살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석
Summary
이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF 키나아제의 상호 작용을 측정하기 위한 BRET 기반 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 셀 준비, BRET 배출량 판독 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 적절한 대조군을 식별하고 분석 최적화를 위한 문제 해결을 위한 결과의 예도 제시됩니다.
Abstract
CRAF는 RAS GTPase의 주요 효과자이며 여러 KRAS 기반 암의 종양 형성에 중요한 역할을 합니다. 또한 CRAF는 생식세포 돌연변이의 핫스팟이며, 이는 발달성 RASopathy, Noonan 증후군을 유발하는 것으로 나타났습니다. 모든 RAF kinase는 14-3-3 조절 단백질에 대한 여러 인산화 의존성 결합 부위를 포함합니다. 이러한 부위에 대한 14-3-3의 차등 결합은 신호 조건 하에서 원형질막에서 활성 RAF 이량체를 형성하고 정지 조건에서 RAF 자가억제를 유지하는 데 필수적인 역할을 합니다. 이러한 상호 작용이 어떻게 조절되고 어떻게 조절될 수 있는지 이해하는 것은 RAF 기능을 표적으로 하는 새로운 치료 접근법을 식별하는 데 중요합니다. 여기에서는 살아있는 세포에서 CRAF와 14-3-3 단백질의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석에 대해 설명합니다. 구체적으로, 이 분석은 나노 루시페라아제 공여체에 융합된 CRAF와 Halo 태그 수용체에 융합된 14-3-3의 상호 작용을 측정하며, 여기서 RAF와 14-3-3의 상호 작용은 공여체에서 수용체 간 에너지 전달 및 BRET 신호의 생성을 초래합니다. 이 프로토콜은 또한 이 신호가 고친화성 RAF 도킹 사이트 각각에 대한 14-3-3 결합을 방지하는 것으로 표시된 돌연변이에 의해 중단될 수 있음을 보여줍니다. 이 프로토콜은 BRET 방출 판독, 데이터 분석 수행 및 단백질 발현 수준 확인에 대한 자세한 지침과 함께 세포의 파종, transfection, 재도금 절차를 설명합니다. 또한 최적화 및 문제 해결 단계와 함께 예제 분석 결과가 제공됩니다.
Introduction
RAF 키나아제(ARAF, BRAF 및 CRAF)는 RAS GTPase의 직접 효과자이며 pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade의 초기 멤버입니다. 최근 연구에 따르면 CRAF 발현은 비소세포폐암 및 췌관 선암(pancreatic ductal adenocarcinoma) 1,2,3,4,5를 포함한 여러 KRAS 유발 암의 종양 형성에 중요한 역할을 합니다. 더욱이, 생식세포 CRAF 돌연변이는 특히 심각한 형태의 RASopathy, Noonan 증후군 6,7을 유발합니다. CRAF 조절을 이해하는 것은 세포에서 CRAF 기능을 표적으로 하는 성공적인 치료 접근법을 개발하는 데 매우 중요합니다.
모든 RAF 키나아제는 활성을 제어하는 C-말단 촉매(CAT) 영역과 N-말단 조절(REG) 영역의 두 가지 기능 도메인으로 나눌 수 있습니다(그림 1A)8. REG 영역은 RAS 결합 도메인(RBD), 시스테인 풍부 도메인(CRD) 및 세린/트레오닌 풍부 영역(S/T-rich)을 포함합니다. 주목할 만하게도, S/T-rich 영역은 인산화 의존적 방식으로 14-3-3에 결합하는 N’ site를 포함한다(CRAF의 S259; 그림 1A) 8. CAT 도메인은 C’ 사이트라고 하는 두 번째 고친화성 14-3-3 도킹 사이트와 함께 키나아제 도메인을 포함합니다(CRAF의 S621; 그림 1A) 8. CRD와 함께 N’ 및 C’ 위치에 대한 이합체 14-3-3 단백질의 차별적 결합은 RAF 활성화 및 억제 9,10,11,12,13 모두에서 중요한 역할을 합니다. 정상적인 신호 전달 조건에서 RAF 활성화는 RAS에 의한 원형질막으로의 모집에 의해 시작되어 활성 이량체를 형성할 수 있으며, 그 중 BRAF-CRAF 이종이량체가 우세한 활성 형태14,15입니다. 이합체 BRAF의 극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 구조와 함께 BRAF 및 CRAF를 사용한 생화학 분석은 14-3-3 이량체가 두 RAF 양성체의 C’ 부위에 동시에 결합하여 활성 RAF 이량체를 안정화한다는 것을 나타냅니다(그림 1B)9,13,16,17. 반대로, 연구에 따르면 정지 조건에서 RAF는 REG 도메인이 CAT 도메인에 결합하고 그 활성을 억제하는 세포소질, 자동 억제 확인을 채택합니다 12,18,19,20. 이 닫힌 상태는 REG 도메인의 CRD 및 N’ 사이트와 CAT 도메인의 C’ 사이트에 결합된 14-3-3 이량체에 의해 안정화됩니다(그림 1B)10,13,21. BRAF에서 이 모델은 자가 억제 BRAF 단량체의 최근 Cryo-EM 구조와 이전 생화학 연구 10,12,13,21,22에 의해 지원됩니다. 그러나, 14-3-3은 CRAF 규정23에서 억제 역할을 하는 것으로 나타났지만, BRAF와 같은 자가억제 상태는 CRAF 규정12에서 더 적은 역할을 할 수 있다; 따라서 14-3-3 단백질이 CRAF 활성을 조절하는 메커니즘을 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요합니다. RAF kinase의 14-3-3-mediated regulation은 과다한 RAF 인산화 및 탈인산화 이벤트, 다양한 조절 단백질에 대한 결합, 원형질막과의 상호 작용을 필요로 한다8. 따라서 14-3-3-RAF 상호 작용은 생리학적으로 관련된 조건과 온전한 지질 이중층이 있는 상태에서 측정하는 것이 중요합니다.
이 문제를 해결하기 위해 NanoBRET(여기서는 N-BRET라고 함, 키트 세부 정보는 재료 표 참조) 기술을 활용하여 살아있는 세포에서 CRAF와 14-3-3 단백질의 상호 작용을 측정하기 위한 근접 기반 분석을 개발했습니다(그림 1C). 이 BRET 기반 시스템은 Halo618 에너지 수용체 리간드22,24로 라벨링하기 위해 한 단백질에는 나노루시페라아제(Nano) 공여체가 태그되고 다른 단백질에는 Halo 태그가 부착되는 두 관심 단백질(POI)의 상호 작용을 측정합니다. 관심 단백질의 상호 작용은 공여체에서 수용체로의 에너지 전달을 초래하며, 이는 다시 BRET 신호를 생성합니다(그림 1C). 매우 밝은 Nano donor 단백질(방출(em) 460nm) 및 Halo618 리간드(em 618nm)는 기존 BRET에 비해 더 큰 스펙트럼 분리 및 감도를 제공하므로 더 약한 상호 작용을 연구하고 결합24의 미묘한 변화를 감지하는 데 이상적인 플랫폼입니다. 실제로, 우리는 이전에 RAF REG 및 CAT 영역의 자가 억제 상호 작용을 측정하기 위한 N-BRET 기반 분석을 개발했으며, 이는 BRAF CRD에서 RASopathy 돌연변이 패널의 특성 분석에 필수적이었고 자가 억제를 유지하고 구성적 BRAF 활성화를 방지하는 데 이 영역의 중요한 중요성을 입증했습니다12.
여기에 설명된 분석은 N-말단 나노 태그(Nano-CRAF)에 융합된 CRAF와 C-말단 Halo 태그(14-3-3ζ-Halo; 그림 1C). 우리는 Nano-CRAF와 14-3-3ζ-Halo의 상호 작용이 강력한 BRET 신호를 생성하며, 이는 차례로 N’ site(S259A) 및/또는 C’ site(S621A)에 14-3-3 결합을 방지하는 돌연변이에 의해 중단될 수 있음을 보여줍니다. 다음 프로토콜은 이 분석을 수행, 최적화 및 문제 해결하기 위한 자세한 단계를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 연구에 따르면 14-3-3 단백질은 RAF 키나아제의 활성화와 억제 모두에 중요한 역할을 합니다. 이러한 결합 이벤트가 어떻게 조절되는지, 그리고 이러한 상호작용을 조절하는 것이 RAF 신호전달 및 RAF 주도 종양발생에 미치는 영향을 이해하면 CRAF 기능을 표적으로 하는 새로운 치료 취약성을 발견할 수 있습니다. 그러나, Raf 활성화 주기는 과다한 관련 단백질, 번역 후 변형(posttranslational modification…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립암연구소(National Cancer Institute, National Institutes of Health)의 연방 기금으로 일부 자금을 지원받았으며, 프로젝트 번호는 ZIA BC 010329입니다.
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
Referências
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