belangrijkste voordelen van potentiometrische titratie zijn tijd- en arbeidsbesparing, hoge precisie en de eliminatie van referentiestandaarden en dure apparatuur. De methode werd in de huidige studie toegepast omdat het de karakterisering van biopolymeerdeeltjes mogelijk maakt door kwalitatieve en semikwantitatieve bepaling van de aard en het aantal actieve plaatsen op het oppervlak van geladen en onbelaste biopolymeerdragers27.
De oppervlaktelading van biologische en medische micro-/nanodragers speelt een belangrijke rol bij de cellulaire opname28. De pHPZC komt overeen met een oppervlakteladingsdichtheid van nul, dat wil zeggen met equivalente hoeveelheden negatieve en positieve ladingen die worden ontwikkeld door protonenevenwichten. De bepaling van deze waarden geeft informatie over de specificiteit van adsorptie29. Aangezien het iso-elektrische punt van de parameter echter alleen de externe oppervlakteladingen van deeltjes in suspensie vertegenwoordigt, terwijl het punt van nullading varieert als reactie op de totale netto oppervlaktelading (extern en intern) van de deeltjes, werd het pHpzc-protocol voor het eerst toegepast in de huidige studie als een eenvoudige en effectieve methode voor de karakterisering van biopolymeer geneesmiddeldragers. Volgens het concept van pHpzc is het oppervlak van de biopolymeerdeeltjes bij pH boven de pHpzc overwegend negatief geladen, terwijl een netto positieve lading wordt waargenomen wanneer de pH van de suspensie onder de pHpzc ligt. Uit de experimentele gegevens in tabel 1 kon worden geconcludeerd dat de micro- en submicron-, onbelaste en met flavonoïden beladen ligninedeeltjes negatief geladen zijn omdat hun pH > pHpzc.
De efficiëntie van het laden van flavonoïden wordt beïnvloed door de efficiëntie van de inkapseling en de laadcapaciteit van het geneesmiddel. Inkapselingsefficiëntie (E, %) wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de hoeveelheid van het geneesmiddel die in de deeltjes is opgenomen en de totale hoeveelheid in de formulering. De inkapselingsefficiëntie wordt beïnvloed door de kenmerken van het geneesmiddel, het oplosmiddel en de drager30.
De efficiënte afgifte van een fysiologisch actieve stof hangt echter af van de manier waarop en de mate waarin de moleculen uit de dragermatrix worden vrijgegeven. Het is dus erg belangrijk om rekening te houden met het afgiftemechanisme van het geneesmiddel en de afgiftesnelheid 31,32,33. Door het in vitro afgiftemechanisme van bioflavonoïden uit hun biopolymere micro-/nanodragers op te helderen, kan men het gedrag van de flavonoïde en de drager in een echt fysiologisch medium simuleren en voorspellen en het ontwerp van farmaceutische formuleringen optimaliseren met verbeterde biologische beschikbaarheid. De experimentele in vitro resultaten die in deze studie zijn verkregen, zijn nuttig voor de klinische praktijk, omdat ze aantonen dat vanwege de lagere mate van morin/quercetine-afgifte uit lignine-submicron en microdeeltjes in de maagomgeving, de innovatieve biopolymeerdeeltjes geschikt zijn voor orale toediening vanwege het lagere risico op maagirritatie in vergelijking met directe orale toediening van de bioactieve stoffen. De innovatieve biopolymeer microdeeltjes zijn geschikt voor orale toediening vanwege het lagere risico op maagirritatie in vergelijking met directe orale toediening van de bioactieve stoffen. Bovendien zouden de submicrondeeltjes, vanwege hun kleine formaat en aanzienlijke afgiftepotentieel, kunnen worden toegepast als injecteerbare formuleringen. Bovendien bieden de nieuwe lignine-micro- en submicrondragers de mogelijkheid om de beperkingen te overwinnen die door andere wetenschappers zijn gemeld in verband met moeilijkheden in verband met de orale toediening van hoge doses van bepaalde bioflavonoïden, als gevolg van hun neiging om verzadigde oplossingen te vormen in het darmkanaal, wat op zijn beurt het ontbindingsproces en hun efficiënte resorptie belemmert.
Het gemak van synthese, de biocompatibiliteit van de resulterende deeltjes, evenals de mogelijkheid om het huidige protocol aan te passen, vertegenwoordigen de grote voordelen van de gepresenteerde methodologie. De grootte van de deeltjes is optimaal voor de beoogde toepassingen en biedt voldoende oppervlak beschikbaar voor aanhechtingen van therapieën en richtgroepen, waardoor er niet meer deeltjes hoeven te worden toegediend om de beoogde doseringsvereisten te bereiken. Het gebruik van lignine als de basis heteropolymeermatrix voor de synthese van innovatieve deeltjes zorgt voor een verhoogde biocompatibiliteit en biedt verschillende actieve functionele groepen die mogelijkheden bieden voor het aanpassen van de deeltjes voor diverse toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Bulgaarse Wetenschappelijk Fonds in het kader van contract nr. KΠ-06 H59/3 en door wetenschappelijk project nr. 07/2023 FVM, Trakia University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic-cell counter | EVE, NanoEnTek | ||
| Citric acid | Sigma | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| digital water bath | Memmert | ||
| Eppendorf tubes, 1.5-2 mL | |||
| Ethanol | Sigma | 34852-M | absolute, suitable for HPLC, ≥99.8% |
| Folin–Ciocalteu’s phenol reagent | Sigma | F9252 | |
| freeze dryer | Biobase | ||
| gallic acid | Sigma- | BCBW7577 | monohydrate |
| HCl | Sigma | 258148 | ACS reagent, 37% |
| HNO3 | Sigma | 438073 | ACS reagent, 70% |
| lignin, alkali | Sigma | 370959 | |
| morin | Sigma | PHL82601 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Na2CO3 | Sigma | 223530 | powder, ≥99.5%, ACS reagent |
| NaOH | Sigma | 655104 | reagent grade, 97%, powder |
| orbital shaker | IKA | KS 130 basic | |
| pH-meter | Consort | ||
| phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | RNBH7571 | |
| Quercetin hydrate | Sigma | STBG3815V | |
| statistical software for Excel | Microsoft Corporation | XLSTAT Version 2022.4.5. | |
| Tween 80 | Sigma | P8074 | BioXtra, viscous liquid |
| ultracentrifuge | Hermle | Z 326 K | |
| Ultrapure water system | Adrona | INTEGRITY+ | |
| ultrasound homogenizer | Bandelin Sonopuls | HD 2070 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Hach-Lange | DR 5000 |
References
- Yu, X., et al. Lignin nanoparticles with high phenolic content as efficient antioxidant and sun-blocker for food and cosmetics. ACS Sustainable Chem. Eng. 11 (10), 4082-4092 (2023).
- Boarino, A., Klok, H. -A. Opportunities and challenges for lignin valorization in food packaging, antimicrobial, and agricultural applications. Biomacromolecules. 24 (3), 1065-1077 (2023).
- Aadil, K., Barapatre, A., Jha, H. Synthesis and characterization of Acacia lignin-gelatin film for its possible application in food packaging. Bioresour. Bioprocess. 3 (27), 1-11 (2016).
- Sharma, S., et al. Valorization of lignin into nanoparticles and nanogel: characterization and application. Bioresour. Technol. Reports. 18, 101041 (2022).
- Zadeh, E. M., O'Keefe, S. F., Kim, Y. -T.
- Beaucamp, A., et al. Lignin for energy applications - state of the art, life cycle, technoeconomic analysis and future trends (Critical Review). Green Chem. 24, 8193-8226 (2022).
- Antunes, F., et al. From sugarcane to skin: Lignin as a multifunctional ingredient for cosmetic application. Int J Biol Macromol. 234, 123592 (2023).
- Garg, J., et al. Applications of lignin nanoparticles for cancer drug delivery: An update. Materials Letters. 311, 131573 (2022).
- Anushikha, K. K. Lignin as a UV blocking, antioxidant, and antimicrobial agent for food packaging applications. Biomass Conv. Bioref. , 1-14 (2023).
- Freitas, F. M. C., et al. synthesis of lignin nano- and micro-particles: Physicochemical characterization, bioactive properties and cytotoxicity assessment. Int J Biol Macromol. 163, 1798-1809 (2020).
- Rismawati, R., Nurdin, I. A., Pradiptha, M. N., Maulidiyah, A., Mubarakati, N. J. Preparation and characterization of lignin nanoparticles from rice straw after biosynthesis using Lactobacillus bulgaricus. Journal of Physics: Conference Series. 9th International Seminar on New Paradigm and Innovation of Natural Sciences and its Application. 1524, 012070 (2020).
- Worku, L. A., et al. Synthesis of lignin nanoparticles from Oxytenanthera abyssinica by nanoprecipitation method followed by ultrasonication for the nanocomposite application. Journal of King Saud University - Science. 35 (7), 102793 (2023).
- Gala Morena, A., Tzanov, T. z Antibacterial lignin-based nanoparticles and their use in composite materials. Nanoscale Adv. 4, 4447-4469 (2022).
- Ivanova, D., Nikolova, G., Karamalakova, Y., Marutsova, V., Yaneva, Z. Water-soluble alkali lignin as a natural radical scavenger and anticancer alternative. Int J Mol Sci. 24 (16), 12705 (2023).
- Ivanova, D., Toneva, M., Simeonov, E., Antov, G., Yaneva, Z. Newly synthesized lignin microparticles as bioinspired oral drug-delivery vehicles: Flavonoid-carrier potential and in vitro radical-scavenging activity. Pharmaceutics. 15 (4), 1067 (2023).
- Yaneva, Z., et al. Antimicrobial potential of conjugated lignin/morin/chitosan combinations as a function of system complexity. Antibiotics. 11, 650 (2022).
- Handral, H. K., Wyrobnik, T. A., Lam, A. T. -L. Emerging trends in biodegradable microcarriers for therapeutic applications. Polymers. 15 (6), 1487 (2023).
- Figueiredo, P., Lintinen, K., Hirvonen, J. T., Kostiainen, M. A., Santos, H. A. Properties and chemical modifications of lignin: Towards lignin-based nanomaterials for biomedical applications. Prog. Mater. Sci. 93, 233-269 (2018).
- Tang, Q., et al. Lignin-based nanoparticles: a review on their preparations and applications. Polymers. 12 (11), Basel. 2471 (2020).
- Zhao, W., Simmons, B., Singh, S., Ragauskas, A., Cheng, G. From lignin association to nano-/micro-particle preparation: extracting higher value of lignin. Green Chemistry. 18 (21), 5693-5700 (2016).
- Stewart, H., Golding, M., Matia-Merino, L., Archer, R., Davies, C. Manufacture of lignin microparticles by anti-solvent precipitation: Effect of preparation temperature and presence of sodium dodecyl sulfate. Food Res Int. 66, 93-99 (2014).
- Beisl, S., Friedl, A., Miltner, A. Lignin from micro- to nanosize: Applications. Int. J. Mol. Sci. 18, 2367 (2017).
- Mishra, P. K., Ekielski, A. A simple method to synthesize lignin nanoparticles. Colloids Interfaces. 3, 52 (2019).
- Qian, Y., Deng, Y., Qiu, X., Li, H., Yang, D. Formation of uniform colloidal spheres from lignin, a renewable resource recovered from pulping spent liquor. Green Chem. 16, 2156-2163 (2014).
- Tardy, B. L., et al. Lignin nano- and microparticles as template for nanostructured materials: formation of hollow metal-phenolic capsules. Green Chem. 20, 1335-1344 (2018).
- Silva, M., et al. Paraquat-loaded alginate/chitosan nanoparticles: preparation, characterization and soil sorption studies. J Haz Mat. 190 (1-3), 366-374 (2011).
- Georgieva, N., Yaneva, Z. Comparative evaluation of natural and acid-modified layered mineral materials as rimifon-carriers using UV/VIS, FTIR, and equilibrium sorption study. Cogent Chem. 1 (1), 1-16 (2015).
- Zhang, P., Chen, D., Li, L., Sun, K. Charge reversal nano-systems for tumor therapy. J Nanobiotechnol. 20, 31 (2022).
- Yaneva, Z. L., Georgieva, N. V. Removal of diazo dye from the aqueous phase by biosorption onto ball-milled maize cob (BMMC) biomass of Zea mays. Maced. J. Chem. Chem. Eng. 32 (1), 133-149 (2013).
- Zatorska, M., et al. Drug-loading capacity of polylactide-based micro- and nanoparticles - Experimental and molecular modeling study. Int J Pharmaceutics. 591, 120031 (2020).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Chapter 5 - Physicochemical and morphological characterization of pharmaceutical nanocarriers and mathematical modeling of drug encapsulation/release mass transfer processes. Nanoscale Fabrication, Optimization, Scale-Up and Biological Aspects of Pharmaceutical Nanotechnology. Grumezescu, A. M. , William Andrew Publishing. 173-218 (2018).
- Yaneva, Z., Georgieva, N., Staleva, M. Development of d,l-α-tocopherol acetate/zeolite carrier system: equilibrium study. Monatshefte fur Chemie Chemical Monthly. 147 (7), 1167-1175 (2016).
- Yaneva, Z., Georgieva, N. Study on the physical chemistry, equilibrium, and kinetic mechanism of Azure A biosorption by Zea mays biomass. Journal of Dispersion Science and Technology. 35 (2), 193-204 (2014).
