Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.
Abstract
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Zellstoffwechsels bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die physiologische ROS-Produktion spielt eine zentrale Rolle bei der räumlichen und zeitlichen Modulation normaler zellulärer Funktionen wie Proliferation, Signalübertragung, Apoptose und Seneszenz. Im Gegensatz dazu ist eine chronische ROS-Überproduktion für ein breites Spektrum von Krankheiten verantwortlich, wie unter anderem Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes. Die genaue und reproduzierbare Quantifizierung des ROS-Spiegels ist daher für das Verständnis der normalen zellulären Funktionalität unerlässlich. Fluoreszenzbildgebungsbasierte Methoden zur Charakterisierung intrazellulärer ROS-Spezies sind ein gängiger Ansatz. Viele der bildgebenden ROS-Protokolle in der Literatur verwenden 2'-7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-Farbstoff. Dieser Farbstoff leidet jedoch unter erheblichen Einschränkungen in seiner Verwendung und Interpretierbarkeit. Das aktuelle Protokoll demonstriert die Verwendung einer Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzsonde als alternative Methode zur Quantifizierung der gesamten ROS-Produktion in einer Hochdurchsatzumgebung. Die Hochdurchsatz-Bildgebungsplattform CX7 Cellomics wurde verwendet, um die ROS-Produktion zu messen und zu quantifizieren. Diese Studie wurde an drei hepatozellulären Krebszelllinien durchgeführt - HepG2, JHH4 und HUH-7. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen Verfahren, die an der Bewertung von ROS in den Zellen beteiligt sind, einschließlich - Herstellung der DHE-Lösung, Inkubation der Zellen mit DHE-Lösung und Messung der DHE-Intensität, die zur Charakterisierung der ROS-Produktion erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, dass DHE-Fluoreszenzfarbstoff eine robuste und reproduzierbare Wahl ist, um die intrazelluläre ROS-Produktion im Hochdurchsatz zu charakterisieren. Hochdurchsatzansätze zur Messung der ROS-Produktion sind wahrscheinlich in einer Vielzahl von Studien hilfreich, z. B. in der Toxikologie, beim Wirkstoffscreening und in der Krebsbiologie.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind eine Gruppe natürlich vorkommender, hochreaktiver und zeitlich instabiler chemischer Radikale, die als Teil des normalen Zellstoffwechsels in Zellen gebildet werden. ROS spielt eine wichtige und wesentliche Rolle bei der Modulation normaler physiologischer und biochemischer Prozesse, die in Zellen ablaufen 1,2. Die Hauptquelle der ROS-Produktion in Zellen ist der mitochondriale Elektronentransportkettenweg (ETC) als Teil des normalen bioenergetischen Zyklus. Zu den bedeutenden zusätzlichen Quellen der ROS-Produktion gehören enzymatische Reaktionen wie zelluläre NADPH-Oxidasen in Zellen. Der Stoffwechsel von Nahrungsmolekülen (z. B. Glukose) erfolgt über den oxidativen Phosphorylierungsweg in der mitochondrialen Matrix. Ein Ausgangsniveau der ROS-Produktion ist wichtig, um normale physiologische Zellsignalprozesse zu regulieren. Es ist bekannt, dass viele wichtige Proteinmoleküle, die Teil der metabolischen Glukosesignalwege sind (z. B. Akt und PTEN), auf intrazelluläre ROS-Spiegel reagieren. Darüber hinaus werden ROS von verschiedenen intrazellulären Enzymen wie Xanthinoxidase, Stickstoffmonoxidsynthase und peroxisomalen Bestandteilen als Teil der zellulären enzymatischen Signalwegeproduziert 1,2. Im Gegensatz zu den natürlichen Quellen von ROS führen bestimmte Umweltfaktoren wie Xenobiotika, Infektionserreger, UV-Licht, Umweltverschmutzung, Zigarettenrauchen und Strahlung ebenfalls zu einer übermäßigen Produktion von ROS, die ein Haupttreiber für intrazellulären oxidativen Stress sind 1,3. Erhöhter zellulärer oxidativer Stress kann native Biomoleküle in einer Zelle wie Lipide, Proteine und DNA schädigen und verschiedene Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, chronische Entzündungen und neurodegenerative Erkrankungen verursachen 1,3,4. Daher sind genaue Messungen von ROS unerlässlich, um die zellulären Mechanismen zu verstehen, die an der Pathophysiologie oxidativer Stress-induzierter Krankheiten beteiligt sind.
Aufgrund der kurzen Zeitskalen der ROS-Produktion und -Eliminierung in Zellen bleibt die quantitative Messung verschiedener ROS-Radikale eine Herausforderung. Methoden wie die paramagnetische Elektronenresonanz (EPR)5, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und die auf Fluoreszenzsonden basierende Bildgebung werden verwendet, um die verschiedenen zellulären ROS6 zu messen. Während Methoden wie EPR und HPLC quantitativ genaue Schätzungen liefern, beinhalten diese Methoden die Zerstörung der zellulären räumlichen Morphologie und erfolgen in der Regel in Form von Global- und Massenmessungen einer Probe. Im Gegensatz dazu behalten bildgebende Methoden wie Fluoreszenzsonden-basierte Methoden die zelluläre Morphologie und den räumlichen Kontext der ROS-Generation bei. Die Spezifität verschiedener Fluoreszenzsonden für verschiedene Arten von ROS-Radikalen ist jedoch nicht gut belegt 7,8. Mehrere Fluoreszenzsonden wie Dihydroethidium (DHE), Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), Dihydrorhodamin (DHR), Dimethylanthracen (DMA), 2,7-Dichlordihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) und MitoSox sind für den ROS-Nachweis kommerziell erhältlich. In den letzten Jahrzehnten waren DHE, MitoSox und DCFH-DA die am häufigsten verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zur Messung von ROS in Zellen und Geweben 8,9. DCFH-DA ist ein weit verbreiteter Farbstoff zum Nachweis von intrazellulärem H2O2 und oxidativem Stress. Trotz der Popularität von DCFH-DA haben mehrere frühere Studien gezeigt, dass es nicht zuverlässig zur Messung der intrazellulären H2O2 und anderer ROS-Spiegel verwendet werden kann 8,9,10,11,12,13,14.
Im Gegensatz dazu zeigt die Fluoreszenzsonde Dihydroethidium (DHE) eine spezifische Reaktion auf das intrazelluläre Superoxidradikal (O2-). Während das Superoxidradikal eine von vielen der in Zellen beobachteten ROS-Spezies ist, ist es ein wichtiges Radikal, das unter anderem an der Reduktion von Übergangsmetallen, der Umwandlung in Peroxynitrat und der Bildung von Hydroperoxiden beteiligt ist. DHE wird schnell von den Zellen aufgenommen und hat eine Fluoreszenzemission im roten Wellenlängenbereich15. Bei der spezifischen Reaktion mit Superoxidradikalen bildet DHE ein rot fluoreszierendes Produkt, 2-Hydroxyethidium (2-OH-E+). Daher kann DHE als spezifische Sonde für den Superoxidnachweis betrachtet werden. DHE kann jedoch auch eine unspezifische Oxidation mit ONOO- oder OH, H2O 2 und Cytochrom c durchlaufen, um ein zweites Fluoreszenzprodukt, Ethidium E+, zu bilden, das die gemessenen 2-OH-E+-Spiegel stören kann. Diese 2-OH E+ und E+ Produkte stellen jedoch in Kombination einen großen Teil der gesamten zellulären ROS-Spezies dar, die in einer Zelle beobachtet werden, wenn sie mit DHE gefärbt werden. E+ interkaliert in die DNA und verstärkt deren Fluoreszenz 8,9,10,11,13,14,15,16. Da sich die Fluoreszenzspektren von Ethidium und 2-Hydroxyethidium nur geringfügig unterscheiden, kann der Großteil der ROS-Werte, die in einer Zelle infolge der Superoxidproduktion beobachtet werden, mit DHE-Fluoreszenzprodukten nachgewiesen und gemessen werden. Diese ROS-Spezies werden mit einer Wellenlängenanregung von 480 nm und einer Wellenlängenemission von 610 nm 15,16,17 identifiziert.
Neben der Auswahl einer spezifischen fluoreszierenden ROS-Detektionssonde ist es wichtig, eine empfindliche Nachweismethode zur Messung intrazellulärer ROS zu wählen. Die genaue Beurteilung der intrazellulären ROS-Spiegel ist daher der Schlüssel zur Identifizierung gestörter Redox-Gleichgewichtszustände, die in erkrankten Zellen oder Zellen auftreten, die verschiedenen Umweltstressoren wie Strahlung, toxikologischen Verbindungen und genotoxischen Wirkstoffen ausgesetzt waren18. Da ROS ein häufig auftretendes Phänomen in Zellen ist, das für die Regulierung einer Vielzahl von Zellsignalaktivitäten verantwortlich ist, sind robuste Methoden zum Nachweis von ROS unerlässlich. Um eine solche Hochdurchsatzbewertung der ROS-Produktion innerhalb von Zellen zu ermöglichen, verwendet dieses Protokoll eine High-Content-Screening-Plattform (HCS) zur Messung der ROS-Spezies. Das aktuelle Protokoll ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der intrazellulären ROS-Produktion, die in vielen toxikologischen Studien von entscheidender Bedeutung ist19. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine einfache und vielseitige Lösung zum Nachweis und zur Messung intrazellulärer ROS in adhärenten hepatozellulären Karzinomzellen bereitzustellen. Die chemischen Reagenzien von H2O2 und Menadion werden als potente ROS-Stimulatoren verwendet, um die relativen Niveaus der ROS-Produktion in einer kontrollierten und hohen Durchsatzeinstellung zu messen. Dieses Protokoll kann bei Bedarf fein abgestimmt werden, um die ROS-Produktion in adhärenten und nicht adhärenten Zellen unter geeigneten Bedingungen zu messen.
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Protocol
1. Zellkultur
- Aussaat der Testzellen (hepatozelluläre HepG2-, HUH7- und JHH4-Karzinomzellen) in eine 96-Well-Platte mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen/Well in einem endgültigen Aussaatvolumen von 200 μl pro Well.
- Vor der Kultivierung der HepG2-Zellen beschichten Sie die 96 Plattenvertiefungen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) mit Kollagen Typ IV (50 μg/ml). Um eine Verfestigung des Stammkollagens zu vermeiden, geben Sie die Stammlösung in Eis und leiten Sie anschließend den Verdünnungsprozess auf die gewünschte Konzentration ein.
- Nach einer 2-stündigen Inkubationszeit das überschüssige Kollagen absaugen und die Vertiefungen dreimal mit dem 1x PBS waschen.
- Kultivieren Sie die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 -Konzentration in einem befeuchteten Inkubator.
- Behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag oder bei Erreichen der Konfluenz von 80 % bis 90 %, je nachdem, was früher eintritt, mit H2O2 (unbehandelt, 250 μM, 500 μM, 750 μM und 1000 μM) bzw. Menadion (unbehandelt, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), um den repräsentativen oxidativen Stress zu induzieren.
- Alternativ können Sie die Zellen mit der gewünschten Testsubstanz Ihrer Wahl testen, die oxidativen Stress in den Zellen induzieren kann.
2. Vorbereitung der Stamm- und Verdünnungslösung für die DHE-Färbung von Zellen
- Bereiten Sie DHE-Stammlösung (5 mg/ml oder 15,9 mM) vor, indem Sie 5 mg DHE in 1 ml DMSO auflösen.
- Verdünnen Sie die DHE-Stammlösung mit doppelt destilliertem autoklaviertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 μM.
- Um den Gefrier- und Auftauprozess des Farbstoffs zu vermeiden (der die Fluoreszenzeigenschaften im Laufe der Zeit beeinträchtigen kann), bereiten Sie mehrere Aliquots in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit einer Konzentration von 100 μM vor und lagern Sie sie bei -20 °C.
- Um eine endgültige Arbeitskonzentration von 10 μM zu erreichen, verwenden Sie ein Aliquot der 100 μM DHE-Konzentration und verdünnen Sie es mit vorgewärmten DMEM-Medien.
HINWEIS: Die Arbeitslösung muss am Tag des Versuchs frisch zubereitet werden. - Wirbeln Sie die Arbeitsfluoreszenzfarbstofflösung 5-10 s lang ein, um eine ordnungsgemäße Mischung des Farbstoffs zu gewährleisten.
3. DHE-Färbeprozess
- Entfernen Sie das wirkstoff- oder testsubstanzhaltige Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es einmal vorsichtig mit entweder 1x PBS oder DMEM.
HINWEIS: Bei der Durchführung der Additions- oder Waschschritte im Experiment ist es wichtig, den direkten Kontakt zwischen den Zellen und der Pipette zu vermeiden. Dies kann erreicht werden, indem das PBS vorsichtig an den Seiten der Wells pipettiert wird, um mögliche mechanische Schäden an den Zellen zu minimieren. Wenn Sie sicherstellen, dass die Pipette die Zellen nicht direkt berührt, wird die Integrität und Lebensfähigkeit der Zellen für die Dauer des Experiments erhalten. - Geben Sie 100 μl DMEM-Medien mit 10 μM DHE (Arbeitslösung) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C.
- Entfernen Sie nach 30 Minuten Inkubationszeit das DHE-haltige Medium und waschen Sie jede Vertiefung dreimal vorsichtig mit der 1x phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS). Dies kann mit einer Mehrkanalpipette durchgeführt werden, um einen schnellen Durchlauf zu gewährleisten.
- 200 μl 1x PBS in jede Vertiefung mit Hoechst 33342 Kernfärbefarbstoff für 10 min bei RT geben.
- Entfernen Sie die Hoechst 33342 Kernfärbelösung aus der Vertiefung und geben Sie 200 μl 1x PBS in jede Vertiefung.
HINWEIS: Um fixierte Zellen zu erhalten, befolgen Sie das gleiche Protokoll wie für die lebenden Zellen, mit einem zusätzlichen Schritt der Zugabe von 4% PFA für 5 Minuten nach der Behandlung und DHE-Färbung. Entfernen Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen mit dem 1x PBS. Inkubieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang mit dem Kernfärbefarbstoff. - Bringen Sie die Platte so schnell wie möglich zur High-Content-Screening-Plattform, Fluoreszenzmikroskopie oder zum Plattenleser für die Bildaufnahme.
4. Bildaufnahme und Intensitätsmessung
- Laden von Platten
- Öffnen Sie die Cellomics CX7 High-Content-Screening-Software (HCS) für die Datenerfassung.
- Kalibrieren Sie die Bildgebungsplattform im Voraus sorgfältig gemäß den Spezifikationen des Herstellers mit der spezifischen 96-Well-Platte Ihrer Wahl, um verschwommene oder verschwommene Bilder in den Daten zu vermeiden.
HINWEIS: Multi-Well-Platten verschiedener Anbieter können unterschiedliche Materialeigenschaften aufweisen und die Qualität der endgültigen Bilder beeinflussen. - Speichern Sie nach der Kalibrierung die für die Plattenmarke spezifischen Systemparameter in der Gerätedatenbank und verwenden Sie sie für zukünftige Datenerfassungen wieder.
- Legen Sie die Platte mit den vorbereiteten Proben vorsichtig auf den beheizten Tisch des HCS-Bildgebungssystems. Stellen Sie sicher, dass die Platte sicher positioniert und in der richtigen Ausrichtung für die Bildgebung auf dem Mikroplattenhalter ist (d. h. suchen Sie das mit A1 gekennzeichnete Etikett auf dem Reader-Tisch und drehen Sie dann die Mikroplatte so, dass die Position der Vertiefung A1 mit der Ecke des Aufklebers übereinstimmt).
- Drücken Sie vorsichtig auf die Mikroplatte, um sicherzustellen, dass sie flach auf dem Tisch anliegt. Eine ungleichmäßige Nivellierung der Platte im HCS-System kann zu Fehlern bei der Bildaufnahme führen.
- Nachdem die Platte eingesetzt ist, halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie dann im Dialogfeld Platten laden/entladen in der Software auf Strg-OK .
- Auswählen von Bildgebungsparametern
- Öffnen Sie im HCS-Bildgebungssystem den Target-Aktivierungsmodus in der Cellomics-Bioanwendungsoberfläche und erstellen Sie ein neues Protokoll mit dem Zweikanal-Setup-Protokoll, das mit (a) Kernfärbung und (b) DHE-Fluoreszenzsondendatenerfassung kompatibel ist. Im aktuellen Protokoll wurden die Filter 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS und 386_BGS_RS für (a) die Nuklearfärbung von Hoechst 33342, (b) die gesamte ROS-Produktion bzw. (c) die Erkennung von Superoxidradikalen verwendet. Die Wahl dieser Filter wurde durch die spezifische Überlappung der Emissionseigenschaften der einzelnen Farbstoffe (DAPI und DHE) bestimmt, die als Teil dieses Protokolls verwendet werden.
HINWEIS: Die Namenskonvention von Filtern, z. B. 386-23_BGRFRN_BGRFRN, bezieht sich auf die Anregung der Probe mit 386-nm-Licht mit einer Bandbreite von 23 nm, gefolgt von einem dichroitischen Filter, der blaues (B), grünes (G), rotes (R), dunkelrotes (FR) und nahes Infrarotlicht (N) in bestimmten Wellenlängenbereichen durchlässt, und das 386_BGS_RS bezieht sich auf einen Emissionsfilter, der BGS- und RS-Emissionswellenlängenlicht nach dem dichroitischen Licht durchlässt. - Geben Sie die Objektive für den Bildaufnahmeprozess innerhalb der Softwareprotokollschnittstelle an, z. B. 10-fache oder 20-fache Vergrößerung, falls erforderlich.
- Wählen Sie die geeignete Objektivvergrößerung in Abhängigkeit von der gewünschten Detailgenauigkeit der Bildgebung und den für das Experiment erforderlichen Auflösungen. Die Auflösung jedes Ziels ist jedoch festgelegt. Details mit höherer Auflösung erfordern einen Austausch des Ziels auf der Plattform. Im aktuellen Protokoll wird ein 20x-Objektiv mit 0,45 NA verwendet, das Teil der in diesem Protokoll verwendeten High-Content-Screening-Plattform ist.
HINWEIS: Das 20x-Objektiv stellt einen guten Kompromiss zwischen der Detailgenauigkeit der Bildauflösung und der Erfassungsgeschwindigkeit dar, die erforderlich ist, um ROS-Änderungen im Laufe der Zeit zu erfassen. Objektive mit höherer Vergrößerung können gewählt werden (z. B. 40X), dies führt jedoch zu längeren Aufnahmezeiten. - Legen Sie die Belichtungseinstellungen der Bildaufnahmekamera fest, z. B. die Belichtungszeit, das Kamera-Binning und das Z-Stapel-Intervall, entsprechend den spezifischen Anforderungen des Protokolls.
HINWEIS: Die Belichtungszeit (oft in Millisekunden) variiert je nach Signalstärke und Empfindlichkeit der verwendeten spezifischen Fluorophore. Dies kann sich auch von Experiment zu Experiment leicht unterscheiden, basierend auf der Farbstoffkonzentration und der Färbequalität. Im aktuellen Protokoll sind die Erfassungsparameter wie folgt festgelegt: Ziel % - 35%, Bildaufnahmemodus - 1104 x 1104 (mit 2x2-Binning) und Objektiv 20x, 0,45 NA. Diese Parameter können entsprechend den spezifischen Versuchsbedingungen eingestellt werden.
- Öffnen Sie im HCS-Bildgebungssystem den Target-Aktivierungsmodus in der Cellomics-Bioanwendungsoberfläche und erstellen Sie ein neues Protokoll mit dem Zweikanal-Setup-Protokoll, das mit (a) Kernfärbung und (b) DHE-Fluoreszenzsondendatenerfassung kompatibel ist. Im aktuellen Protokoll wurden die Filter 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS und 386_BGS_RS für (a) die Nuklearfärbung von Hoechst 33342, (b) die gesamte ROS-Produktion bzw. (c) die Erkennung von Superoxidradikalen verwendet. Die Wahl dieser Filter wurde durch die spezifische Überlappung der Emissionseigenschaften der einzelnen Farbstoffe (DAPI und DHE) bestimmt, die als Teil dieses Protokolls verwendet werden.
- Konfigurationsparameter für die Bildgebung
HINWEIS: Sobald die Bildparameter eingestellt sind, kann der Bilderfassungsprozess über die Softwareschnittstelle gestartet werden.- Parameter für die Bildsammlung
- Identifizieren Sie das primäre Tracking-Objekt von Interesse (den Zellkern) mit verschiedenen im Gerät verfügbaren Algorithmen (Optik - Isodaten, fest und Dreieck).
HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Isodata-Methode zur Identifizierung und Kennzeichnung des Primärobjekts verwendet. - Segmentieren Sie das Objekt (falls vorhanden) entweder nach Form oder Intensitätsparameter.
- Überprüfen Sie das primäre Objekt basierend auf den gewünschten Größen-, Form- und Intensitätsparametern, die für jeden Zellentyp eindeutig sind.
- Definieren Sie dann den "Bereich of Interest" (ROI) um dieses primäre Objekt.
HINWEIS: Der ROI ist ein Schlüsselparameter der Datenerfassung, der den Ort definiert, an dem die Intensität des Fluoreszenzfarbstoffs als konsistent und wiederholbar über alle Zelltypen hinweg identifiziert wird. Der ROI definiert die wichtigsten Parameter (z. B. die Intensität des Farbstoffs), die für jedes primäre Tracking-Objekt (d. h. eine Zelle) in verschiedenen Kanälen des Geräts gemessen werden. Der ROI kann in Form eines Kreises oder Rings um den Kern jeder Zelle definiert werden. Die HCS-Software ermittelt automatisch die Intensität des DHE-Fluoreszenzfarbstoffmarkers in Kanal 2 innerhalb der Grenzen des ROI für jede Zelle, die segmentiert und automatisiert analysiert wird. - Stellen Sie einen 20 μm großen Kreis um das Primärobjekt (Kern) ein. Der Abstand von 20 μm wurde in dieser Studie basierend auf den ungefähren Größen der verschiedenen in diesem Protokoll verwendeten Zelllinien (HepG2, JHH-4 und HUH-7) gewählt. Der 20-μm-Ring-ROI um die Zellen erhielt die Fluoreszenzintensität auf konsistente und wiederholbare Weise.
HINWEIS Der Schlüsselparameter bei der Auswahl eines ROI ist die Fähigkeit, die Zellenfläche angemessen abzudecken. Die Größe des kreisförmigen ROI hängt von der Zellengröße ab. Größere Zellen erfordern möglicherweise einen höheren ROI und umgekehrt einen geringeren ROI. Diese Parameter müssen im Voraus für jeden Zelltyp und Fluoreszenzfarbstoff von Interesse bestimmt werden.
- Identifizieren Sie das primäre Tracking-Objekt von Interesse (den Zellkern) mit verschiedenen im Gerät verfügbaren Algorithmen (Optik - Isodaten, fest und Dreieck).
- Parameter für die Bildsammlung
- Charakterisierung der Population und Auswahl der zu speichernden Merkmale
- Sobald die verschiedenen Erfassungsparameter im HCS-Bildgebungsprotokoll definiert sind, versetzen Sie das HCS-System in den Datenerfassungsmodus.
- Die Bildaufnahmeparameter für dieses Protokoll wurden wie folgt festgelegt: ein Scan-Limit von 1000 Zellen/Well, mit einer Mindestanforderung von 10 Objekten (Zellen) pro Feld.
HINWEIS: Die Anzahl der für jedes Well bewerteten Felder wurde basierend auf der endgültigen Zellzahl bestimmt, die die Zahl 1000 erreicht. Das HCS-System durchsucht weiterhin verschiedene Stellen innerhalb des Wells, bis es die Zielpopulation von 1000 Zellen/Well erhält. Die Erfassungsgeschwindigkeit hängt daher von der Konfluenz und der Gesamtzahl der in jedem Well der 96-Well-Platte vorhandenen Zellzahlen ab. Im aktuellen Protokoll wurden die Gesamt- und Durchschnittsintensität von Kanal 2 (der die Superoxidradikale und die gesamte ROS-Produktion darstellt) aus jedem Bohrloch für weitere nachgelagerte Analysen gesammelt.
- Bilderfassung, -verarbeitung und -analyse
- Nachdem Sie die Bildaufnahmeparameter angepasst und abgeschlossen haben, starten Sie den Scanvorgang für jede 96-Well-Platte.
HINWEIS: Das Cellomics CX7-Bildgebungssystem ermöglicht ein High-Content-Screening und eine automatisierte Analyse von Proben mit einer Vielzahl von Parametern, einschließlich der ROS-Produktion innerhalb von Zellen mit hohem Durchsatz. Zusätzlich zur ROS-Produktion ist das HCS-System in der Lage, zusätzliche wertvolle Informationen über verschiedene Parameter wie Zellmorphologie, subzelluläre Lokalisierung und viele andere zelluläre Merkmale von Interesse zu liefern. Einmal für die Erfassung optimiert, ermöglicht die HCS-Bildgebungsplattform eine umfassende, qualitative und quantitative Charakterisierung von Zellparametern auf robuste Weise. - Starten Sie nach Abschluss des Scanvorgangs die View Analysis-Software und exportieren Sie die verschiedenen quantitativen Datenparameter in einem .csv Format für weitere Analysen.
- Kopieren Sie mit Software von Drittanbietern die verschiedenen quantitativen Werte, die für weitere nachgelagerte Analysen von Interesse sind, und fügen Sie sie ein.
HINWEIS: Im aktuellen Protokoll wurde die GraphPad Prism-Software verwendet, um die DHE-Intensitätswerte als Reaktion auf induzierten oxidativen Stress aufgrund von H2O2 - und Menadion-Expositionen zu analysieren.
- Nachdem Sie die Bildaufnahmeparameter angepasst und abgeschlossen haben, starten Sie den Scanvorgang für jede 96-Well-Platte.
- Daten und statistische Analysen
- Berechnen Sie die mittlere durchschnittliche Intensität von Kanal 2 (die die gesamten ROS-Werte und Superoxidradikale darstellt).
HINWEIS: Alle Experimente zur Berechnung der Intensitätswerte wurden dreimal mit 6 Wiederholungen pro Bedingung bei jeder Dosierungsstufe wiederholt. - Führen Sie eine Einweg-ANOVA oder einen t-Test durch, um die Unterschiede in den Intensitätswerten zwischen verschiedenen Testbedingungen zu messen.
- Berechnen Sie die mittlere durchschnittliche Intensität von Kanal 2 (die die gesamten ROS-Werte und Superoxidradikale darstellt).
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Representative Results
Dihydroethidium (DHE) ist ein auf Superoxid reagierender Fluoreszenzfarbstoff, der spezifische Informationen über die intrazellulären ROS-Zustände liefert. DHE-Farbstoff emittiert intrinsisch blaue Fluoreszenz im Zytoplasma. Bei Wechselwirkung mit Superoxidradikalen wird es jedoch in 2-Hydroxyethidium umgewandelt, das Fluoreszenz in den roten Wellenlängen (>550 nm) emittiert (Abbildung 1). DHE-Farbstoff wird leicht in die Zellen und den Zellkern transportiert. Die emittierte Fluoreszenz kann mit einem Fluoreszenzmikroskopie-Setup visualisiert werden, das in vielen Labors üblich ist. In der aktuellen Studie wurde der Nutzen des DHE-Farbstoffs auf mehreren hepatozellulären Karzinomzelllinien - HUH7-, JHH4- und HepG2-Zellen - als Sonde für die Erzeugung von ROS-Spezies auf einer High-Content-Screening-Plattform getestet. Die Zellen wurden 30 Minuten lang dosisabhängig mit zwei ROS-erzeugenden Wirkstoffen behandelt - (a) Wasserstoffperoxid und (b) Menadion (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3 für Dosierungsdetails), um oxidativen Stress in den Zellen zu induzieren, gefolgt von einer DHE-Farbstoffmarkierung in einer 96-Well-Platte. Sowohl H2O2 als auch Menadion erhöhten die Fluoreszenzintensität in allen drei Zelllinien dosisabhängig dramatisch. Unter Verwendung der Bildsegmentierungs- und Quantifizierungsalgorithmen innerhalb der Hochdurchsatz-Screening-Plattform wurde die Intensität der ROS-induzierten DHE-Fluoreszenz in 1000 Zellen pro Well über sechs Replikate quantifiziert. Drei unabhängige Replikate wurden gemessen, und die Ergebnisse wurden aggregiert und analysiert. Die Kernfärbung von Hoechst 33342 spielt eine wichtige Rolle bei der Identifizierung der Ebene, in der die adhärenten Zellen in jedem Well vorhanden sind. Darüber hinaus kann die 2-OH-E+ - und E+ -Fluoreszenz sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma der getesteten Zellen auf der Hochdurchsatz-Screening-Plattform nachgewiesen werden (siehe Abbildung 4).
Die Exposition gegenüber H2O2 führte zu einem statistisch signifikanten Zuwachs der ROS-induzierten Fluoreszenz über alle dosisabhängig analysierten Zelllinien (siehe Abbildung 2; unteres Bild). Eine solche dosisabhängige Reaktion wurde jedoch bei Menadion-Expositionen nicht beobachtet. Bei Menadion zeigte die JHH4-Zelllinie einen dosisabhängigen Anstieg der Fluoreszenzintensität, während bei HepG2- und HUH7-Zelllinien nur bei den höheren Menadionkonzentrationen ein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenzintensität beobachtet wurde (siehe Abbildung 3; unteres Bild). Diese Unterschiede in den Reaktionen der ROS-Erzeugung könnten auf die unterschiedlichen Mechanismen der ROS-Produktion von H2O2 und Menadion zurückzuführen sein. Während H2O2 die ROS-Bildung in Zellen auf direktere Weise auslöst (z. B. durch die Wirkung von antioxidativen Enzymen wie Peroxidasen und Katalasen), wird angenommen, dass Menadion ROS-Spezies indirekt durch induzierte mitochondriale Dysfunktion erzeugt. Aufgrund des indirekten Mechanismus der ROS-Produktion kann die DHE-Fluoreszenz mehr Zeit benötigen, um sich mit Menadion zu manifestieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ROS-abhängige DHE-Fluoreszenz empfindlich auf die Dauer der Exposition gegenüber oxidativem Stress, die Konzentration und die Zelltypen reagiert. Die Optimierung des Versuchsprotokolls für jeden einzelnen Zelltyp ist daher ein Muss. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll die Machbarkeit der Verwendung von DHE-Farbstoff als ROS-Nachweismittel im Hochdurchsatz demonstriert, was in Bereichen wie Toxikologie, Krebsbiologie und Arzneimittelscreening von Nutzen ist.
Abbildung 1: Ein Schema, das die Wege der oxidativen Umwandlung des DHE-Fluoreszenzmoleküls in 2-Hydroxyethidium (2-OH-E+) bzw. Ethidium (E+) veranschaulicht. Die Fluoreszenzemissionsspektren von 2-OH-E+ und E+ überlappen sich bei einer Anregung von 480 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Behandlung mit Wasserstoffperoxid erhöht die intrazellulären ROS-Spiegel dosisabhängig. Hepatozelluläre Karzinomzellen - (A) HUH7, (B) JHH4 und (C) HepG2 wurden mit H2O2 in Dosen von 250 μM, 500 μM, 750 μM und 1000 μM für einen Zeitraum von 30 Minuten behandelt. Die Zellen wurden weitere 30 Minuten lang mit DHE-Farbstoff (10 μM) in Kulturmedien gefärbt, gefolgt von einer Kernfärbung mit Hoechst 33342. In jeder Vertiefung wurden insgesamt 1000 Zellen gezählt. Ein linearer, dosisabhängiger Anstieg der DHE-Fluoreszenz wird über alle drei Zelllinien beobachtet (oberes Bild). Statistisch signifikante Erhöhungen der Fluoreszenz werden in allen Zelllinien für die Dosierung von 500 μM und mehr beobachtet (unteres Bild). Jeder Datensatz besteht aus durchschnittlich sechs Replikaten in einer 96-Well-Platte, die aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3) gewonnen wurden. Die Behandlungsbedingungen wurden mit unbehandelten Proben unter Verwendung eines Einweg-ANOVA-Tests verglichen (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; Bildmaßstab - 50 μm) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Behandlung mit Menadion erhöht die intrazellulären ROS-Spiegel dosisabhängig. Hepatozelluläre Karzinomzellen - (A) HUH7, (B) JHH4 und (C) HepG2 wurden mit Menadion in Dosen von 25 μM, 50 μM, 75 μM und 100 μM für einen Zeitraum von 30 Minuten behandelt. Die Zellen wurden weitere 30 Minuten lang mit DHE-Farbstoff (10 μM) in Kulturmedien gefärbt, gefolgt von einer Kernfärbung mit Hoechst 33342. In jeder Vertiefung wurden insgesamt 1000 Zellen gezählt. Ein linearer, dosisabhängiger Anstieg der DHE-Fluoreszenz wird über alle drei Zelllinien beobachtet (oberes Bild). Statistisch signifikante Erhöhungen der Fluoreszenz werden konsistent für die maximale Dosis (100 μM; unteres Bild) beobachtet. Die Variabilität wird für die verbleibenden Menadiondosen über verschiedene Zelllinien hinweg beobachtet (JHH4 > HUH7 > HepG2). Jeder Datensatz besteht aus durchschnittlich sechs Replikaten in einer 96-Well-Platte, die aus drei unabhängigen Experimenten (n = 3) gewonnen wurden. Die Behandlungsbedingungen wurden mit unbehandelten Proben unter Verwendung eines Einweg-ANOVA-Tests verglichen (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; Bildmaßstab - 50 μm) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Einzelzell-DHE-Fluoreszenz - Eine Nahaufnahme der DHE-Fluoreszenzänderungen, die nach der Behandlung mit (A) Wasserstoffperoxid und (B) Menadion für eine Dauer von 30 Minuten beobachtet wurden. Zytoplasmatische und nukleäre Veränderungen der DHE-Fluoreszenz werden in den verschiedenen Zellen beobachtet. Die automatische Segmentierungsmaske, die von der High-Content-Screening-Plattform generiert wird, ist ebenfalls zu sehen. Bildmaßstabsbalken - 10 μm. Vergrößerung - 20x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Abbildung der Superoxid-getriebenen DHE-Fluoreszenz als Reaktion auf Wasserstoffperoxid. Hepatozelluläre Karzinomzellen - (A) HUH7, (B) JHH4 und (C) HepG2 wurden mit H2O2 in Dosen von 250 μM, 500 μM, 750 μM und 1000 μM für einen Zeitraum von 30 Minuten behandelt. Die Zellen wurden dann weitere 30 Minuten lang mit DHE-Farbstoff (10 μM) in Kulturmedien gefärbt. Anschließend wurden die Zellen mit 386 nm LED beleuchtet und die Fluoreszenzbildgebung bei >560 nm gesammelt. Es wurde keine nukleare Gegenfärbung durchgeführt, um spektrales Übersprechen zu vermeiden. Bei Dosen > 500 μM wird ein dosisabhängiger Anstieg der DHE-Fluoreszenz beobachtet. Es wird erwartet, dass die UV-beleuchtete DHE-Fluoreszenz auf den Großteil der Produktion von Superoxidradikalen zurückzuführen ist. Jeder Datensatz besteht aus durchschnittlich sechs Replikaten in einer 96-Well-Platte, die aus zwei unabhängigen Experimenten gewonnen wurden (n = 2). Die Behandlungsbedingungen wurden mit unbehandelten Proben unter Verwendung einer Einweg-ANOVA verglichen (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; Bildskala - 50 μm) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Abbildung der Superoxid-getriebenen DHE-Fluoreszenz als Reaktion auf Menadion - Hepatozelluläre Karzinomzellen - (A) HUH7, (B) JHH4 und (C) HepG2 wurden mit Menadion in Dosen von 25 μM, 50 μM, 75 μM und 100 μM für einen Zeitraum von 30 Minuten behandelt. Die Zellen wurden dann weitere 30 Minuten lang mit DHE-Farbstoff (10 μM) in Kulturmedien gefärbt. Ähnlich wie bei Wasserstoffperoxid wurde ein dosisabhängiger Anstieg der DHE-Fluoreszenz beobachtet. Jeder Datensatz besteht aus durchschnittlich sechs Replikaten in einer 96-Well-Platte, die aus zwei unabhängigen Experimenten gewonnen wurden (n = 2). Die Behandlungsbedingungen wurden mit unbehandelten Proben unter Verwendung einer Einweg-ANOVA verglichen (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001; Bildmaßstab - 50 μm) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Studie wurde ein Protokoll zur Bewertung der superoxidgesteuerten intrazellulären Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff auf einem High-Content-Screening-System erstellt. Ein Großteil der derzeit in der Literatur verfügbaren Protokolle verwendet die DCFH-DA als Fluoreszenz-Bildgebungssonde zur Quantifizierung von ROS-Spezies. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass die DCFH-DA keine ideale Sonde für die Messung intrazellulärer ROS ist. Verschiedene Gründe für die Ungeeignetheit von DCFH-DA als Sonde sind: (i) DCFH-DA zeigt keine direkte Reaktion mit H2O2, was es zu einem ungeeigneten Farbstoff für die Bewertung des intrazellulären H2O2 -Spiegels macht. (ii) Mehrere Ein-Elektronen-oxidierende Spezies, wie OH., NO2. und ONOO-, oxidieren DCFH zu DCF. (iii) Übergangsmetalle, Cytochrom C und Hämperoxidase können die DCFH-Oxidation in Gegenwart von Sauerstoff und H2O2 fördern. (iv) Am wichtigsten ist, dass DCFH-DA das Zwischenprodukt DCFH.- / DCF. erzeugt, das in Gegenwart von Sauerstoff die Produktion von zusätzlichem Superoxid induziert. Die Dismutation mit O2.- erzeugt zusätzliches H2O2, was zu einer künstlichen Erhöhung der Fluoreszenzintensität und fälschlicherweise erhöhten ROS-Werten führen kann. Mehrere Autoren haben die Verwendung von DCFH-DA als unzuverlässige Fluoreszenzsonde für den Nachweis von intrazellulärem H2O2 und anderen ROS-Spezies 8,9,10,11,12,13,14 angesehen.
Im Gegensatz zu DCFH-DA reagiert DHE spezifisch mit dem Superoxidradikal, was zur Bildung eines fluoreszierenden Produkts, 2-Hydroxyethidium (2-OH E+), führt. Nicht-Superoxid-ROS-Spezies können auch mit DHE reagieren, um ein zweites fluoreszierendes Produkt, Ethidium (E+), zu erzeugen. Während die Fluoreszenzspektren von 2-OH-E+ und E+ relativ ähnlich sind, stellen diese beiden Moleküle die Endprodukte der spezifischen Wechselwirkungen zwischen den intrazellulären ROS-Spezies und DHE dar und sind für die gesamte Fluoreszenzintensität verantwortlich, die in den Zellen aufgrund von oxidativem Stress beobachtet wird. Einige Studien haben gezeigt, dass die selektive Anregung bei Wellenlängen im kürzeren UV-Bereich (<400 nm) spezifischer für die 2-OH-Ethidium-Anregung (im Gegensatz zu E+) und damit für die Produktion von Superoxidradikalen sein kann 7,12,14. Dies wurde bewertet, indem die Zellen allein mit 386 nm LED-Licht angeregt wurden. Relativ zur Anregung bei 480 nm Wellenlänge wurde eine reduzierte Emissionsintensität bei 560 nm Wellenlänge beobachtet (siehe Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Abbildung 2). Man kann jedoch nicht sicher sein, dass dies allein auf die 2-OH-Ethidium-Fluoreszenz zurückzuführen ist und ein potenzielles Manko des derzeitigen Ansatzes darstellt. Andere Studien haben gezeigt, dass UV-Anregung (z. B. 386 nm) auch zu einer gleichzeitigen Ethidiumfluoreszenzemission führen kann, wenn auch in geringerem Maße als bei 2-OH-Ethidium 7,15. Unabhängig davon etabliert unser Protokoll DHE als bessere Farbstoffalternative, um die quantitativen Unterschiede des Großteils der intrazellulären ROS-Produktion mit einem High-Content-Bildgebungs- und Screening-System zu messen.
Das Fehlen von Zwischentreibern der ROS-Erzeugung (wie sie bei DCFH-DA zu sehen sind) wird als großer Vorteil bei der Verwendung von DHE zur Bewertung der intrazellulären ROS-Produktion postuliert. Dieser Mechanismus der DHE-Fluoreszenz ist jedoch noch nicht fest etabliert. In Fällen, in denen eine genaue Quantifizierung der ROS-Spiegel erforderlich ist, wird empfohlen, zusätzliche orthogonale Methoden der quantitativen Validierung wie HPLC und/oder Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zu verwenden, um die Konzentrationen von 2-OH-E+ in den Zellen genau abzuschätzen 8,9,13. Man muss sich jedoch bewusst sein, dass HPLC- und LC-MS-Methoden notwendigerweise eine Aggregation und Solubilisierung der Zellen für die Bewertung beinhalten. Somit würden die räumlich-zeitlichen Informationen, die in einem fluoreszenzbasierten Bildgebungsverfahren wie im aktuellen Protokoll kodiert sind, in der HPLC und LC-MS verloren gehen und stellen einen großen Vorteil von bildgebenden ROS-Bewertungsmethoden dar. Ein zusätzlicher Vorteil der rotverschobenen Fluoreszenz von DHE ist, dass das Licht mit längerer Wellenlänge (in rot) aufgrund der geringeren Energie, die von rotem Licht getragen wird, weniger toxisch für Zellen ist.
Die dosisabhängige Natur der DHE-Fluoreszenz zur Messung der relativen intrazellulären ROS-Veränderungen wurde mit Menadion und Wasserstoffperoxid als oxidative Stressinduktoren getestet. Menadion und Wasserstoffperoxid wurden aufgrund der variablen Mechanismen von ROS und oxidativem Stress als Testsubstanzen ausgewählt20,21. Während die ROS-Produktion aufgrund der Menadion-Exposition indirekt ist (durch mitochondriale Dysfunktion), erzeugt H2O2 oxidativen Stress auf direktere Weise. Steigende Menadionkonzentrationen führten zu einer linearen, wiederholbaren und dosisabhängigen DHE-Fluoreszenzproduktion. Ähnlich wie Menadion ist H2O2 ein bekannter Induktor von ROS, der in der Lage ist, Hydroxylradikale (OH) durch Fenton-Chemie auf direkte Weise zu erzeugen22. Eine lineare und dosisabhängige Reaktion wurde in ähnlicher Weise bei der DHE-Fluoreszenz aufgrund der H2O2-Exposition beobachtet. Aufgrund der Selektivität von DHE speziell für das Superoxidradikal reagiert es nicht direkt mit dem H2O2. Stattdessen reagieren die erzeugten intrazellulären Superoxidradikale zunächst mit H2O2 zu sekundären ROS-Spezies, wie Hydroxyradikalen über die Haber-Weiss- und Fenton-Reaktionen, die dann durch DHE-Fluoreszenz23 nachgewiesen werden. Das Fluoreszenzemissionsspektrum von DHE als Reaktion auf zwei verschiedene oxidierende Substanzen durch Messung des Großteils der intrazellulären ROS-Produktion ist im aktuellen Protokoll 8,13 festgelegt. Diese Ergebnisse belegen den Nutzen des fluoreszierenden DHE-Farbstoffs als bessere Alternative für den Nachweis und die Quantifizierung intrazellulärer ROS-Spiegel unter Verwendung von Hochdurchsatz-Screening-Ansätzen.
Die überlegene Selektivität, Empfindlichkeit und optischen Eigenschaften von DHE machen es zu einer wertvollen Alternative für die Untersuchung der ROS-Produktion und oxidativer Schäden im Hochdurchsatz, wie es im aktuellen Protokoll festgelegt ist. Zukünftige Studien in unserem Labor werden die Rolle von DHE als ROS-Marker bei der Kreuzreaktivität zwischen ROS und zellulären Signalmechanismen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen in einer Hochdurchsatzumgebung untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Acknowledgments
RK und RRG wurden durch einen Zuschuss des UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) durch den NIH NIGMS-Zuschuss P20 GM130422 unterstützt. RRG wurde durch einen Pilotpreis aus dem NM-INSPIRES P30-Stipendium 1P30ES032755 unterstützt. Die Unterstützung des Bildgebungskerns für das CX7 Cellomics-Instrument wurde durch die AIM-Center-Kerne bereitgestellt, die durch NIH-Zuschüsse P20GM121176 finanziert wurden. Wir danken Dr. Sharina Desai und Dr. Li Chen für ihre unschätzbare Unterstützung bei technischen Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung der CX7 Cellomics-Bildgebungsplattform.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
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