Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66279
Automatic Translation
*1, *2,3, 1, 2,3, 2,4, 1, 2
1Department Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University, 2Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University, 3Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University, 4Department of Physics and Astronomy, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים שיטה לחקור כיצד pH מגיב לרמזים סביבתיים בגליקוזיומים של צורת זרם הדם של טריפנוזומים אפריקאים. גישה זו כוללת חיישן חלבון תורשתי רגיש ל- pH בשילוב עם ציטומטריית זרימה למדידת דינמיקת pH, הן כבדיקת מסלול זמן והן בפורמט מסך בתפוקה גבוהה.

Abstract

מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי עבור טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei, כתהליך מטבולי חיוני ומווסת של התפתחות טפילים. מעט ידוע על התגובות התאיות שנוצרות כאשר רמות הגלוקוז בסביבה משתנות. הן בטפילים של זרם הדם והן בצורה פרוציקלית (שלב החרקים), גליקוזים מאכלסים את רוב הגליקוליזה. אברונים אלה חומציים במהירות בתגובה למחסור בגלוקוז, מה שככל הנראה גורם לוויסות אלוסטרי של אנזימים גליקוליטיים כגון הקסוקינז. בעבודה קודמת, לוקליזציה של הגשושית הכימית המשמשת לביצוע מדידות pH הייתה מאתגרת, והגבילה את התועלת שלה ביישומים אחרים.

מאמר זה מתאר את התפתחותם והשימוש בטפילים המבטאים pHluorin2 מקומי גליקוסומלי, חלבון תורשתי pH biosensor. pHluorin2 הוא וריאנט pHluorin יחסימטרי המציג ירידה תלוית pH (חומצה) בעירור ב 395 ננומטר ובו זמנית מניב עלייה בעירור ב 475 ננומטר. טפילים טרנסגניים נוצרו על ידי שיבוט מסגרת הקריאה הפתוחה pHluorin2 לתוך וקטור ביטוי טריפנוזום pLEW100v5, המאפשר ביטוי חלבון מושרה בכל אחד משלבי מחזור החיים. Immunofluorescence שימש כדי לאשר את הלוקליזציה הגליקוזומלית של biosensor pHluorin2, השוואת לוקליזציה של biosensor לחלבון תושב glycosomal aldolase. תגובתיות החיישן כוילה ברמות pH שונות על ידי דגירה של תאים בסדרה של מאגרים שנעו ב-pH בין 4 ל-8, גישה בה השתמשנו בעבר כדי לכייל חיישן pH מבוסס פלואורסצאין. לאחר מכן מדדנו פלואורסצנטיות pHluorin2 ב-405 ננומטר וב-488 ננומטר באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע pH גליקזומלי. תיקפנו את הביצועים של הטפילים החיים המבטאים pHluorin2 מהונדס, תוך ניטור pH לאורך זמן בתגובה למחסור בגלוקוז, גורם ידוע להחמצה גליקוזומלית בטפילי PF. לכלי זה יש מגוון יישומים פוטנציאליים, כולל שימוש פוטנציאלי בסינון תרופות בתפוקה גבוהה. מעבר ל-pH גליקזומלי, ניתן להתאים את החיישן לאברונים אחרים או להשתמש בו בטריפנוזומטים אחרים כדי להבין את דינמיקת ה-pH בסביבת התא החי.

Introduction

קינטופלסטים טפיליים, כמו רוב האורגניזמים החיים, מסתמכים על גלוקוז כמרכיב בסיסי במטבוליזם המרכזי של פחמן. קבוצה זו כוללת אורגניזמים חשובים מבחינה רפואית, כגון טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei; הטריפנוזום האמריקאי, T. cruzi; וטפילים מהסוג לישמניה. מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי לצמיחת הטפילים בשלבי מחזור החיים הפתוגניים. לדוגמה, כאשר נמנע גלוקוז, צורת זרם הדם (BSF) של טריפנוזום אפריקאי מת במהירות. יש לציין כי גליקוליזה משמשת כמקור היחיד ל-ATP בשלב זה של זיהום1. טפילי לישמניה תלויים גם הם בגלוקוז בפונדקאי האנושי, כאשר שלב מחזור החיים של האמסטיגוט השוכן במקרופאגים של הפונדקאי מסתמך על מקור פחמן זה לגדילה2.

בעוד שלטפילים אלה יש אורח חיים שונה הכולל וקטורים שונים של חרקים, הם חולקים מאפיינים משותפים רבים באופן שבו הם מגיבים לגלוקוז וצורכים אותו. לדוגמה, טפילים אלה ממקמים את רוב האנזימים הגליקוליטיים לפרוקסיזומים מהונדסים הנקראים גליקוזימים. אברון קינטופלסטידים ספציפי זה קשור לפרוקסיזומים של יונקים בהתבסס על מנגנונים ביוסינתטיים שמורים ומורפולוגיה 3,4,5,6.

המידור של רוב אנזימי המסלול הגליקוליטי לתוך הגליקוזום מציע אמצעים ספציפיים לטפיל לוויסות המסלול. באמצעות בדיקת pH כימית, קבענו כי מחסור בחומרים מזינים מעורר החמצה מהירה של גליקוזימים של טפיל צורה פרוציקלית (PF), הגורמת לשינוי בפעילות האנזים הגליקוליטי באמצעות חשיפה של אתר קושר מווסת אלוסטרי על האנזים הגליקוליטי העיקרי הקסוקינאז 7,8. בעבודתנו הקודמת, הגשושית הכימית דרשה אספקה מתמדת לשימוש, מה שהגביל את התועלת שלה ביישומים אחרים. בנוסף, אתגרים בשמירה על התפלגות הגשושית בגליקוזום ב- BSF הגבילו את התועלת של הגישה לחקר pH גליקוזומלי בשלב חיים זה.

במחקר הזה השתמשנו בחלבון הפלואורסצנטי pHluorin2 כדי לעקוב אחר שינוי ב-pH גליקוזומלי ב-BSF T. brucei בתגובה לרמזים סביבתיים, כולל רעב גלוקוז9 (איור 1). תוצאות עבודה זו מצביעות על כך ש- BSF T. brucei חומצי גליקוזימים במהירות בתגובה לרעב באופן הפיך, בדומה לתגובות שראינו בטפילי PF. אנו מצפים שחיישן ביולוגי זה ישפר את הבנתנו את הוויסות הגליקוליטי ב - T. brucei ובטפילים קשורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שימוש ב- T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomes, קו טפיל מונומורפי, דורש התחשבות בבטיחות מכיוון שהם נחשבים לאורגניזמים מקבוצת סיכון 2 שיש לטפל בהם במתקני בטיחות ביולוגית ברמה 2.

1. תרבות טריפנוזום וטרנספקציה

  1. תרבית T. brucei brucei 90-13 BSF טריפנוזומים במדיום HMI-9 בתוספת 10% FBS מומת חום ו-10% Nu-Serum ב-37°C ב-5% CO210.
    הערה: כדי לשמור על תרבית בריאה, לשמור על צפיפות התאים בין 2 × 104 ו 5 × 106 תאים / מ"ל.
  2. שיבוט pHluorin2-PTS1 לתוך pLEW100v5
    1. סנתז את מסגרת הקריאה הפתוחה pHluorin2 באופן מסחרי כדי להניב את הגן עם סיומת 3' המקודדת מקשר שני גליצין ואחריו טריפפטיד AKL, תג לוקליזציה PTS1.
    2. שכפל מבנה זה לווקטור ביטוי טריפנוזום המושרה pLEW100v5 על ידי תקציר הגבלה. עיכול כפול הן של וקטור השיבוט המכיל pHluorin2-PTS1 והן של pLEW100v5 באמצעות HindIII ו-BamHI11. בצע שלב ניקוי, רצוי על ידי טיהור ג'ל אגרוז, כדי להסיר אנזימי הגבלה, את עמוד השדרה של וקטור השיבוט הבלתי רצוי, ואת המקטע המכיל את הגן luciferase נכרת.
    3. חברו את ה-pHluorin2-bearing לתוך pLEW100v5 מעוכל עם T4 DNA Ligase12. (ראו איור משלים S1 לסכימה לשכפול).
  3. רצף את הפלסמיד על ידי ריצוף פלסמיד שלם מהדור הבא כדי לוודא שהאינסרט והווקטור קשורים כראוי ושלא מוחדרות מוטציות בגן pHluorin2-PTS1 במהלך תהליך השיבוט.
    הערה: רצף הפלסמיד המלא נשלח ל- Addgene.org והוקצה לו #83680.
  4. ליניאריזציה 20 מיקרוגרם של פלסמיד על ידי עיכול עם 40 יחידות של NotI; לאחר מכן, הדבק לתוך טפילים BSF 90-13 באמצעות nucleofection באמצעות ערכת תאי T אנושיים הפניה (ראה טבלה של חומרים). בחר עבור אינטגרציה יציבה כמתואר על ידי Burkard et al.13.

2. אימונופלואורסנציה קולוקליזציה של pHlourin2-PTS1

  1. הכן שקופיות מיקרוסקופיה על ידי טיפול בהם עם פולי-L-ליזין 0.1% (w/v) ב H2O במשך 10 דקות. לאחר הסרת תמיסת פולי-L-ליזין, לשטוף את המגלשה פעם אחת עם PBS.
  2. כדי לגרום לביטוי pHluorin2-PTS1, יש לטפל בתאים ב-2 × 105 תאים/מ"ל עם טטרציקלין או דוקסיציקלין (1 מיקרוגרם/מ"ל) 24 שעות לפני הקציר. גלולה 2 × 106 טפילי pLEWpHluorin2-PTS1 (pHL) הוריים ומושרים על ידי צנטריפוגה (טמפרטורת החדר [RT], 10 דקות, 1,000 × גרם) ולשטוף פעם אחת עם PBS.
  3. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של 2% paraformaldehyde טרי מוכן ב PBS עשוי 16% מסופק מסחרית תמיסה כיתה EM. החל את התאים בקיבוע על השקופית ואפשר לתאים להסתפק במשך 30 דקות. שטפו את התאים המודבקים 2x בתמיסת שטיפה (0.1% סרום עיזים רגיל ב-PBS).
  4. יש למרוח את תמיסת החדירה (0.5% Triton X-100 ב-PBS) על התאים ולדגור במשך 30 דקות בדיוק. הסר את תמיסת החדירה ושטוף פעם אחת עם כמויות גדולות של תמיסת כביסה.
  5. יש למרוח את תמיסת הבלוק (10% סרום עיזים רגיל ו-0.1% טריטון X-100 ב-PBS) ולדגור במשך 30 דקות.
  6. מדללים את האנטיסרה המועלית כנגד T. brucei aldolase 1:500 בתמיסת בלוקים ומורחים אותה על התאים14. לדגור במשך שעה אחת ב- RT. שטפו את המגלשות במשך 5x למשך 3-5 דקות דקות עם תמיסת שטיפה.
  7. לדלל עז נגד ארנב Alexa fluor 568 1:1,000 בתמיסת בלוק ולמרוח על התאים. יש לדגור במשך שעה אחת ב-RT. שטפו את המגלשות במשך 5 פעמים למשך 3-5 דקות עם תמיסת שטיפה.
  8. יש למרוח אמצעי הרכבה ולאטום את הכיסוי על המגלשה.
  9. צלם את התאים עם מטרה של 100x (NA 1.4-0.7) ונתח את התמונות באמצעות ImageJ. בצע ניתוח לוקליזציה של פירסון באמצעות תוסף 'Coloc 2' עבור ImageJ. ראו איור משלים S2 עבור שדה של תאים מייצגים. )
    1. כדי להשלים זאת, הוסף את קובץ התמונה לפיג'י ובחר תמונות.
    2. התאימו את הבהירות והניגודיות לכל ערוץ לנקודה שבה לא נראה רקע.
    3. שנה תמונות מ- 16 סיביות ל- 8 סיביות, מזג את התמונות ולאחר מכן חתוך לתא בודד עם ערוצים מפוצלים.
    4. תחת ניתוח וקולוקליזציה, בחר את תוסף Coloc2. בחר aldolase ( הערוץ האדום) כערוץ 1 ו - pHL ( הערוץ הירוק) כערוץ 2 ולחץ על אישור כדי להתחיל בחישוב המתאם של פירסון.

3. הכנת דגימה לציטומטריית זרימה

  1. השראת תאי pHL עם טטרציקלין או דוקסיציקלין (1 מיקרוגרם/מ"ל) למשך הלילה.
  2. גלול את התאים (~ 4 × 107 pHL ו ~ 1 × 106 הורה) על ידי צנטריפוגה (RT, 10 דקות, 1,000 × גרם). הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של PBS או עם או בלי גלוקוז 10 mM, תלוי אם הדגימה מורעבת או לא מורעבת. למבחני זמן, יש להשהות מחדש ב-PBS בתוספת גלוקוז של 10 מילימטר כדי למנוע מהתאים לגווע ברעב עד לסיום השטיפה. עבור בדיקת מסך בתפוקה גבוהה (HTS), השהה מחדש ב- PBS ללא גלוקוז כדי למזער את העברת הגלוקוז; חזרו על הכביסה פעמיים נוספות.
  3. צנטריפוגו את התאים בפעם הרביעית, הסירו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את כדורית התא ב-PBS, PBS בתוספת 5 מילימטר גלוקוז, או PBS בתוספת 10 מילימטר גלוקוז בהתאם לטיפול. השלימו את הדגימות עם 1 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד (PI) או 100 ננומטר תיאזול אדום (TR) לקביעת חיים/מתים. העבר כל דגימה לצינורות 5 מ"ל התואמים לציטומטר הזרימה.

4. ציטומטריית זרימה

הערה: הכן את הניסוי על ציטומטר זרימה המכיל את הלייזרים הבאים: 405 ננומטר (סגול), 488 ננומטר (כחול) ו- 561 ננומטר (צהוב) או 638 ננומטר (אדום). ראה טבלה משלימה S1 לקבלת שמות נפוצים עבור ערוצים הנדונים להלן.

  1. כדי למדוד פלואורסצנטיות pHL, השתמש בתעלות KO525 (VL2-H, עירור 405 ננומטר, פליטה 542/27 ננומטר) ו- FITC (BL1-H, עירור 488 ננומטר, פליטה 530/30 ננומטר). כדי להבדיל בין תאים חיים לתאים מתים, השתמש ב-PI או ב-TR; למדוד PI על ערוץ YL2-H (עירור 561 ננומטר, פליטה 620/25 ננומטר). מדוד TR בערוץ RL1-H (עירור 638 ננומטר, 660/10 BP).
    1. כדי להגדיר את הניסוי בתוכנת ציטומטר הזרימה, צור את החלקות הבאות: 1) היסטוגרמה של ערוץ YL2-H (אם משתמשים ב-PI) או היסטוגרמה של ערוץ RL1-H (אם משתמשים ב-TR), 2) FSC-A לעומת SSC-A dot plot, 3) FSC-A לעומת FSC-H dot plot, ו-4) BL1-H לעומת VL2-H channel dot plot.
    2. הנח תחילה את פקד WT (קו תא הורי) לא מוכתם על יציאת הזרקת הדגימה (SIP) והרם את הבמה למקומה. התחל לרכוש נתונים על הציטומטר בקצב הזרימה הנמוך ביותר כדי לתת זמן לבצע את ההתאמות הדרושות. כדי להימנע מניקוד פסולת מזויפת ותאים מתים, התחל להקליט אירועים 5 שניות לאחר תחילת רכישת הדגימה.
    3. כוונן את מתח YL2 או RL1 כך שהשיא הראשי יהיה בטווח של 103-10 4 יחידות עוצמת פלואורסצנטיות יחסית (RFI). התאם מתחי FSC ו- SSC כך ש- >90% מהאירועים יתאימו לתרשים הנקודה. התאם את סף FSC כדי לא לכלול את אוכלוסיית הפסולת, אך לא תאים סבירים.
    4. התאם את ערוצי VL2 ו- BL1 כך שהשיא העיקרי יהיה בתוך 10 3-10 4 יחידות RFI עבור בקרת WT לא מוכתמת.
    5. הניחו את הדגימה הראשונה המכילה pHL מושרה מוכתמת ב-PI או TR על ה-SIP והעלו את הבמה למקומה. התחל לאסוף נתונים בקצב הזרימה הנמוך ביותר והתבונן היטב באירועים בכל חלקה. ודא כי >90% מהאירועים נמצאים בתוך כל עלילה וכי אין אירועים הרווים את ערוצי VL2-H ו- BL1-H.
  2. המשך בהפעלת הדגימות. הקפד להקליט לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה.
  3. שמור את הנתונים מהדוגמאות בתבנית קובץ .fcs וייצא לניתוח.

5. ניתוח נתונים של תוצאות ציטומטריית זרימה

הערה: זרימת עבודה זו של ניתוח נתונים משתמשת בתוכנת FlowJo. אם נעשה שימוש בתוכנה אחרת לניתוח ציטומטריית זרימה, המשך לבצע את השלבים העיקריים המתוארים להלן, תוך שימוש בכלים המתאימים לתוכנה. כדי להמחיש את החלקות ואת הגידופים, ראו איור משלים S3 ואיור משלים S4.

  1. פתח פריסה חדשה ופתח את קבצי ה- .fcs שנרכשו בשלב 4.3. גרור ושחרר את קבצי ה- .fcs בחלון הפריסה.
  2. שער לתאים חיים.
    1. לחץ פעמיים על פקד WT שאינו מוכתם כדי לפתוח חלון עבור דגימה זו.
    2. הצג את הנתונים כהיסטוגרמה בערוץ YL2-H (אם אתה משתמש ב- PI) או בערוץ RL2-H (אם אתה משתמש ב- TR). יש לעבור בין זה לבין דגימות מוכתמות בצבע הכדאיות כדי לזהות את האוכלוסיות החיות והמתות.
      הערה: כל האירועים צריכים להיות לא מוכתמים מכיוון שלא נוסף צבע כדאיות לדגימה זו.
    3. ליצור שער דו-מגזרי המפריד בין האוכלוסיות החיות והמתות; שם השער השמאלי חי והשער הימני מת. החל שער זה על כל הדגימות ולאחר מכן עבור בין הדגימות כדי להבטיח ששער זה משורטט כראוי לכל הדגימות. התאימו את השער לפי הצורך.
  3. שער לתאים.
    1. בפקד WT שאינו מוכתם, לחץ פעמיים על שער Live כדי להציג אירועים בשער זה. שנה את ציר x של התוויית נקודות ל - FSC-A ואת ציר y ל - SSC-A.
    2. השתמש בכלי שער מצולע כדי לצייר שער סביב אוכלוסיית התא ולתת לו את השם תאים. יש להקפיד להוציא פסולת/תאים גוססים (בדרך כלל בקצה השמאלי והתחתון של חלקת הנקודה) ואגרגטים (בקצה הימני והעליון של חלקת הנקודה).
    3. החל שער זה מתחת לשער Live עבור כל הדגימות. עבור בין דגימות כדי להבטיח שהשער מקיף את אוכלוסיית התאים הסבירה עבור כל הדגימות ובצע את ההתאמות הדרושות. הקפד להחיל מחדש את השער על כל הדגימות לאחר שינויו.
      הערה: התפלגות אוכלוסיית התאים משתנה באופן ניכר בין תנאים מורעבים ולא מורעבים ב- FSC לעומת SSC; ודא ששער התא מקיף את אוכלוסיית התאים בכל התנאים.
  4. שער לתאים בודדים כדי להגדיל את איכות מדידות ה- pH.
    1. בפקד WT שאינו מוכתם, לחץ פעמיים על שער התא כדי להציג אירועים בשער זה. שנה את ציר x של התוויית נקודות ל - FSC-A ואת ציר y ל - FSC-H.
    2. חפש התפלגות אלכסונית של תאים בודדים בתרשים נקודה זה, כאשר כפילים יוצרים אוכלוסייה משנית מימין למטה של אוכלוסיית הסינגלט (ראה תרשים משלים S1 בתרשים השלישי). בעזרת הכלי שער מצולע, ציירו שער מסביב לאירועי הסינגלט למעט אוכלוסיית הכפל. קרא לשער זה סינגלים.
    3. החל את שער הסינגלטים מתחת לשער התא עבור כל הדגימות. שוב, עבור בין דגימות כדי לוודא שהשער אינו כולל כראוי את אוכלוסיית הכפילות תוך הכללת אוכלוסיית הסינגלט. התאימו לפי הצורך.
  5. שער לתאי pHL פלואורסצנטיים.
    1. בדגימת הבקרה WT הלא מוכתמת, לחץ פעמיים על שער סינגלטס כדי לפתוח חלקת נקודות עבור אוכלוסייה זו. שנה את ציר ה-x ל-BL1-H ואת ציר ה-y ל-VL2-H.
    2. חיישן ה- pH pHluorin2 הוא פלואורסצנטי הן ב- VL2 והן ב- BL1. השתמש בכלי שער מצולע כדי לצייר שער בצורת אלכסון הנמשך למעלה ומימין לאוכלוסיית האוטופלואורסצנטיים בפינה השמאלית התחתונה של תרשים הנקודות. תן לשער זה שם pHL+.
    3. החל את שער pHL+ מתחת לשער סינגלט עבור כל הדגימות. עבור לדגימת pHL וכוונן את השער כך שיכלול אירועים בעלי עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר הן ב- VL2-H והן ב- BL1-H מאשר בקרת WT. ודא ששער זה מקיף אוכלוסייה פלואורסצנטית זו עבור כל הדגימות, שכן מיקומה של אוכלוסייה זו ישתנה כאשר רמת החומציות הגליקוזומלית תשתנה.
      הערה: שינוי קטן אך נראה לעין זה באוכלוסיית pHL+ נובע משינויים תלויי pH בספקטרום העירור של הפלואורופור.
  6. ייצא את הנתונים הסטטיסטיים.
    1. לחץ על עורך טבלאות | סרגל עריכה | הוסף עמודה כדי להוסיף נתונים סטטיסטיים חדשים לייצוא.
      הערה: עבור כל סטטיסטיקה לייצא, בחר את הסטטיסטיקה המתאימה ומאיזו אוכלוסייה לייצא אותה. הקפד לבחור את הפרמטר המתאים לסטטיסטיקה רלוונטית, כגון חציון. השאר את הדוגמה ללא שינוי.
    2. הוסף עמודות עם הנתונים הסטטיסטיים הבאים: סה"כ ספירה (כפויה), ספירת pHL+, Live Freq. של Total (אחוז המבוסס על סך כל האירועים), pHL+ Freq. של הורה (אחוז מבוסס על שער אב), pHL+ חציון VL2-H ו- pHL+ חציון BL1-H.
    3. לחץ על עורך הטבלאות ושנה את הגדרות הייצוא הבאות: הצג לקובץ ולטקסט לקובץ CSV ולאחר מכן בחר את יעד הקובץ ואת שמו. לחץ על צור טבלה.
  7. חשב את יחס הפלואורסצנטיות.
    1. שמור את קובץ .csv המיוצא כקובץ גיליון אלקטרוני.
    2. בצע ניתוח בקרת איכות על ידי השוואת הנתונים הבאים בכל הדגימות בניסוי: מספר האירועים לדגימה, אחוז האירועים החיים ואחוז אירועי pHL+ . השווה אותם חזותית בתרשימי עמודות או פיזור בהתאם לניסוי.
    3. תייג עמודה חדשה כ - pHL+ Median VL2/BL1. עבור כל דגימה, חלק את הערך החציוני VL2-H בערך BL1-H החציוני כפי שמוצג במשוואה (1).
      Equation 1(1)
  8. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי כדי לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות יחס פלואורסצנטי.

6. כיול ביו-חיישן pH

הערה: כדי להמיר יחסי פלואורסצנטיות מדודים ליחידות pH, כייל תאים המבטאים pHL באמצעות ניגריצין וולינומיצין. ניגריצין הוא אנטיפורטר K+/H+, יונופור שיכול לאזן pH על פני ממברנות כאשר יש מספיק K+ בחיץ15. ניגריצין שימש בדרך כלל לכיול pHluorin וחיישני pH אחרים16,17. מכיוון ש-pHluorin מקומי פרוקסיזומלי כויל בעבר באמצעות 10 מיקרומטר ניגריצין18, בחרנו לטפל בריכוז זה. ולינומיצין הוא יונופור אשלגן ונעשה בו שימוש (ב-4 מיקרומטר) כדי לאזן את רמת החומציות על פני קרומי המיטוכונדריה19. השתמשנו ב-10 μM valinomycin כדי לסייע לפעילות שיווי משקל ה-pH של ניגריצין על-ידי הבטחת איזון יוני K+ על פני הממברנות. אמנם השתמשנו בשילוב של ניגריצין-ואלינומיצין, אבל ייתכן שדי בניריצין כדי לאזן את רמת החומציות של אברונים.

  1. הכינו שמונה תמיסות של חיץ כיול אוניברסלי (UCB; 15 mM MES, 15 mM HEPES ו-130 mM KCl) כל אחת ב-pH שונה בטווח שבין 5 ל-8.5.
  2. צנטריפוגה (RT, 10 דקות, 800-1,000 × גרם) שמונה צינורות נפרדים של 2 מ"ל של תרבית BSF מבטאת pHL (~ 4 × 106 תאים כל אחד).
  3. הסר את supernatant ולאחר מכן להשעות מחדש כל כדור תא ב UCB בערכי pH שונים.
  4. הציגו nigericin ו valinomycin, כל אחד עד 10 μM. ספייק ב PI ל 1 מיקרוגרם / מ"ל.
  5. לדגור על התאים בכל תמיסה במשך 15 דקות.
  6. הפעל כל דגימה על ציטומטר זרימה כדי למדוד את יחס הפלואורסצנטיות כמתואר בשלבים 4-5.
  7. חזור על ניסוי זה פעמיים נוספות כדי לקבל שלושה העתקים ביולוגיים עבור כל ערך pH. ייצוא נתונים בתבנית .fcs.
  8. נתח את קבצי ה- .fcs כמתואר בשלבים 5.1 עד 5.8. השתמש ביחס הפלואורסצנטי הנמדד עבור כל pH כדי לבצע אינטרפולציה של pH גליקוזומלי בניסויים עתידיים באמצעות משוואה (2).
    Equation 2(2)
    הערה: איור משלים S3 מציג את תרשימי הנקודות ואת סכימת הגאט. את התוצאות ניתן למצוא בטבלה משלימה S2. להלן תיאור כיצד לבצע אינטרפולציה של pH מיחס פלואורסצנטי באמצעות GraphPad Prism. אם אתה משתמש בתוכנה סטטיסטית אחרת, בצע את אותם שלבי מפתח.
    1. פתח את GraphPad Prism וצור טבלת XY עם שלושה עותקים משוכפלים y. הדבק את ערכי ה- pH בעמודת x ואת ערכי יחס הפלואורסצנטיות המשויכים אליהם בעמודות y-replicate.
    2. לחץ על הגרף המשויך לטבלה. בעת הצגת הגרף, לחץ על נתח תחת רצועת הכלים ניתוח | בצע אינטרפולציה של עקומה סטנדרטית תחת ניתוחי XY.
    3. בחר Sigmoidal, 4PL, X הוא log(ריכוז) מאז יחידות pH הם בקנה מידה לוגריתמי. הפרמטרים העליון והתחתון הם הרמות העליונות והתחתונות המשוערות. בחר ללא טיפול מיוחד בחריגים.
      הערה: התוכנה תבקש להתאים את הנתונים למודל המתואר במשוואה (2) ובשלב 6.9.3. חפשו עדות לחוסר התאמה בטבלת התוצאות ובעקומה בגרף.
    4. כדי לבצע אינטרפולציה של pH מיחסי פלואורסצנטיות בניסויים אחרים, עבור לטבלה עם נתוני כיול pHL. הדבק את ערכי יחס הפלואורסצנטיות מתחת לנתוני הכיול בעמודות y. תן לכל ערך y כותרת, אך השאר את ערך ה- x (ה- pH) ריק מכיוון שהוא אינו ידוע.
    5. בגלריית התוצאות, לחץ על ניתוח האינטרפולציה ולאחר מכן עבור לכרטיסייה Interpolated X replicates . חפש את ערכי ה- pH האינטרפולציה שיירשמו לצד ערכי יחס הפלואורסצנטיות שהוזנו.
      הערה: התוכנה משתמשת במודל ובערכי הפרמטרים המתאימים ביותר שנמצאו מנתוני הכיול כדי לבצע אינטרפולציה של pH מיחסי פלואורסצנטיות עבור ניסויים שבהם pH אינו ידוע.

7. רעב גלוקוז ותוספת זמן-קורסים

  1. השרית 15 מ"ל של טפילי BSF pHL למשך הלילה עם 1 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין מודגר ב 37 ° C כמתואר בשלב 1.1.
  2. יש לשטוף 15 מ"ל של תרבית pHL מושרית ב-PBS בתוספת גלוקוז של 10 מ"מ. חזור על שלב זה 3x.
    1. במקביל, יש לשטוף 3 מ"ל של תרבית WT ב-PBS 3x כמתואר בשלב 3.2.
    2. לאחר השטיפה הראשונה כאשר דגימת pHL מושהית מחדש ב -1 מ"ל של PBS, הסר aliquot 0.1 מ"ל של תרחיף תאי pHL כדי לשמור על גלוקוז 10 mM כבקרה לא מורעבת.
  3. לאחר השטיפה הסופית, יש להשעות מחדש את דגימת ה-pHL ב-PBS בתוספת 1 מיקרוגרם/מ"ל PI.
  4. השגת נתוני ציטומטריה של זרימה
    1. התחל לנטר pH גליקוזומלי הן עבור הדגימות המורעבות והן עבור הדגימות שאינן מורעבות על ידי מדידת כל דגימה על ציטומטר זרימה כל 5, 10, 30 או 90 דקות, בהתאם לניסוי ולדגימה. קבל נתוני ציטומטריית זרימה כמתואר בשלבים 4.1 עד 4.3, וודא שהמתחים והמגרשים מוכנים מראש.
    2. הפעל תחילה את פקד ה- WT הלא מוכתם ב- 0 דקות.
    3. הפעל את דגימת הבקרה הלא מורעבת על הציטומטר כל 90 דקות החל מ- 0 דקות. לבדיקת מסלול זמן הרעב, הפעל את הדגימה המורעבת כל 10 דקות החל מ- 0 דקות. עבור בדיקת תוספת גלוקוז, הפעל את הדגימה המורעבת ב- 0, 5, 10, 20, 30, 60 ו- 90 דקות; לאחר מכן, חזור על הפעולה לאחר הצגת גלוקוז.
    4. דגרו על הדגימות בטמפרטורת החדר במהלך קורס זמן הרעב של 90 דקות וקורס הזמן של תוספת גלוקוז של 180 דקות.
  5. נתח את קבצי ה- .fcs כמתואר בשלבים 5.1 עד 5.8.
    הערה: איור משלים S4 מראה כיצד לבצע את הגאטינג וכיצד אמורות להיראות תרשימי הנקודות. טבלה משלימה S3 וטבלה משלימה S4 מציגות את התוצאות של בדיקת קורס זמן הרעב לגלוקוז ובדיקת מסלול זמן תוספת סוכר, בהתאמה.

8. אופטימיזציה של הבדיקה לבדיקת סמים

  1. יש לשטוף כ-32 מ"ל של טפילי BSF המבטאים pHL ו-3 מ"ל של תאי WT, שניהם בכ-2 × 106 תאים/מ"ל, פי 2 ב-PBS כפי שתואר קודם לכן.
    הערה: יש לרשום יותר מ-10,000 אירועים לכל באר כדי למזער את השונות של יחסי הפלואורסצנטיות הנמדדים ולמדוד במדויק את סטטיסטיקת גורם Z. התרבית המינימלית הדרושה להשגת מטרה זו היא כ- 26 מ"ל, אך אנו ממליצים על 32 מ"ל כדי להקל על הטיפול.
    1. לאחר השטיפה הראשונה, יש להפריד את דגימת ה-pHL באופן שווה לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה.
  2. לאחר השטיפה, יש להשעות דגימת pHL אחת ב-18 מ"ל של PBS המכילה 5 מ"ל גלוקוז, 0.1% DMSO ו-TR. להשעות מחדש את דגימת ה-pHL השנייה ב-18 מ"ל של PBS בתוספת 0.1% DMSO ו-TR.
    הערה: ה-DMSO משמש לחיקוי הרכב המאגר במסך תרופות מכיוון שתרכובות בדרך כלל מומסות ב-DMSO.
  3. מעבירים את שתי תמיסות התאים הללו למאגר של 12 בארות, 9 מ"ל לבאר.
  4. השתמש ברובוט צנרת כדי לצנרת את תמיסות התא לחצאים נפרדים של צלחת 384 באר, 80 מיקרוליטר לכל באר.
  5. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה וחצי, מנערים בעדינות ועטופים ברדיד אלומיניום כדי להגן על הפלואורופורים מפני אור.
  6. הפעל את הצלחת על ציטומטר זרימה המסוגל להריץ לוחות 384 בארות.
    הערה: זרימת העבודה הבאה מותאמת ל- Attune NxT עם Cytkick Max Auto Sampler. אם נעשה שימוש בציטומטר זרימה אחר, המשך לבצע את השלבים העיקריים.
    1. עבור הצלחת, הפעל בקצב הזרימה המהיר ביותר (1,000 uL/min) והפעל מצב הגברה. לרכוש 20 μL / באר. יש לכלול מחזור ערבוב אחד ומחזור שטיפה אחד בין כל באר.
    2. צור מגרשים כמתואר בשלב 4.1.3.
    3. הפעל בקרת צינור WT לא מוכתם ומטב מתחים כמתואר בשלבים 4.1.3 ו- 4.1.4. הפעל דגימת צינור pHL מורעבת ומטב את מתחי VL2 ו- BL1 כמתואר בשלב 4.1.
    4. התחל לרכוש את הצלחת על ציטומטר הזרימה. הפעל את הצלחת אופקית כך שלא יהיה הבדל משמעותי בזמן הרכישה בין בארות הדגימה המורעבות והלא מורעבות. ודא כי רכישת הצלחת הסתיימה ב~ 1.5 שעות.
  7. יצא את קבצי ה- .fcs ונתח את הנתונים כמתואר בשלבים 5.1 עד 5.8. מצא את הממוצע (AVG) וסטיית התקן (SD) של יחסי הפלואורסצנטיות עבור הדגימות שטופלו בגלוקוז (Glc) או ללא גלוקוז (מורעב).
    הערה: ניתן למצוא את הנתונים מהניסויים שלנו בגורם Z בטבלה משלימה S5.
  8. חשב את הסטטיסטיקה של גורם Z20 באמצעות משוואה (3).
    Equation 3(3)

Figure 1
איור 1: דיאגרמה של השיטה לניקוד pH גליקוזומלי בטריפנוזומים חיים של BSF. (A) תיאור של קווי תאים המבטאים חיישן pHluorin2 הממוקם גליקוסומלית. הכללת רצף מיקוד peroxisomal מספק שליטה על לוקליזציה. הערה: אנו צופים כי חיסול PTS-1 יוביל ללוקליזציה ציטוסולית, מה שיאפשר ניתוח עתידי של pH באותו תא תת-תאי. (B) תיאור של בדיקת אימות החיישן. קיצור: BSF = צורת זרם הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: הסטטיסטיקה של גורם Z משמשת כדי לקבוע עד כמה בדיקה מתאימה עבור HTS. ערכים בין 0.5 ל- 1.0 פירושם בדרך כלל שאיכות הבדיקה מקובלת עבור HTS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

pHLuorin2-PTS1 לוקליזציה לגליקוזים ב- BSF T. brucei
כדי להעריך את הלוקליזציה התת-תאית של pHluorin2-PTS1, טפילים היו נתונים לבדיקות immunofluorescence. אות מהטרנסגן שעבר לוקליזציה עם אנטי-סרה שהועלה כנגד חלבון תושב גליקוזיום, אלדולאז (TbAldolase) (איור 2A). מקדם המתאם הממוצע של פירסון בין אנטי-TbAldolase ו-pHluorin2-PTS1 היה 0.895, מה שמצביע על כך ש-pHluorin2-PTS1 היה מקומי בעיקר לגליקוזים. עם pHluorin2-PTS1 מקומי לגליקוזום, המשכנו לחקור את רמת החומציות של גליקוזים BF.

Figure 2
איור 2: לוקליזציה של pHluorin2-PTS1 לגליקוזימים ב-BSF Trypanosoma brucei. (A) קולוקליזציה של pHluorin2-PTS1 עם החלבון TbAldolase תושב הגליקוזום. BF 90-13 טפילים הודבקו ב-pLEWpHluorin2-PTS1 והביטוי הושרה עם דוקסיציקלין (1 מיקרוגרם/מ"ל). TbAldolase היה מקומי באמצעות anti-TbAldolase sera, ואחריו דגירה עם עז נגד ארנב Alexa fluor 568. מקדם המתאם הממוצע של פירסון היה 0.895 (30 תאים). (B) כיול של pHluorin2-PTS1 ב-BSF T. brucei. פסי קנה מידה = 4 מיקרומטר. קיצור: BSF = צורת זרם הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כיול pHluorin2-PTS1
שינויים ב- pH משנים את ספקטרום העירור של pHluorin2-PTS1. תחת pH נייטרלי, עירור pHluorin2-PTS1 ב 405 ננומטר גדול יותר מאשר ב 488 ננומטר; כאשר רמת החומציות יורדת, ההפך הוא הנכון 9,21. כדי למדוד את רמת החומציות היחסית של הגליקוזום באמצעות ציטומטריית זרימה, מדדנו פליטה כאשר היא מעוררת על-ידי לייזר של 405 ננומטר (ערוץ VL2) ופליטה כאשר היא מעוררת על-ידי לייזר של 488 ננומטר (ערוץ BL1), תוך שימוש ביחס של VL2/BL1 (יחס פלואורסצנטי) כדי למדוד את ה-pH הגליקוזומי היחסי. כדי להמיר את יחס הפלואורסצנטיות ל-pH, שיווינו את ה-pH התוך-תאי והגליקוזומלי עם pH חוץ-תאי באמצעות היונופורים ולינומיציןוניגריצין 17,18 ולאחר מכן ניתוח ציטומטריית זרימה כדי למצוא את היחס הפלואורסצנטי. כצפוי, יחס הפלואורסצנטיות עלה ככל שה-pH החוץ-תאי עלה עם Kd תוך-תאי של pH 6.5 (איור 2B). Kd זה היה מעט נמוך יותר מאשר דווח במבחנה Kd של pHluorin29. מעניין, ה- pH הגליקוזומלי של BSF בנוכחות גלוקוז היה ~ pH 8.0, שהיה בסיסי יותר מגליקוזימים של PF בנוכחות גלוקוז22. השתמשנו בעקומת הכיול הזו כדי להמיר את יחס הפלואורסצנטיות ל-pH בניסויים הבאים.

החמצת גליקוזיומים עקב רעב גלוקוז
בעוד טפילי T. brucei PF חומציים את הגליקוזומים שלהם כאשר הם מורעבים מגלוקוז22, לא ידוע כיצד גליקוזים BSF מגיבים לגלוקוז. כדי לחקור זאת, שטפנו טפילי BSF המבטאים pHluorin2-PTS1 ב-PBS בתוספת גלוקוז של 10 מילימטר כדי להסיר את מדיום התרבית, ולאחר מכן השעינו מחדש את התאים ב-PBS ללא גלוקוז. תגובת החיישן להפרעה זו נמדדה מיד ולאחר מכן כל 10 דקות במשך שעה וחצי על ידי ציטומטריית זרימה. התגובות הושוו לתאים ב-PBS בתוספת גלוקוז של 10 מילימטר (לא מורעבים).

בתגובה לרעב ראינו החמצה הדרגתית קלה לאורך זמן, שהגיעה לרמות של ~90 דקות (איור 3A). שינוי זה ב- pH גליקוזומלי היה מובהק סטטיסטית (p < 0.0001) וניתן היה לחזור עליו בשלושה ניסויים נפרדים. זה מצביע על כך שתאי BSF חומציים מעט את הגליקוזומים שלהם כאשר הם מורעבים מגלוקוז, בדומה לתגובה שנצפתה בשלב החיים של PF9.

Figure 3
איור 3: החמצה הפיכה של גליקוזימים של BSF T. brucei כאשר נמנע מהם גלוקוז. (A) pH גליקוזומלי של תאים שגדלו בהיעדר גלוקוז (מורעב, כחול) או בנוכחות (לא מורעב, אדום). התאים המורעבים הושעו מחדש ב-PBS ללא גלוקוז ~2 דקות לפני המדידה הראשונה על ציטומטר זרימה Attune NxT. בוצעו שלושה שכפולים ביולוגיים של מהלך הזמן. טפילים לא מורעבים הודגרו ב-PBS בתוספת גלוקוז של 10 מילימול. מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג בוצע והשווה את נקודות הזמן של 90 דקות מורעבות ולא מורעבות, ***p = 0.0001. (B) מהלך הזמן של שינוי pH גליקוזומלי מורעב (כחול) ולא מורעב (אדום) טפילי BSF עם גלוקוז של 10 מילימטר שהוחזר לאחר 90 דקות (קו מקווקו ירוק). בוצעו חמישה שכפולים ביולוגיים של מהלך הזמן. NS = לא משמעותי (p = 0.25, מבחן t של סטודנט דו-זנבי לא מזווג). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

החמצה גליקוזומלית הפיכה בתגובה לגלוקוז
לאחר מכן בדקנו אם החמצת גליקוזיומים BSF הפיכה על-ידי הרעבת התאים ולאחר מכן החדרת גלוקוז מחדש. טפילים הודגרו בהיעדר גלוקוז במשך 90 דקות. לאחר מכן נוסף גלוקוז (10 מילימול) ותגובת החיישן נמדדה באמצעות ציטומטריה במשך 90 דקות נוספות (איור 3B). ראינו כי לאחר החזרת הגלוקוז, ה- pH הגליקוזומלי חזר לרמות שלפני הרעב תוך ~30 דקות. תוצאות אלה מצביעות על כך ש- BSF glycosomal pH הוא דינמי וניתן לוויסות בתגובה לגלוקוז, בדומה לתגובת ה- pH שנצפתה בטפילי PF.

התאמה של בדיקת pHluorin2 לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה
גליקוזים הם אברונים חיוניים עבור טריפנוזום, שכן הם מאכלסים מסלולים מטבוליים מרכזיים. חשיבותם של הגליקוזומים מצביעה על כך שמעכבי ההומאוסטזיס שלהם יכולים להיות מבטיחים כמובילים טיפוליים פוטנציאליים. כאן, התאמנו את הבדיקה עבור pH גליקוזומלי לפורמט תפוקה גבוהה, אשר יאפשר התאמה למסכי תרופות כדי לזהות מעכבי pH גליקזומלי. אנו צופים כי שיבוש בוויסות תגובה זו עלול להזיק לטפיל, בהתחשב בהשפעה הידועה של pH על תפקוד החלבון תושב הגליקוזום7.

כדי לבסס את פורמט התפוקה הגבוהה, השגנו את עמידות המבחן. כדי להשלים זאת, טפילים שהושרו לבטא את pHluorin2-PTS1 צופו בצלחת מיקרוטיטר של 384 בארות בגלוקוז של 5 מילימטר (בקרות גבוהות) או ללא גלוקוז (בקרות נמוכות) ולאחר מכן הודגרו במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. הצלחת נותחה אז על ידי ציטומטריית זרימה. כפי שניתן לראות באיור 4, הייתה שונות נמוכה בין מדידות משוכפלות והבקרות הגבוהות והנמוכות מופרדות היטב, תכונות שהביאו לפקטור Z מקובל של 0.645. בדיקות עם ערכים > 0.5 נחשבות בדרך כלל חזקות מספיק להתאמה לקמפיינים של סינון בתפוקה גבוהה. לאור ההצלחה כאן, אנו צופים כי חיישן וגישה אלה ישמשו בעתיד במסכי תרופות בעלי תפוקה גבוהה.

Figure 4
איור 4: בדיקה להערכת ההתאמה של BSF נושא חיישן pHluorin2-PTS1 לקמפיינים עתידיים של HTS. התאים הודגרו במשך 90 דקות עם גלוקוז (שליטה גבוהה, אדום, 5 מילימטר גלוקוז) או ללא הקסוס (שליטה נמוכה, כחול, ללא גלוקוז נוסף). פקטור ה-Z המחושב היה 0.645. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: שיבוט הגן pHluorin2-PTS1 לווקטור הביטוי המושרה T. brucei pLEW100v5. (A) שני הווקטורים היו הגבלה כפולה, עוכלו על ידי HindIII ו-BamHI ולאחר מכן טוהרו. מקטע הגן pHluorin2-PTS1 נקשר ל-pLEW100v5 באמצעות ליגאז DNA T4. (B) pLEW100-pHlourin2-PTS1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: קולוקליזציה של pHL עם TbAldolase BF 90-13 טפילים נגועים pLEWpHluorin2-PTS1. הביטוי הושרה עם דוקסיציקלין (1 מיקרוגרם/מ"ל). TbAldolase היה מקומי באמצעות anti-TbAldolase sera (מדולל 1:500 בבלוק), ואחריו דגירה עם ארנב עז anG Alexa fluor 568. מקדם המתאם הממוצע של פירסון היה 0.895 (30 תאים). פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים S3: חלקות gating ונקודות מייצגות לכיול קו תאי חיישן BSF pHL באמצעות דגימת חיץ כיול pH 8 כדוגמה. הדגימות הוכתמו בצבע הכדאיות PI כדי להעריך כיצד pH השפיע על הכדאיות באמצעות ערוץ YL2-H, אך לא נעשה שימוש בכדאיות בתוכנית הגאט. שער רחב ב- FSC-A לעומת SSC-A שימש לשער עבור תאים מכיוון שתאים חיים ומתים שימשו בכיול. לאחר גידור תאים, תאים בודדים (סינגלים) גודרו באמצעות FSC-A לעומת FSC-H. לבסוף, שער מחמיר שימש לאירועים פלואורסצנטיים עבור pHL בערוצי BL1-H ו- VL2-H. קיצורים: BSF = צורת זרם הדם; PI = יודיד פרופידיום; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: חלקות גאט ונקודות מייצגות לרעב גלוקוז ומבחני זמן תוספת. דגימת 0 דקות מורעבת משמשת כדוגמה. תאים חיים היו מגודרים בערוץ YL2-H מאז שנעשה שימוש ב-PI. התאים גודרו באמצעות FSC-A לעומת SSC-A כדי להוציא פסולת וצברים. סינגלים היו מגודרים באמצעות FSC-A לעומת FSC-H. ערוצים BL1-H ו- VL2-H שימשו לשער לאירועי pHL+. פקד WT שימש כדי לא לכלול אירועים פלואורסצנטיים אוטומטיים בעת הגדרת שער זה. קיצורים: PI = יודיד פרופידיום; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; SSC-A = אזור פיזור-שיא צד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: ערוץ ושם נפוץ המשמש לציטומטריית זרימה. שם הערוץ, השם הנפוץ ומסנן הלייזר והפליטה שבהם נעשה שימוש מסופקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S2: תוצאות מכיול pHL באמצעות ניגריצין וולינומיצין במאגרים pH שונים. טבלה זו כוללת את הנתונים הסטטיסטיים המיוצאים מניתוח FlowJo של קבצי .fcs. ערכים אלה שימשו למציאת יחס פלואורסצנטי (VL2-H/BL1-H) לכיול pHL, כפי שמוצג באיור 2. תוצאות כיול ה-pH האלה שימשו גם לאינטרפולציה של pH עבור רעב גלוקוז ולניסויי מסלול זמן נוסף (איור 3). הנתונים הסטטיסטיים הבאים שימשו לבקרת איכות: ספירת אירועים כוללת, ספירת pHL+, PI- (%), PI+ (%) ו- pHL+ (%). הנתונים עבור כל שכפול ביולוגי נמצאים בכרטיסייה נפרדת, והכרטיסייה שכותרתה "תוצאות מסוכמות" מכילה את יחסי הפלואורסצנטיות עבור כל טיפול pH ושכפול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S3: נתונים מנותחים מבדיקת זמן רעב גלוקוז BSF pHL המוצגת באיור 3A. טבלה זו כוללת נתונים סטטיסטיים מיוצאים מקבצי .fcs שנותחו בתוכנת FlowJo. יחסי פלואורסצנטיות חושבו על ידי לקיחת היחס בין חציון VL2-H וחציון BL1-H (שניהם מאוכלוסיית pHL+). יחסים אלה נאספו בכרטיסייה שכותרתה "תוצאות מסוכמות". PI- (%) שימש כדי לקבוע את ההשפעה של רעב גלוקוז על הכדאיות לאורך זמן. ספירה כוללת וספירה pHL+ שימשו לבקרת איכות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S4: נתונים מנותחים מבדיקת מסלול הזמן להוספת גלוקוז של BSF pHL המוצגת באיור 3B. טבלה זו מכילה נתונים סטטיסטיים מיוצאים מקבצי .fcs שנותחו בתוכנת FlowJo. ערכי pHL+ Median VL2/BL1 חושבו מתוך חציון pHL+ VL2-H ו- BL1-H ב- Excel. הנתונים הסטטיסטיים האחרים שימשו לבקרת איכות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S5: נתונים תוצאתיים מניתוח FlowJo של ניסוי Z-Factor בבדיקת סינון בתפוקה גבוהה באמצעות pHL. כרטיסיות המסומנות "0 mM גלוקוז" (נמוך) ו "5 mM גלוקוז" (גבוה) כוללות נתונים מתאים שטופלו עם 0 או 5 mM גלוקוז, בהתאמה. יחסי הפלואורסצנטיות האלה מוצגים באיור 4. בכרטיסייה "ניתוח מאוגד" נאספו יחסי הפלואורסצנטיות עבור שני הטיפולים וחושבו הממוצע וסטיית התקן של המדגם (SD) עבור כל אחד מהם. סטטיסטיקת גורם Z חושבה באמצעות משוואה 3. היחס בין הממוצע גבוה לנמוך חושב כדי למדוד את הפרדת האמצעים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התפיסה הסביבתית ומנגנוני התגובה בטריפנוזום האפריקאי אינם מובנים היטב. ידוע כי שינויים בזמינות החומרים המזינים מעוררים תגובות מגוונות בטפיל, כולל החמצה של גליקוזים. במאמר זה תיארנו שיטה לחקר תגובת pH גליקוזומלית להפרעות סביבתיות בתאים חיים באמצעות חיישן חלבון תורשתי, pHluorin2 וציטומטריית זרימה.

ישנם מספר שלבים קריטיים בשימוש בחיישן. ראשית, אפיון הטפילים הנגועים המבטאים את הטרנסגן חשוב, שכן יכולה להיות שונות בין תא לתא בביטוי. רמות הביטוי של טרנסגנים מסוימים יכולות לרדת עם הזמן. אמנם זה לא נצפה עם תאים נושאי pHluorin2 עד כה, אם תגובת החיישן הופכת משתנה מאוד (למשל, לאחר אינדוקציה, אות החיישן אינו חזק), ייתכן שיהיה צורך לשכפל את התרבית, כמו כמה חברים באוכלוסייה עשויים לבטא את החלבון ברמות גבוהות יותר מאחרים. לחלופין, טרנספורמציה מחדש ובחירה הוכחו כשימושיות ליצירת קווי תאים חדשים עם ביטוי גבוה יותר (אם כי אולי ארעי). אם נדרשת טרנספקציה חוזרת, אנו ממליצים לשכפל קווים בודדים, שכן ביטוי הטרנסגן המעניין עלול להקנות חיסרון גדילה עדין המוביל לאובדן מבטאים גבוהים באוכלוסייה לאורך זמן.

בנוסף, חיוני לעקוב אחר כדאיות הטפיל - הן במהלך הבדיקה והן תוך שמירה שגרתית על תרביות. כללנו PI או thiazole אדום למטרה זו במהלך הבדיקה, וכתבים אלה מבטיחים כי הנתונים משקפים רק תגובות בתאים חיים. הבטחת זמן הכפלת התאים במהלך תרבית רגילה היא קבועה, במיוחד לפני תחילת בדיקות בקנה מידה גדול (למשל, בדיקות מסוג HTS) מגבילה את החשש לגבי התחלת בדיקות עם תאים שאינם משגשגים, מה שעלול לשנות לרעה אותות בקרה גבוהים ונמוכים ולהשפיע על החוסן הכללי של המסך.

הגישה שתיארנו כאן למדידת pH גליקוזומלי היא חזקה ורגישה. עם זאת, יש מגבלות לגישה. ראשית, נדרשת גישה לציטומטרים בעלי יכולות מתאימות, כולל דוגמים המסוגלים לקבל לוחות מיקרוטייטר. בעוד שניתן לאסוף נתונים יחסיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המספר המוגבל של דגימות שניתן לנתח בדרך זו מגביל את התועלת של גישות כגון מסכים (ומבדקים מבוססי מסלול זמן).

מגבלה פוטנציאלית שנייה היא שהבדיקות מערבות סוכן של דאגה לבטיחות ביולוגית. ייתכן כי מתקני ליבה המאחסנים את המכשירים הדרושים לעבודה לא יאפשרו טפילים חיים על ציודם. ניתן להתגבר על מגבלות אלה, יחד עם האתגרים הטכניים של יצירה ותחזוקה של טריפנוזומים טרנסגניים, באמצעות שיתוף פעולה בין קבוצות בעלות מומחיות מתאימה בביולוגיה של טפילים ובאנליזות תאים.

העבודה המתוארת כאן מתמקדת בשימוש בחיישן pH גליקוזומלי בטריפנוזומים אפריקאים, אך הכלי יכול להיות מותאם לשימוש בטפילים קינטופלסטידים אחרים. אמנם לא ברור איזה תפקיד יכול להיות להחמצה של האברון בביולוגיה של לישמניה spp. או Trypanosoma cruzi, האם ייתכן ש-pHLuorin2-PTS1 יכול להתבטא כטרנסגן בתאים בהינתן שווקטורי ביטוי ספציפיים לטפיל זמינים ושמנגנון היבוא הגליקוזומלי דומה באורגניזמים 5,23,24.

יישום אפשרי אחד של התאים נושאי החיישן הוא זיהוי מולקולות קטנות המשנות את היכולת התאית להחמיץ. אלה עשויים להיות מזיקים לטפיל, שכן pH שונה נמצא כאמצעי אפשרי לוויסות של הקסוקינאז, חלבון תושב גליקוזום החיוני בשלב מחזור החיים הפתוגני של טריפנוזוםאפריקאי 7. הבדיקה המתוארת כאן הותאמה לתפוקה גבוהה (איור 4), ומאפשרת חקירה של אוספים כימיים גדולים לפעילות זו.

לסיכום, כלי זה מציע הזדמנות לנתח מנגנונים המעורבים בתגובות דינמיות באברון ספציפי לטפיל. באמצעות שימוש בקווי החיישנים בשילוב עם גנטיקה קדימה ואחורה סביר להניח שיזוהו מסלולים ייחודיים ספציפיים לטפיל. יתר על כן, קווי החיישנים מציעים הזדמנות לזיהוי מעכבי מולקולות קטנות של התגובה, ופותחים את הדלת לגילוי מטרות תרופה חדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

pHluorin2-PTS1 שוכפל לתוך pLEW100v5 על ידי Twist Bioscience שסיפקה את המבנה בווקטור שיבוט עתיר עותקים; pLEW100v5 היה מתנה מד"ר ג'ורג' קרוס. אנטי-סרום שהועלה נגד T. brucei aldolase זמין מד"ר מרדית ט. מוריס, אוניברסיטת קלמסון, על פי בקשה. העבודה ממעבדות JCM ו- KAC נתמכה חלקית על ידי פרס מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01AI156382). SSP נתמך על ידי NIH 3R01AI156382.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) VWR 10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) Corning 431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate BrandTech  781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit Lonza VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer invitrogen by Thermo Fisher Scientific A24858 FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate Millipore Sigma BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler invitrogen by Thermo Fisher Scientific A42973
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule Fisher Scientific 50-980-487
GraphPad Prism statistical software
Nigericin (sodium salt) Cayman Chemical 11437
Nucleofector 2b Lonza Discontinued Product
OP2 Liquid Handler opentrons OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O Sigma Life Science CAS:25988-63-0 Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3) biotium #40087 We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin Cayman Chemical 10009152 Pipetting robot for HTS assay
         For pH calibration
         For pH calibration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
  2. Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
  3. Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
  4. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
  5. Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
  6. Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
  7. Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
  8. Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).
  9. Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
  10. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
  11. Restriction digest v.2. , Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018).
  12. Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3. , Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021).
  13. Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
  14. Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
  15. Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).
  16. Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
  17. Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
  18. Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
  19. Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
  20. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  21. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  22. Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
  23. Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
  24. Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 203
מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים <i>בטריפנוזומה ברוסי</i> חי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Call, D., Pizarro, S. S., Tovey, E., … More

Call, D., Pizarro, S. S., Tovey, E., Knight, E., Baumgardner, C., Christensen, K. A., Morris, J. C. Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (203), e66279, doi:10.3791/66279 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter