Op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van interacties van CRAF met 14-3-3-eiwitten in levende cellen
Summary
Dit protocol beschrijft een op BRET gebaseerde test voor het meten van de interacties van het CRAF-kinase met 14-3-3-eiwitten in levende cellen. Het protocol schetst stappen voor het voorbereiden van de cellen, het uitlezen van BRET-emissies en gegevensanalyse. Er wordt ook een voorbeeldresultaat gepresenteerd met identificatie van de juiste controles en probleemoplossing voor testoptimalisatie.
Abstract
CRAF is een primaire effector van RAS GTPases en speelt een cruciale rol bij de tumorigenese van verschillende KRAS-gedreven kankers. Bovendien is CRAF een hotspot voor kiembaanmutaties, waarvan is aangetoond dat ze de ontwikkelings-RASopathie, het Noonan-syndroom, veroorzaken. Alle RAF-kinasen bevatten meerdere fosforyleringsafhankelijke bindingsplaatsen voor 14-3-3 regulerende eiwitten. De differentiële binding van 14-3-3 aan deze plaatsen speelt een essentiële rol bij de vorming van actieve RAF-dimeren op het plasmamembraan onder signaalomstandigheden en bij het handhaven van RAF-autoremming onder rustomstandigheden. Begrijpen hoe deze interacties worden gereguleerd en hoe ze kunnen worden gemoduleerd, is van cruciaal belang voor het identificeren van nieuwe therapeutische benaderingen die gericht zijn op de RAF-functie. Hier beschrijf ik een op bioluminescentieresonantie energieoverdracht (BRET) gebaseerde test voor het meten van de interacties van CRAF met 14-3-3 eiwitten in levende cellen. In het bijzonder meet deze test de interacties van CRAF gefuseerd met een Nano-luciferasedonor en 14-3-3 gefuseerd met een Halo-tagacceptor, waarbij de interactie van RAF en 14-3-3 resulteert in energieoverdracht van donor naar acceptor en het genereren van het BRET-signaal. Het protocol laat verder zien dat dit signaal kan worden verstoord door mutaties waarvan is aangetoond dat ze 14-3-3-binding aan elk van zijn RAF-dockingplaatsen met hoge affiniteit voorkomen. Dit protocol beschrijft de procedures voor het zaaien, transfecteren en vervangen van de cellen, samen met gedetailleerde instructies voor het lezen van BRET-emissies, het uitvoeren van gegevensanalyse en het bevestigen van eiwitexpressieniveaus. Daarnaast worden voorbeeldanalyseresultaten, samen met stappen voor optimalisatie en probleemoplossing, verstrekt.
Introduction
RAF-kinasen (ARAF, BRAF en CRAF) zijn de directe effectoren van RAS GTPases en de initiërende leden van de pro-proliferatieve/pro-overleving RAF-MEK-ERK-kinasecascade. Recente studies hebben aangetoond dat CRAF-expressie een sleutelrol speelt bij het ontstaan van tumoren van verschillende KRAS-gedreven kankers, waaronder niet-kleincellige longkanker en ductaal adenocarcinoomvan de pancreas 1,2,3,4,5. Bovendien veroorzaken CRAF-mutaties in de kiembaan een bijzonder ernstige vorm van de RASopathie, het Noonan-syndroom 6,7. Het begrijpen van CRAF-regulatie is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van succesvolle therapeutische benaderingen die gericht zijn op de functie ervan in cellen.
Alle RAF-kinasen kunnen worden onderverdeeld in twee functionele domeinen, een C-terminaal katalytisch (CAT) domein en een N-terminaal regulatief (REG) domein, dat de activiteit ervan regelt (Figuur 1A)8. Het REG-domein omvat het RAS-bindingsdomein (RBD), het cysteïnerijke domein (CRD) en een serine/threonine-rijk gebied (S/T-rijk). Met name het S/T-rijke gebied bevat de N’-site, die op een fosforyleringsafhankelijke manier bindt aan 14-3-3 (S259 in CRAF; Figuur 1A) 8. Het CAT-domein omvat het kinasedomein, samen met een tweede 14-3-3-dockingplaats met hoge affiniteit, de C’-site genoemd (S621 in CRAF; Figuur 1A) 8. De differentiële binding van dimeer 14-3-3-eiwitten aan de N’- en C’-plaatsen, samen met de CRD, speelt een cruciale rol bij zowel RAF-activering als -remming 9,10,11,12,13. Onder normale signaleringsomstandigheden wordt RAF-activering geïnitieerd door de rekrutering ervan naar het plasmamembraan door RAS, waardoor het actieve dimeren kan vormen, waarvan het BRAF-CRAF-heterodimeer de overheersende actieve vormis 14,15. Biochemische testen met BRAF en CRAF, samen met cryogene elektronenmicroscopie (Cryo-EM) structuren van dimeer BRAF, geven aan dat een 14-3-3 dimeer actieve RAF-dimeren stabiliseert door gelijktijdig te binden aan de C’-plaats van beide RAF-protomeren (Figuur 1B)9,13,16,17. Omgekeerd hebben studies aangetoond dat RAF onder rustige omstandigheden een cytosolische, auto-geremde bevestiging aanneemt, waarbij het REG-domein bindt aan het CAT-domein en de activiteit ervan remt 12,18,19,20. Deze gesloten toestand wordt gestabiliseerd door een 14-3-3 dimeer dat gebonden is aan de CRD- en N’-site in het REG-domein en aan de C’-site in het CAT-domein (Figuur 1B)10,13,21. In BRAF wordt dit model ondersteund door recente Cryo-EM-structuren van auto-geremde BRAF-monomeren en door onze eerdere biochemische studies 10,12,13,21,22. Hoewel is aangetoond dat 14-3-3 een remmende rol speelt bij CRAF-regulatie23, kan een BRAF-achtige auto-geremde toestand een mindere rol spelen bij CRAF-regulatie12; daarom zijn verdere studies nodig om de mechanismen te verduidelijken waarmee 14-3-3-eiwitten de CRAF-activiteit reguleren. De 14-3-3-gemedieerde regulatie van RAF-kinasen vereist een overvloed aan RAF-fosforylerings- en defosforyleringsgebeurtenissen, de binding aan verschillende regulerende eiwitten en interacties met het plasmamembraan8. Daarom is het van cruciaal belang dat 14-3-3-RAF-interacties worden gemeten onder fysiologisch relevante omstandigheden en in aanwezigheid van een intacte lipidedubbellaag.
Om dit probleem aan te pakken, werd NanoBRET (vanaf hier aangeduid als N-BRET; zie Tabel van Materialen voor kitdetails) technologie gebruikt om een nabijheidsgebaseerde test te ontwikkelen voor het meten van de interacties van CRAF met 14-3-3 eiwitten in levende cellen (Figuur 1C). Dit op BRET gebaseerde systeem meet de interacties van twee interessante eiwitten (POI), waarbij het ene eiwit wordt gelabeld met een nanoluciferase (Nano) donor en het andere met een Halo-tag, voor labeling met de Halo618-energieacceptorligand 22,24. Interactie van de eiwitten van belang resulteert in energieoverdracht van donor naar acceptor, die op zijn beurt het BRET-signaal genereert (Figuur 1C). Het extreem heldere Nano-donoreiwit (emissie (em) 460 nm) en het Halo618-ligand (em 618 nm) zorgen voor een grotere spectrale scheiding en gevoeligheid ten opzichte van conventionele BRET, waardoor het een ideaal platform is voor het bestuderen van zwakkere interacties en het detecteren van subtiele veranderingen in binding24. Inderdaad, we ontwikkelden eerder een op N-BRET gebaseerde test voor het meten van de autoremmende interacties van de RAF REG- en CAT-domeinen, die essentieel was voor de karakterisering van een panel van RASopathy-mutaties in de BRAF CRD en het cruciale belang van dit domein aantoonde voor het handhaven van auto-remming en het voorkomen van constitutieve BRAF-activering12.
De hier beschreven test meet de interacties van CRAF, gefuseerd met een N-terminale Nano-tag (Nano-CRAF), en de zeta-isovorm van 14-3-3 gefuseerd met C-terminale Halo-tag (14-3-3ζ-Halo; Figuur 1C). We tonen aan dat de interacties van Nano-CRAF met 14-3-3ζ-Halo een robuust BRET-signaal genereert, dat op zijn beurt kan worden verstoord door mutaties die 14-3-3-binding aan de N’-site (S259A) en/of de C’-site (S621A) verhinderen. Het volgende protocol biedt gedetailleerde stappen voor het uitvoeren, optimaliseren en oplossen van problemen met deze test.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerdere studies hebben aangetoond dat 14-3-3-eiwitten een cruciale rol spelen bij zowel de activering als de remming van RAF-kinasen. Inzicht in hoe deze bindingsgebeurtenissen worden gereguleerd en de effecten van het moduleren van deze interacties op RAF-signalering en RAF-gestuurde oncogenese, kan nieuwe therapeutische kwetsbaarheden aan het licht brengen die gericht zijn op de CRAF-functie. De Raf-activeringscyclus wordt echter ondersteund door een overvloed aan geassocieerde eiwitten, posttranslationele modificaties…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project is gedeeltelijk gefinancierd met federale fondsen van het National Cancer Institute, National Institutes of Health, onder projectnummer ZIA BC 010329.
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
Referências
- Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
- Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
- Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
- Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
- Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
- Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
- Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).
- Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
- Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
- Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
- Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
- Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486 (2022).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
- Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
- Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O’Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
- Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
- Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
- Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
- Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580 (2023).
- Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461 (2023).
- Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
- Machleidt, T., et al. NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
- Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
- Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
- Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
- Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).
.