Modèle murin d’insuffisance cardiaque induite par l’hyperlipidémie avec fraction d’éjection préservée

Summary

Ce protocole présente une approche détaillée de la réplication d’un modèle murin d’insuffisance cardiaque induite par l’hyperlipidémie avec fraction d’éjection préservée (ICFEp). La conception combine l’administration du virus adéno-associé 9-troponine cardiaque, du récepteur des lipoprotéines de basse densité T (AAV9-cTnT-LDLR) et du poloxamer-407 (P-407).

Abstract

La physiopathologie de l’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (ICFEp) due à la lipotoxicité n’est pas complètement comprise. Étant donné le besoin urgent de modèles animaux qui imitent avec précision l’ICFEp cardiométabolique, un modèle murin induit par l’hyperlipidémie a été mis au point par rétro-ingénierie des phénotypes observés chez les patients atteints d’ICFEp. Ce modèle visait à étudier l’ICFEp, en mettant l’accent sur l’interaction entre la lipotoxicité et le syndrome métabolique. L’hyperlipidémie a été induite chez des souris de type sauvage (WT) sur un fond de souche 129J par des injections intrapéritonéales bihebdomadaires de poloxamer-407 (P-407), un copolymère séquencé qui bloque la lipoprotéine lipase, associées à une injection intraveineuse unique du récepteur des lipoprotéines de basse densité du virus adéno-associé 9-cardiac troponin T-low-density (AAV9-cTnT-LDLR). Des évaluations approfondies ont été effectuées entre 4 et 8 semaines après le traitement, y compris l’échocardiographie, l’enregistrement de la pression artérielle, la pléthysmographie du corps entier, la télémétrie de l’échocardiographie (ECG), la surveillance de la roue d’activité (AWM) et les analyses biochimiques et histologiques. Les souris LDLR/P-407 présentaient des caractéristiques distinctives à quatre semaines, notamment une dysfonction diastolique, une fraction d’éjection préservée et une augmentation de l’épaisseur de la paroi ventriculaire gauche. Notamment, la pression artérielle et la fonction rénale sont restées dans les limites normales. De plus, l’ECG et l’AWM ont révélé des blocs cardiaques et une activité réduite, respectivement. La fonction diastolique s’est détériorée à huit semaines, accompagnée d’une baisse significative de la fréquence respiratoire. Une enquête plus approfondie sur le modèle de double traitement a révélé une fibrose élevée, des rapports poumons humides/secs et des rapports poids cardiaque/poids corporel. Les souris LDLR/P-407 présentaient des xanthélasmas, de l’ascite et une ischémie cardiaque. Fait intéressant, les morts subites sont survenues entre 6 et 12 semaines après le traitement. Le modèle murin de l’ICFEpH offre une ressource expérimentale précieuse et prometteuse pour élucider les subtilités du syndrome métabolique contribuant à la dysfonction diastolique dans le contexte de l’ICFEpP médiée par la lipotoxicité.

Introduction

L’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée (ICFEp) désigne un syndrome cardiométabolique accompagné de multiples comorbidités et représente plus de 50 % de tous les cas d’insuffisance cardiaque ^1,2. De plus, la fréquence de l’ICFEp n’a cessé d’augmenter au cours de la dernière^décennie3. Avec des options de traitement limitées, l’ICFEp représente la nécessité médicale non satisfaite la plus importante dans les maladies cardiovasculaires, compte tenu de sa physiopathologie à multiples facettes⁴. Il est donc urgent d’améliorer la compréhension des mécanismes sous-jacents et de la physiopathologie de l’ICFEp afin de mettre au point des traitements efficaces.

Malgré des progrès importants au cours des dernières années, la physiopathologie de l’ICFEp attribuée à la lipotoxicité n’est pas encore complètement comprise. Il est établi que les patients atteints d’ICFEp présentent une accumulation notable de lipides myocardiques par rapport à ceux atteints d’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection réduite (ICFEr) et de témoins sains⁵. Les données de séquençage de l’ARN provenant de biopsies cardiaques ont montré une régulation négative du gène de la lipoprotéine lipase (LPL) dans le groupe ICFEp par rapport^{aux patients sains} et ICFEr 6. Le poloxamer-407 (P-407) est un copolymère séquencé qui induit une hyperlipidémie en bloquant la LPL et en augmentant par la suite les triglycérides plasmatiques et le cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL)⁷. Des études antérieures ont démontré une expression élevée des récepteurs LDL (LDLR) dans le cœur des souris ICFEp⁸.

En s’appuyant sur ces résultats et en reconnaissant le besoin pressant de modèles animaux imitant fidèlement l’ICFEp cardiométabolique, un modèle murin induit par l’hyperlipidémie a été élaboré et présenté. Ce modèle a été conçu pour explorer l’ICFEp, en mettant explicitement l’accent sur l’implication de la lipotoxicité et du syndrome métabolique. Induit par l’hyperlipidémie/le blocage de la LPL et l’augmentation de l’expression cardiaque du LDLR, ce modèle a été établi chez des souris WT-129 sur un fond 129J par des injections intrapéritonéales (i.p.) bihebdomadaires de P-407 combinées à une injection intraveineuse unique (i.v.) du virus adéno-associé 9-troponine cardiaque T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)⁹.

Entre 4 et 8 semaines après le traitement, un large éventail d’évaluations a été effectué, englobant l’échocardiographie, l’enregistrement de la pression artérielle, la pléthysmographie du corps entier (WBP), la télémétrie par électrocardiographie continue (ECG), la surveillance de la roue d’activité (AWM), ainsi que des analyses biochimiques et histologiques⁹. À quatre semaines, les souris LDLR/P407 ou « double traitement » présentaient des caractéristiques distinctes de l’ICFEp, notamment une dysfonction diastolique, une fraction d’éjection préservée et une augmentation de l’épaisseur de la paroi ventriculaire gauche⁹. De plus, la télémétrie ECG et l’AWM ont révélé des blocages cardiaques et une activité réduite, respectivement. Notamment, la pression artérielle et la fonction rénale sont restées normales⁹. À huit semaines, la fonction diastolique s’est détériorée et les mesures de la WBP ont révélé une réduction de la fréquence respiratoire⁹.

Une exploration plus approfondie du modèle de double traitement a révélé une fibrose, des rapports pulmonaires humides/secs élevés et des rapports poids cardiaque/poids corporel⁹. L’autopsie a révélé une ascite, une ischémie cardiaque et des xanthélasmas. Curieusement, des morts subites ont été documentées entre 6 et 12 semaines après le traitement⁹. Ce modèle d’ICFEp induit par l’hyperlipidémie murine fournit un outil expérimental rapide, précieux et prometteur pour démêler les complexités du syndrome métabolique contribuant à la dysfonction diastolique avec ICFEp médiée par la lipotoxicité.

Protocol

Le protocole sur les animaux a été approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Miami, conformément aux directives du National Institute of Health (NIH) (protocole IACUC 23-103-ad03). Pour la présente étude, des souris de type sauvage (WT) sur fond 129J ont été acquises auprès d’une source commerciale (voir la table des matières) et élevées en interne. Toutes les souris étaient des compagnes de portée sur le fond 129J. Les expériences ont porté sur des souris mâles et femelles. L’administration d’une dose unique d’AAV9-cTnT-LDLR à la première semaine et d’une dose bihebdomadaire de p407 pendant quatre semaines. 1. Préparation et administration de l’AAV9-cTnT-LDLR REMARQUE : Le plasmide AAV9-cTNT-hLDLR (voir le tableau des matériaux) code pour la protéine LDLR humaine complète (2664bp) (Figure 1). Préparation de vecteur viral AAV-LDLREn fonction du nombre d’animaux, décongeler les flacons d’AAV9 sur de la glace pendant 20 minutes, puis diluer les particules d’AAV dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) pour obtenir une concentration de 1 x10 12 génomes/souris vecteurs dans 100 μL. Placez la solution virale dans une aiguille de 28 à 30 g à l’aide d’une seringue de 1 mL. Veillez à ne pas aspirer de bulles d’air dans l’aiguille. Procédures d’injection intraveineuse (i.v.) dans la veine caudaleAllumez l’oxygène jusqu’à 0,5 L/min et réglez le système d’anesthésie à l’isoflurane à 4 % à 5 %. Placez la souris dans la chambre d’induction pendant ~2 min, jusqu’à ce que l’animal ne réponde plus. Placez l’animal sur un illuminateur de queue de souris (par exemple, Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) et accueillez l’animal allongé sur le côté. Utilisez une anesthésie à l’isoflurane à 2 % à 3 % pour l’entretien.REMARQUE : L’échauffement par le dispositif de retenue provoquera une dilatation de la veine de la queue de la souris et, par conséquent, rendra l’injection beaucoup plus facile. Identifiez la veine latérale de la queue. Nettoyez la zone d’injection avec un antiseptique à l’aide d’un tampon de gaze. Tenez l’extrémité de la queue pour l’étendre et massez la queue de la souris avec les doigts jusqu’à ce que la veine soit visualisée. Insérez l’aiguille à un angle faible (angle de 10 à 15 degrés) et injectez 100 μL d’AAV dilué dans la veine de la queue (figure 2A). Retirez l’aiguille et appliquez une pression immédiate avec un doigt jusqu’à ce que le saignement cesse. Remettez la souris dans la cage d’origine. 2. Préparation et administration du P-407 Préparation du P-407Préparez la solution en diluant l’agent P-407 (voir le tableau des matériaux) avec du DPBS jusqu’à une concentration finale de 100 mg/mL à l’intérieur d’une hotte. Réfrigérer la solution à 4 °C pendant la nuit sur un rotateur pour faciliter la dissolution du P-40710. Procédure d’injection intrapéritonéale (i.p.) bihebdomadairePesez chaque souris le premier jour des injections i.p. À l’aide de la formule 1 g/kg, calculer la dose appropriée pour chaque souris en fonction des poids et des seringues de préremplissage. Sous une hotte, retenez manuellement la souris avec la tête et le corps inclinés vers le bas afin de repositionner les organes internes au niveau crânien. Cette technique évite la perforation des structures vitales à proximité. Identifiez la cavité péritonéale gauche dans le quadrant inférieur de l’abdomen, latéralement à la ligne médiane. Nettoyez le site avec un antiseptique. À un angle de 45 degrés ou moins, insérez l’aiguille dans la cavité péritonéale (Figure 2B). Aspirez la seringue pour assurer une insertion adéquate. S’il y a du sang ou du tissu lors de l’aspiration, retirez l’aiguille et répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4 jusqu’à ce que la seringue soit dégagée. Jetez l’aiguille dans le contenant approprié pour objets tranchants et remettez la souris dans la cage d’origine. 3. Évaluation de l’échocardiographie PréparationAppliquez la crème dépilatoire sur la poitrine et le haut de l’abdomen de la souris la veille ou plusieurs heures avant l’imagerie. Retirez la crème avec de la gaze humide après 2 min. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane à 2,5 % à 3,0 % à un débit de 0,8 L/min et maintenir avec de l’isoflurane à 1 % à 1,5 %. Ensuite, fixez la souris sur la plate-forme appropriée en position couchée avec les pattes sur des électrodes avec du gel conducteur et couvrez le nez et la bouche avec un cône nasal pour assurer une anesthésie continue avec de l’isoflurane. Vue parasternale dans le grand axeAvec la souris positionnée sur le dos, inclinez le côté droit de la plate-forme de 45 degrés. Ensuite, alignez en diagonale la sonde du transducteur dans le système de rails, en l’inclinant de 30 à 40 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre de l’extrémité supérieure droite à l’abdomen gauche pour obtenir et stocker des images en mode B. Analysez les images en mode B à l’aide d’un logiciel d’analyse par ultrasons (voir Tableau des matériaux) pour obtenir la fraction d’éjection (Figure 3A). Vue parasternale à axe courtFaites pivoter la sonde du transducteur dans le système de rail de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre pour obtenir et stocker des images en mode B et en mode M. Vue apicaleInclinez le coin supérieur gauche de la plate-forme vers le bas et vers la droite. Orientez le transducteur vers l’épaule droite de l’animal. Visualisez la valve mitrale en mode B et en mode Doppler couleur. Acquisition et stockage d’images Doppler à ondes pulsées (PW) et Doppler tissulaires5. Analysez les images Doppler PW et Doppler tissulaire à l’aide du logiciel d’analyse échographique pour obtenir l’IVRT, E/E’ et E/A (Figure 3B-E). 4. Enregistrement des données de la boucle pression-volume (PV) Effectuer des analyses hémodynamiques à la fin de l’étude pour évaluer la fonction systolique et diastolique du ventricule gauche (VG), en suivant la procédure décrite précédemment11,12.Commencez par induire la souris avec de l’isoflurane (3-5%, chambre d’induction). Lorsque l’action anesthésique commence, transférez l’animal sur le banc d’opération et maintenez l’anesthésie avec de l’isoflurane (1-3 %, masque facial). Faites une petite incision dans la peau au-dessus du cou pour permettre l’intubation endotrachéale (par la bouche). Aérer l’animal avec un mélange d’oxygène et d’isoflurane à l’aide d’un ventilateur pour rongeurs (p. ex., modèle Micro vent 848, appareil Harvard) réglé à un volume de ~0,15 à 0,2 mL et à une fréquence respiratoire de 120 à 170 respirations/min. Surveillez la température corporelle à ~37 °C ± 1 °C tout au long de la procédure à l’aide d’une table chirurgicale à température contrôlée. Exposez et canulez la veine jugulaire interne gauche avec une aiguille de 30 G pour l’administration d’un support hydrique. Coupez la peau sur le site du col ventral médian et exposez l’artère carotide. Après l’occlusion de la partie distale de l’artère carotide droite, faites une petite incision dans l’artère pour permettre l’introduction d’un cathéter à pression volumique (PV) à micro-pointes (voir le tableau des matériaux) dans le ventricule gauche (approche thoracique fermée). Enregistrez les boucles PV pendant l’état d’équilibre et l’occlusion de la veine cave inférieure. À la fin de l’expérience, euthanasier l’animal sans cruauté (sous anesthésie profonde) à l’aide d’une méthode AVMA approuvée (p. ex., isoflurane suivi d’une luxation cervicale). Analysez les données PV à l’aide du logiciel LabChart (voir Tableau des matériaux) et calibrez les volumes à l’aide de mesures échocardiographiques.

Representative Results

Après 4 semaines d’administration combinée d’une dose unique d’AAV9-cTnT-LDLR et d’une dose unique d’alcool et d’une dose unique bihebdomadaire d’administration de l’insurrection. Les injections de P-407 et l’échocardiographie ont révélé une ICFEp, comme en témoignent la fraction d’éjection préservée, le temps de relaxation intraventriculaire prolongé (IVRT) et E/E’ prolongé ainsi que la diminution de E/A (figure 3A-E). Une dysfonction diastolique plus grave a été observée après 8 semaines par rapport aux données après 4 semaines. L’analyse de l’anse pression-volume (PV) après 8 semaines de traitement a montré une augmentation de la pente de la relation pression-volume en fin de diastolique, corroborant les résultats de l’échocardiographie de dysfonction diastolique (Figure 3F). Notamment, la mort subite est survenue chez un nombre important de souris traitées par LDLR/P-407 entre 6 et 12 semaines après le traitement par LDLR/P-407 (figure 3G). Ces résultats indiquent une ICFEp cardiométabolique, confirmant l’efficacité de ce protocole et de la conception expérimentale. Une hyperlipidémie a été notée chez les souris traitées par LDLR/P407 à 4 et 8 semaines, comme en témoignent les taux élevés de cholestérol total, de triglycérides, de cholestérol à lipoprotéines de très basse densité (VLDL), de cholestérol à lipoprotéines de basse densité (LDL) et de cholestérol normal à lipoprotéines de haute densité, corroborant nos résultats d’hyperlipidémie (Figure 3H). Figure 1 : Carte plasmidique pour AAV9-cTnT-LDLR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Procédures d’injection. (A) Image représentative montrant l’injection intraveineuse (i.v.) dans la veine caudale d’AAV9-cTnT-LDLR chez une souris WT sur fond de souche 129J. (B) Illustration de l’injection intrapéritonéale de P-407 chez la souris WT sur le fond de la souche 129J précédemment traitée avec une dose intraveineuse unique d’AAV9-cTnT-LDLR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : ICFEp cardiométabolique (A-E) Paramètres d’échocardiographie indiquant une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (ICFEp) après 4 (n = 17) et 8 semaines (n = 11) de traitement par LDLR/P-407 par rapport aux souris non traitées (n = 15). Ceci est mis en évidence par la fraction d’éjection préservée, le temps de relaxation isovolumique prolongé (IVRT), l’augmentation de E/E’ et la réduction de E/A, tous des indicateurs de dysfonction diastolique. (F) L’acquisition et l’analyse de la boucle pression-volume ont révélé une augmentation de la pente de la relation pression-volume en fin de diastolique (EDPVR) après 8 semaines de traitement. (G) La mort subite est survenue entre 6 et 12 semaines après le traitement par LDLR/P-407. (H) Un panel lipidique a confirmé les résultats d’une hyperlipidémie chez les souris traitées par LDLR/P407 à 4 (n = 4) et à 8 semaines (n = 3), comme en témoignent les taux élevés de cholestérol total, de triglycérides, de lipoprotéines de très basse densité (VLDL), de cholestérol de lipoprotéines de basse densité (LDL) et de cholestérol normal de lipoprotéines de haute densité par rapport aux souris non traitées (n = 5). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Malgré l’augmentation constante de la prévalence de l’ICFEp au cours de la dernière décennie, il est encore difficile de comprendre concrètement la physiopathologie sous-jacente¹³. De plus, à ce jour, il existe peu de traitements fondés sur des données probantes¹³. Il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’ICFEp cardiométabolique. Auparavant, un modèle murin hyperlipidémique a été introduit qui imite l’ICFEp sans maladie rénale chronique (IRC) ni hypertension induite par les injections cardiaques de LDLR OE et de p407⁹.

Les résultats ont révélé que la combinaison d’un LDLR cardiaque OE et d’une hyperlipidémie entraîne une dysfonction diastolique, des arythmies, une hypertrophie ventriculaire gauche (VG), une intolérance à l’effort, une accumulation de lipides cardiaques et une fibrose chez les souris après quatre semaines, comme publié précédemment⁹. Une augmentation de l’absorption du cholestérol LDL dans le cœur, le foie et les muscles squelettiques et une diminution des triglycérides dans le cœur et le foie de ces souris ont également été observées⁹. L’avantage de cette méthode réside dans sa rapidité à étudier les voies du syndrome cardiométabolique, qui ne sont pas bien comprises par rapport à d’autres modèles murins d’ICFEp hyperlipidémiques, tels que le régime riche en graisses (HFD) qui nécessitent jusqu’à 16 et 20 semaines pour se développer¹⁴. Ce modèle prend quatre semaines à développer et imite les anomalies métaboliques chez l’homme. Par conséquent, la reproductibilité de ce modèle est essentielle.

Il est impératif d’assurer une préparation et une administration minutieuses des AAV9-cTnT-LDLR et P-407. La reproductibilité de ce modèle dépend fortement des calculs précis des concentrations et des doses de P-407 et d’AAV9-cTnT-LDLR, ainsi que des mesures de poids. Les préparations de solution et les techniques d’injection intraveineuse et intrapéritonéale appropriées sont tout aussi importantes. Les écarts dans ces techniques peuvent entraîner des altérations importantes et des résultats indésirables.

Malgré l’efficacité et l’efficience de ce modèle, plusieurs limites existent. Une formation rigoureuse est nécessaire pour effectuer des injections intraveineuses et intrapéritonéales. De plus, il existe un risque potentiel de morbidité et de mortalité associé aux injections intraveineuses et aux injections intrapéritonéales fréquentes. Des blessures à la queue de souris peuvent survenir lors d’injections intraveineuses, tandis qu’une ponction cæcale peut survenir avec des injections intrapéritonéales, entraînant une péritonite¹⁵. Ces blessures sont généralement dues à des techniques incorrectes et peuvent entraîner la perte de sujets expérimentaux et de traitements. Par conséquent, une formation approfondie est nécessaire avant d’effectuer ces procédures. Une autre limitation est l’accent mis par ce modèle sur la souche 129J. La raison du choix de la souche 129J découle d’études préliminaires qui ont révélé des résultats plus rapides de dysfonction diastolique et d’ICFEp chez cette souche par rapport aux souris C57BL/6 que nous avons initialement étudiées dans des enquêtes non publiées.

Quelles que soient ces limites, ce modèle permettra d’étudier plus rapidement les mécanismes sous-jacents de l’ICFEp et les options de traitement potentiellement efficaces. Des études antérieures ont mené à l’élaboration d’un modèle physiopathologique pour la HFD induite par l’ICFEP cardiométabolique et l’ester méthylique de N[w]-nitro-l-arginine (L-NAME) sur une période de 5 à 15 semaines¹³. Cependant, en raison de l’augmentation constante de la prévalence de l’ICFEp, il est urgent de mieux comprendre la physiopathologie de l’ICFEp cardiométabolique et de mettre au point un traitement efficace. Ce modèle murin d’OE LDLR cardiaque et d’hyperlipidémie induite par p407 est une méthode rapide et réalisable d’induction d’ICFEp cardiométabolique pour les efforts de recherche futurs.

Materials

Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory