Um modelo murino de insuficiência cardíaca induzida por hiperlipidemia com fração de ejeção preservada

Summary

Este protocolo apresenta uma abordagem detalhada para replicar um modelo murino de insuficiência cardíaca induzida por hiperlipidemia com fração de ejeção preservada (ICFEP). O projeto combina a administração do vírus adeno-associado 9-receptor de lipoproteína de baixa densidade T de troponina cardíaca (AAV9-cTnT-LDLR) e poloxâmero-407 (P-407).

Abstract

A fisiopatologia da insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) impulsionada pela lipotoxicidade não é completamente compreendida. Dada a necessidade urgente de modelos animais que imitem com precisão a ICFEP cardiometabólica, um modelo murino induzido por hiperlipidemia foi desenvolvido por fenótipos de engenharia reversa observados em pacientes com ICFEP. Este modelo teve como objetivo investigar a ICFEP, com foco na interação entre lipotoxicidade e síndrome metabólica. A hiperlipidemia foi induzida em camundongos do tipo selvagem (WT) em um fundo de cepa 129J por meio de injeções intraperitoneais quinzenais de poloxamer-407 (P-407), um copolímero em bloco que bloqueia a lipoproteína lipase, combinada com uma única injeção intravenosa de receptor de lipoproteína de baixa densidade T de troponina cardíaca do vírus adeno-associado 9 (AAV9-cTnT-LDLR). Avaliações extensivas foram realizadas entre 4 e 8 semanas após o tratamento, incluindo ecocardiografia, registro da pressão arterial, pletismografia de corpo inteiro, telemetria de ecocardiografia (ECG), monitoramento da roda de atividade (AWM) e análises bioquímicas e histológicas. Os camundongos LDLR / P-407 exibiram características distintas em quatro semanas, incluindo disfunção diastólica, fração de ejeção preservada e aumento da espessura da parede ventricular esquerda. Notavelmente, a pressão arterial e a função renal permaneceram dentro dos limites normais. Além disso, o ECG e a AWM revelaram bloqueios cardíacos e atividade reduzida, respectivamente. A função diastólica deteriorou-se em oito semanas, acompanhada por um declínio significativo nas frequências respiratórias. Uma investigação mais aprofundada sobre o modelo de tratamento duplo revelou fibrose elevada, relações pulmonares úmidas/secas e relações peso coração/peso corporal. Os camundongos LDLR/P-407 exibiram xantelasmas, ascite e isquemia cardíaca. Curiosamente, as mortes súbitas ocorreram entre 6 e 12 semanas após o tratamento. O modelo murino de ICFEP oferece um recurso experimental valioso e promissor para elucidar os meandros da síndrome metabólica que contribuem para a disfunção diastólica no contexto da ICFEP mediada por lipotoxicidade.

Introduction

A insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) denota uma síndrome cardiometabólica acompanhada de múltiplas comorbidades e constitui mais de 50% de todos os casos de insuficiência cardíaca ^1,2. Além disso, a frequência de ICFEP tem aumentado constantemente na última década³. Com opções de tratamento limitadas, a ICFEP representa a necessidade médica não atendida mais significativa na doença cardiovascular, dada sua fisiopatologia multifacetada⁴. Assim, existe uma necessidade urgente de melhorar a compreensão dos mecanismos subjacentes e da fisiopatologia da ICFEP para desenvolver terapias eficazes.

Apesar dos avanços significativos nos últimos anos, a fisiopatologia da ICFEP atribuída à lipotoxicidade permanece incompletamente compreendida. Está estabelecido que pacientes com ICFEP apresentam notável acúmulo de lipídios miocárdicos em comparação com aqueles com insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (ICFER) e controles saudáveis⁵. Os dados de sequenciamento de RNA de biópsias cardíacas mostraram regulação negativa do gene da lipoproteína lipase (LPL) no grupo ICFEP em comparação com os pacientes saudáveis e com ICFER⁶. O poloxâmero-407 (P-407) é um copolímero em bloco que induz hiperlipidemia bloqueando a LPL e, subsequentemente, aumentando os triglicerídeos plasmáticos e o colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL)⁷. Estudos anteriores demonstraram alta expressão do receptor de LDL (LDLR) no coração de camundongos com ICFEP⁸.

Com base nessas descobertas e reconhecendo a necessidade premente de modelos animais que mimetizem com precisão a ICFEP cardiometabólica, um modelo murino induzido por hiperlipidemia foi desenvolvido e apresentado. Este modelo foi adaptado para explorar a ICFEP, focando explicitamente no envolvimento da lipotoxicidade juntamente com a síndrome metabólica. Induzido por hiperlipidemia/bloqueio de LPL e aumento da expressão cardíaca de LDLR, este modelo foi estabelecido em camundongos WT-129 com fundo de 129J por meio de injeções intraperitoneais (i.p.) quinzenais de P-407 combinadas com uma única injeção intravenosa (i.v.) de troponina T-LDLR cardíaca do vírus adeno-associado 9-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)⁹.

Entre 4 e 8 semanas após o tratamento, foi realizada uma extensa gama de avaliações, abrangendo ecocardiografia, registros de pressão arterial, pletismografia de corpo inteiro (PCI), telemetria de eletrocardiografia contínua (ECG), monitoramento da roda de atividade (AWM), bem como análises bioquímicas e histológicas⁹. Em quatro semanas, os camundongos LDLR / P407 ou “tratamento duplo” exibiram características distintas de ICFEP, incluindo disfunção diastólica, fração de ejeção preservada e aumento da espessura da parede ventricular esquerda⁹. Além disso, a telemetria de ECG e AWM revelaram bloqueios cardíacos e atividade reduzida, respectivamente. Notavelmente, a pressão arterial e a função renal permaneceram normais⁹. Em oito semanas, a função diastólica se deteriorou e as medições da WBP revelaram taxas respiratórias reduzidas⁹.

Uma exploração mais aprofundada do modelo de tratamento duplo revelou fibrose, proporções pulmonares úmidas/secas elevadas e relações peso coração/peso corporal⁹. A necropsia revelou ascite, isquemia cardíaca e xantelasmas. Curiosamente, mortes súbitas foram documentadas entre 6 e 12 semanas após o tratamento⁹. Este modelo de ICFEP orientado por hiperlipidemia murina fornece uma ferramenta experimental rápida, valiosa e promissora para desvendar as complexidades da síndrome metabólica que contribuem para a disfunção diastólica com ICFEP mediada por lipotoxicidade.

Protocol

O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Miami, em conformidade com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH) (protocolo IACUC 23-103-ad03). Para o presente estudo, camundongos do tipo selvagem (WT) com fundo 129J foram adquiridos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais) e criados internamente. Todos os ratos eram irmãos de ninhada em fundo 129J. Os experimentos incluíram camundongos machos e fêmeas. O camundongo LDLR / P-407 HFpEF foi estabelecido administrando uma dose única de AAV9-cTnT-LDLR na primeira semana e p407 quinzenal por quatro semanas. 1. Preparação e administração de AAV9-cTnT-LDLR NOTA: O plasmídeo AAV9-cTNT-hLDLR (ver Tabela de Materiais) codifica a proteína LDLR humana completa (2664bp) (Figura 1). Preparação do vetor viral AAV-LDLRCom base no número de animais, descongele os frascos de estoque AAV9 no gelo por 20 min e, em seguida, dilua as partículas de AAV na solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco para obter uma concentração de 1 x 1012 genomas de vetor / camundongo em 100 μL. Coloque a solução viral em uma agulha de 28-30 G em uma seringa de 1 mL. Tenha cuidado para evitar puxar bolhas de ar para dentro da agulha. Procedimentos de injeção intravenosa (i.v.) da veia da caudaLigue o oxigênio até 0,5 L/min e ajuste o sistema de anestesia com isoflurano para 4%-5%. Coloque o camundongo na câmara de indução por ~ 2 min, até que o animal não responda. Coloque o animal em um limitador iluminador de cauda de rato (por exemplo, Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) e acomode o animal deitado de lado. Use anestesia com isoflurano a 2% -3% para manutenção.NOTA: O aquecimento pelo dispositivo de retenção causará dilatação da veia da cauda do camundongo e, portanto, facilitará significativamente a injeção. Identifique a veia lateral da cauda. Limpe a área de injeção com um anti-séptico usando uma gaze. Segure a ponta da cauda para estendê-la e massageie a cauda do rato com os dedos até que a veia seja visualizada. Insira a agulha em um ângulo baixo (ângulo de 10-15 graus) e injete 100 μL de AAV diluído na veia da cauda ( Figura 2A ). Retire a agulha e aplique pressão imediatamente com um dedo até que o sangramento pare. Retorne o mouse para a gaiola original. 2. P-407 preparação e administração Preparação do P-407Preparar a solução diluindo o agente P-407 (ver Tabela de Materiais) com DPBS até uma concentração final de 100 mg/ml no interior de uma hotte. Refrigerar a solução a 4 °C durante a noite num rotador para facilitar a dissolução do P-40710. Procedimento de injeção intraperitoneal (i.p.) quinzenalPese cada camundongo no primeiro dia de injeções intravenosas. Utilizando a fórmula 1 g/kg, calcular a dose adequada para cada ratinho de acordo com os pesos e as seringas pré-cheias. Sob uma hotte, prenda manualmente o mouse com a cabeça e o corpo inclinados para baixo para reposicionar os órgãos internos cranialmente. Esta técnica evita a punção de estruturas vitais nas proximidades. Identifique a cavidade peritoneal esquerda no quadrante inferior do abdome, lateral à linha média. Limpe o local com um anti-séptico. Em um ângulo de 45 graus ou menos, insira a agulha na cavidade peritoneal (Figura 2B). Aspire a seringa para garantir a inserção adequada. Se houver sangue ou tecido na aspiração, retire a agulha e repita as etapas 2.2.2 a 2.2.4 até que a seringa esteja limpa. Descarte a agulha no recipiente apropriado para objetos cortantes e retorne o mouse à gaiola original. 3. Avaliação ecocardiográfica PreparaçãoAplique o creme depilatório no tórax e na parte superior do abdômen do camundongo no dia anterior ou várias horas antes da imagem. Retire o creme com gaze úmida após 2 min. Anestesiar o camundongo com 2,5%-3,0% de isoflurano a 0,8 L/min de vazão e manter com 1%-1,5% de isoflurano. Em seguida, prenda o mouse na plataforma apropriada em decúbito dorsal com as patas em eletrodos com gel condutor e cubra o nariz e a boca com um cone nasal para garantir anestesia contínua com isoflurano. Visão paraesternal de eixo longoCom o mouse posicionado em decúbito dorsal, incline o lado direito da plataforma em 45 graus. Em seguida, alinhe diagonalmente a sonda do transdutor no sistema de trilhos, inclinando-a 30-40 graus no sentido horário da extremidade superior direita para o abdômen esquerdo para obter e armazenar imagens no modo B. Analise as imagens do modo B usando o software de análise de ultrassom (consulte a Tabela de Materiais) para obter a fração de ejeção (Figura 3A). Visão paraesternal de eixo curtoGire a sonda do transdutor no sistema de trilhos 90 graus no sentido horário para obter e armazenar imagens nos modos B e M. Vista apicalIncline o canto superior esquerdo da plataforma para baixo e para a direita. Oriente o transdutor em direção ao ombro direito do animal. Visualize a válvula mitral no modo B e no modo Doppler colorido. Adquirir e armazenar imagens Doppler de onda pulsada (PW) e Doppler tecidual5. Analise as imagens do PW Doppler e do Doppler tecidual usando o software de análise de ultrassom para obter o IVRT, E/E’ e E/A (Figura 3B-E). 4. Gravação de dados do loop de pressão-volume (PV) Realizar análises hemodinâmicas ao final do estudo para avaliar a função sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo (VE), seguindo o procedimento descrito anteriormente11,12.Comece induzindo o camundongo com isoflurano (3-5%, câmara de indução). Quando a ação anestésica for iniciada, transferir o animal para a bancada cirúrgica e manter a anestesia com isoflurano (1-3%, máscara facial). Faça uma pequena incisão na pele sobre o pescoço para permitir a intubação endotraqueal (pela boca). Ventile o animal com uma mistura de oxigênio e isoflurano usando um ventilador de roedores (por exemplo, Micro vent modelo 848, Harvard Apparatus) ajustado para ~ 0,15-0,2 mL de volume e a frequência respiratória em 120-170 respirações / min. Monitore a temperatura corporal a ~37 °C ± 1 °C durante todo o procedimento usando uma mesa cirúrgica com temperatura controlada. Exponha e canule a veia jugular interna esquerda com uma agulha 30 G para administração de suporte a fluidos. Corte a pele sobre o local do colo ventral mediano e exponha a artéria carótida. Após a oclusão da porção distal da artéria carótida direita, faça um pequeno corte na artéria para permitir a introdução de um cateter de volume de pressão (PV) com microponta (ver Tabela de Materiais) no ventrículo esquerdo (abordagem de tórax fechado). Grave loops PV durante a oclusão do estado estacionário e da veia cava inferior. No final do experimento, eutanasiar humanamente o animal (sob anestesia profunda) usando um método AVMA aprovado (por exemplo, isoflurano seguido de luxação cervical). Analise os dados de PV usando o software LabChart (consulte a Tabela de Materiais) e calibre os volumes usando medições ecocardiográficas.

Representative Results

Após 4 semanas de dose única combinada i.v. AAV9-cTnT-LDLR e i.p. quinzenalmente P-407, o ecocardiograma revelou ICFEP, evidenciada pela fração de ejeção preservada, tempo prolongado de relaxamento intraventricular (TRIV) e E/E’, bem como diminuição da E/A (Figura 3A-E). Pior disfunção diastólica foi observada após 8 semanas quando comparada com os dados após 4 semanas. A análise da alça pressão-volume (VP) após 8 semanas de tratamento mostrou um aumento da inclinação da relação pressão-volume diastólica final, corroborando os achados ecocardiográficos de disfunção diastólica (Figura 3F). Notavelmente, a morte súbita ocorreu em um número significativo de camundongos tratados com LDLR / P-407 entre 6 e 12 semanas após o tratamento com LDLR / P-407 ( Figura 3G ). Esses resultados indicam ICFEP cardiometabólica, confirmando a eficácia desse protocolo e desenho experimental. Hiperlipidemia foi observada em camundongos tratados com LDLR/P407 em 4 e 8 semanas, evidenciada por colesterol total elevado, triglicerídeos, lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e níveis normais de colesterol de lipoproteína de alta densidade, corroborando nossos achados de hiperlipidemia (Figura 3H). Figura 1: Mapa de plasmídeo para AAV9-cTnT-LDLR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Procedimentos de injeção. (A) Imagem representativa demonstrando a injeção intravenosa (i.v.) na veia da cauda de AAV9-cTnT-LDLR em camundongo WT com fundo de cepa 129J. (B) Ilustração da injeção intraperitoneal de P-407 em camundongo WT em fundo de cepa 129J previamente tratado com dose única intravenosa de AAV9-cTnT-LDLR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: ICFEP cardiometabólica. (A-E) Parâmetros ecocardiográficos indicando insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP) após 4 (n = 17) e 8 semanas (n = 11) de tratamento com LDLR / P-407 em comparação com camundongos não tratados (n = 15). Isso é evidenciado pela fração de ejeção preservada, tempo de relaxamento isovolumétrico prolongado (IVRT), aumento de E/E’ e E/A reduzido, todos indicadores de disfunção diastólica. (F) A aquisição e análise da alça de pressão-volume revelou aumento da inclinação da relação pressão-volume diastólica final (EDPVR) após 8 semanas de tratamento. (G) A morte súbita ocorreu entre 6 e 12 semanas após o tratamento com LDLR / P-407. (H) Um painel lipídico apoiou os achados de hiperlipidemia em camundongos tratados com LDLR / P407 em 4 (n = 4) e 8 semanas (n = 3), conforme evidenciado por colesterol total elevado, triglicerídeos, lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e níveis normais de colesterol de lipoproteína de alta densidade em comparação com camundongos não tratados (n = 5). Os dados são representados como ± média DP. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Apesar do aumento constante na prevalência de ICFEP na última década, uma compreensão concreta da fisiopatologia subjacente permanece^indefinida13. Além disso, a partir de hoje, existe uma terapia baseada em evidências limitada¹³. É necessária uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na ICFEP cardiometabólica. Anteriormente, foi introduzido um modelo de camundongo hiperlipidêmico que mimetiza ICFEP sem doença renal crônica (DRC) nem hipertensão induzida por injeções cardíacas de LDLR OE e p407⁹.

Os achados revelaram que a combinação de LDLR OE cardíaco e hiperlipidemia resulta em disfunção diastólica, arritmias, hipertrofia ventricular esquerda (VE), intolerância ao exercício, acúmulo de lipídios cardíacos e fibrose em camundongos após quatro semanas, conforme publicado anteriormente⁹. Um aumento na captação de colesterol LDL nos corações, fígado e músculos esqueléticos e diminuição dos triglicerídeos nos corações e fígado desses camundongos também foram observados⁹. A vantagem desse método reside em sua rapidez para investigar as vias da síndrome cardiometabólica, que não são bem compreendidas em comparação com outros modelos de camundongos hiperlipidêmicos com ICFEP, como a dieta hiperlipídica (HFD), que requer até 16 e 20 semanas para se desenvolver¹⁴. Este modelo leva quatro semanas para se desenvolver e imita anormalidades metabólicas em humanos. Portanto, a reprodutibilidade desse modelo é essencial.

É imperativo garantir a preparação e administração completas de AAV9-cTnT-LDLR e P-407. A replicabilidade deste modelo é altamente dependente de cálculos precisos das concentrações e doses de P-407 e AAV9-cTnT-LDLR, bem como medições de peso. Igualmente importantes são as preparações da solução e as técnicas adequadas de injeção intravenosa e intraperitoneal. Desvios nessas técnicas podem resultar em alterações significativas e resultados indesejados.

Apesar da eficácia e eficiência desse modelo, existem várias limitações. É necessário treinamento rigoroso para realizar injeções intravenosas e intraperitoneais. Além disso, existe um risco potencial de morbidade e mortalidade associado a injeções intravenosas e intraperitoneais frequentes. Lesões na cauda do camundongo podem ocorrer ao realizar injeções intravenosas, enquanto a punção cecal pode ocorrer com injeções intraperitoneais, levando à peritonite¹⁵. Essas lesões são normalmente devidas a técnicas incorretas e podem resultar na perda de sujeitos experimentais e tratamento. Portanto, é necessário um treinamento extensivo antes de realizar esses procedimentos. Outra limitação é o foco deste modelo na cepa 129J. A lógica por trás da escolha da cepa 129J decorre de estudos preliminares que produziram achados mais rápidos de disfunção diastólica e ICFEP nesta cepa em comparação com os camundongos C57BL / 6 que estudamos inicialmente em investigações não publicadas.

Independentemente dessas limitações, esse modelo permitirá investigações mais rápidas sobre os mecanismos subjacentes envolvidos na ICFEP e possíveis opções de tratamento eficazes. Estudos anteriores levaram ao desenvolvimento de um modelo fisiopatológico para HFD induzida por ICFEP cardiometabólica e éster metílico de N[w]-nitro-l-arginina (L-NAME) durante 5-15 semanas¹³. No entanto, devido ao aumento constante na prevalência de ICFEP, há uma necessidade urgente de maior compreensão da fisiopatologia da ICFEP cardiometabólica e do desenvolvimento de terapia eficaz. Este modelo murino de LDLR OE cardíaco e hiperlipidemia induzida por p407 é um método rápido e viável de induzir ICFEP cardiometabólica para futuros empreendimentos de pesquisa.

Materials

Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory