基于生物发光共振能量转移 （BRET） 的测定法，用于测量 CRAF 与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用
Summary
该方案描述了一种基于 BRET 的测定法，用于测量 CRAF 激酶与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用。该协议概述了准备细胞、读取 BRET 发射和数据分析的步骤。还提供了一个示例结果，其中确定了适当的对照和分析优化的故障排除。
Abstract
CRAF 是 RAS GTP 酶的主要效应子，在几种 KRAS 驱动的癌症的肿瘤发生中起关键作用。此外，CRAF 是种系突变的热点，种系突变被证明会导致发育性 RASopathy、Noonan 综合征。所有 RAF 激酶都包含 14-3-3 调节蛋白的多个磷酸化依赖性结合位点。14-3-3 与这些位点的差异结合在信号转导条件下质膜上活性 RAF 二聚体的形成和在静止条件下维持 RAF 自抑制中起着重要作用。了解这些相互作用如何被调节以及如何调节它们对于确定靶向 RAF 功能的新治疗方法至关重要。在这里，我描述了一种基于生物发光共振能量转移 （BRET） 的测定法，用于测量 CRAF 与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用。具体来说，该测定法测量了与纳米荧光素酶供体融合的 CRAF 和与 Halo 标签受体融合的 14-3-3 的相互作用，其中 RAF 和 14-3-3 的相互作用导致供体到受体的能量转移和 BRET 信号的产生。该方案进一步表明，该信号可以被显示阻止 14-3-3 与其每个高亲和力 RAF 停靠位点结合的突变破坏。该实验步骤描述了接种、转染和重新铺板细胞的程序，以及读取 BRET 发射、进行数据分析和确认蛋白质表达水平的详细说明。此外，还提供了示例分析结果以及优化和故障排除步骤。
Introduction
RAF 激酶 （ARAF、BRAF 和 CRAF） 是 RAS GTP 酶的直接效应子，也是促增殖/促存活 RAF-MEK-ERK 激酶级联反应的起始成员。最近的研究表明，CRAF 表达在几种 KRAS 驱动的癌症的肿瘤发生中起关键作用，包括非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌 1,2,3,4,5。此外，种系 CRAF 突变会导致一种特别严重的 RASopathy，即 Noonan 综合征 6,7。了解 CRAF 调节对于开发针对其在细胞中的功能的成功治疗方法至关重要。
所有 RAF 激酶均可分为两个功能结构域，即 C 端催化 （CAT） 结构域和 N 端调节 （REG） 结构域，用于控制其活性（图 1A）8。REG 结构域包括 RAS 结合结构域 （RBD）、富含半胱氨酸的结构域 （CRD） 和富含丝氨酸/苏氨酸的区域 （S/T 富集）。值得注意的是，富含 S/T 的区域包含 N’ 位点，该位点以磷酸化依赖性方式与 14-3-3 结合（CRAF 中的 S259;图 1A）8. CAT 结构域包括激酶结构域，以及第二个高亲和力 14-3-3 对接位点，称为 C’ 位点（CRAF 中的 S621;图 1A）8. 二聚体 14-3-3 蛋白与 N’ 和 C’ 位点的差异结合以及 CRD 在 RAF 激活和抑制中起关键作用 9,10,11,12,13。在正常信号转导条件下，RAF 激活是通过 RAS 募集到质膜而启动的，使其能够形成活性二聚体，其中 BRAF-CRAF 异二聚体是主要的活性形式14,15。使用 BRAF 和 CRAF 的生化测定以及二聚体 BRAF 的低温电子显微镜 （Cryo-EM） 结构表明，14-3-3 二聚体通过同时结合两个 RAF 原聚体的 C’ 位点来稳定活性 RAF 二聚体（图 1B）9,13,16,17。相反，研究表明，在静止条件下，RAF 采用胞质性、自抑制确认，其中 REG 结构域与 CAT 结构域结合并抑制其活性 12,18,19,20。这种闭合状态通过与 REG 结构域中的 CRD 和 N’ 位点以及 CAT 结构域中的 C’ 位点结合的 14-3-3 二聚体稳定（图 1B）10,13,21。在 BRAF 中，该模型得到了自体抑制 BRAF 单体的最新冷冻电镜结构以及我们之前的生化研究的支持 10,12,13,21,22。然而，虽然 14-3-3 在 CRAF 调节中起抑制作用23，但类似 BRAF 的自身抑制状态在 CRAF 调节中的作用可能较小12;因此需要进一步的研究来阐明 14-3-3 蛋白调节 CRAF 活性的机制。14-3-3 介导的 RAF 激酶调节需要大量的 RAF 磷酸化和去磷酸化事件、与各种调节蛋白的结合以及与质膜的相互作用8。因此，在生理相关条件下和存在完整脂质双层的情况下测量 14-3-3-RAF 相互作用至关重要。
为了解决这个问题，利用 NanoBRET（以下简称 N-BRET;试剂盒详情见材料表）技术开发了一种基于邻近度的测定法，用于测量 CRAF 与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用（图 1C）。这种基于 BRET 的系统可测量两种目标蛋白 （POI） 的相互作用，其中一种蛋白质用纳米荧光素酶 （Nano） 供体标记，另一种用 Halo 标签标记，以便用 Halo618 能量受体配体标记22,24。目标蛋白质的相互作用导致供体到受体的能量转移，进而产生 BRET 信号（图 1C）。与传统 BRET 相比，极亮的纳米供体蛋白（发射 （em） 460 nm）和 Halo618 配体 （em 618 nm） 可提供更高的光谱分离和灵敏度，使其成为研究较弱相互作用和检测结合细微变化的理想平台24。事实上，我们之前开发了一种基于 N-BRET 的测定法，用于测量 RAF REG 和 CAT 结构域的自抑制相互作用，这对于表征 BRAF CRD 中的一组 RASopathy 突变至关重要，并证明了该结构域对于维持自身抑制和防止组成型 BRAF 激活的至关重要12。
此处描述的测定法测量与 N 端纳米标签 （Nano-CRAF） 融合的 CRAF 和与 C 端 Halo 标签融合的 14-3-3 的 zeta 亚型（14-3-3ζ-Halo; 图 1C）。我们表明，Nano-CRAF 与 14-3-3ζ-Halo 的相互作用会产生强大的 BRET 信号，该信号反过来又可以被阻止 14-3-3 与 N’ 位点 （S259A） 和/或 C’ 位点 （S621A） 结合的突变破坏。以下方案提供了执行、优化和排除此分析的详细步骤。
Protocol
Representative Results
Discussion
先前的研究表明，14-3-3 蛋白在 RAF 激酶的激活和抑制中起关键作用。了解这些结合事件如何被调节以及调节这些相互作用对 RAF 信号转导和 RAF 驱动的肿瘤发生的影响可能会发现针对 CRAF 功能的新治疗脆弱性。然而，Raf 激活周期受到大量相关蛋白、翻译后修饰和亚细胞定位变化的支持8，因此，为了完全概括这些条件，必须在活细胞条件下测量 RAF 与其调节因子的相互作用。该协?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的联邦资金资助，项目编号为 ZIA BC 010329。
Materials
| Antibodies | |||
| HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
| NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
| CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
| ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
| Reagents | |||
| X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
| NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
| DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
| Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
| Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
| NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
| 5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
| Cell lines | |||
| 293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
| DNA vectors | |||
| pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| Equipment | |||
| EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
| Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
| Software | |||
| GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
| Other | |||
| ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
| Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |
Referências
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