Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man genererer menneskelige bugspytkirtelskiver fra afdøde organdonorer for at studere cellefunktion under næsten fysiologiske forhold. Denne innovative tilgang muliggør undersøgelse af normale og strukturelt beskadigede øer og det indviklede samspil mellem endokrine og eksokrine rum.
Abstract
Det er afgørende at studere den menneskelige bugspytkirtel for at forstå de patofysiologiske mekanismer forbundet med type 1 (T1D) og 2 diabetes (T2D) samt bugspytkirtlen, endokrine og eksokrine fysiologi og samspil. Meget er blevet lært af undersøgelsen af isolerede bugspytkirteløer, men dette forhindrer undersøgelse af deres funktion og interaktioner i sammenhæng med hele vævet. Bugspytkirtelskiver giver en unik mulighed for at udforske fysiologien af normale, betændte og strukturelt beskadigede øer i deres oprindelige miljø, hvilket igen tillader undersøgelse af interaktioner mellem endokrine og eksokrine rum for bedre at undersøge den komplekse dynamik i bugspytkirtelvæv. Således repræsenterer vedtagelsen af den levende bugspytkirtelskiveplatform et betydeligt fremskridt på området. Denne protokol beskriver, hvordan man genererer levende vævsskiver fra afdøde organdonorer ved vævsindlejring i agarose- og vibratomskæring samt deres udnyttelse til at vurdere funktionelle aflæsninger såsom dynamisk sekretion og levende cellebilleddannelse.
Introduction
Undersøgelser af øfysiologi er grundlæggende for at forstå patogenesen af diabetes og udvikle nye terapeutiske tilgange. Indtil videre har forskning været afhængig af isolerede øer, som udsætter øerne for mekaniske og enzymatiske belastninger, hvilket sandsynligvis forårsager ændringer i cellefysiologi; Desuden er det ikke muligt at evaluere øfunktionen i sammenhæng med deres naturlige vævsmiljø, som sandsynligvis påvirkes af eksokrine og vaskulære celler blandt andet1. Når man studerer bugspytkirtlen fra donorer med T1D, er der den udfordring, at deres øer er vanskelige at isolere og kan blive fragmenteret under isolationen, hvilket kan give en selektionseffekt på øer, der muligvis ikke repræsenterer befolkningen in vivo2. Desuden vil øer blive adskilt fra deres komplekse miljø og cellulære forbindelser, især fra de infiltrerende immunceller, der findes i betændte øer og er mere rigelige i øens periferi. Mens isolerede øer er et hjørnestensværktøj i diabetesforskning, er der således begrænsninger. Som svar introducerer vi en banebrydende protokol til generering af levende bugspytkirtelskiver, der tilbyder en løsning på disse udfordringer.
Den seneste udvikling og vedtagelse af pancreas væv slicing teknikker betragtes som et gennembrud for vores evne til at udforske den indviklede biologi og funktioner i bugspytkirtlen. Denne innovation har åbnet nye veje for dynamiske studier af øfysiologi og interaktioner mellem endokrine, eksokrine og neurale, vaskulære og immunceller inden for deres naturlige anatomiske kontekst. I modsætning til konventionelle tilgange bevarer denne in vitro-indstilling meget af organets cytoarkitektur, hvilket giver mulighed for en tættere tilnærmelse til dets oprindelige biologi. Denne metode, der oprindeligt blev udviklet i mus af Speier og Rupnik i 20033, har vist sin anvendelighed til at vurdere calciumbilleddannelse, elektrofysiologi og hormonsekretion til både intra- og intercellulær signalering 4,5,6,7,8,9. Skiveplatformen i bugspytkirtlen blev derefter anvendt til undersøgelse af humant bugspytkirtelvæv opnået via kirurgisk biopsi 4,10,11,12. Vores gruppe demonstrerede muligheden for at opnå og udnytte bugspytkirtelskiver fra kadaveriske organdonorer gennem aktiviteten i netværket for pancreas organdonorer med diabetes (nPOD)13. nPOD leverer bugspytkirtelvæv til godkendte efterforskere, der udfører forskning om human type 1-diabetes, og siden vedtagelsen af bugspytkirtelskiveplatformen genererer og distribuerer nPOD rutinemæssigt levende bugspytkirtelskiver 14,15,16,17. Siden implementeringen af bugspytkirtelskiveplatformen i 2020 har nPOD med succes distribueret vævsskiver fra 43 donorer (inklusive 12 donorer med T1D) til adskillige efterforskere. Ved hjælp af disse skiver udførte forskere banebrydende forskning om kritiske aspekter af øfunktion og udforskede samspillet mellem øer og vaskulaturen, nervesystemet og immuncellerne i forbindelse med T1D 13,18,19,20,21,22,23,24. Talrige undersøgelser har fremhævet begrænsningerne ved traditionelle tilgange og understreget betydningen af teknikker, der kan fange det dynamiske samspil i bugspytkirtlen 25,26,27. Tilpasningsevnen af udskæringsteknikker fra mus til menneskelig bugspytkirtel kombineret med deres integration i programmer som Network for Pancreas Organ Donors with Diabetes (nPOD) eksemplificerer den voksende anerkendelse af metodens potentiale til at låse op for værdifuld indsigt i sygdomme som type 1-diabetes.
Protocol
Humane bugspytkirtelsektioner fra vævsdonorer af begge køn blev opnået via vævsbanken Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD), University of Florida. Organvæv fra afdøde personer uden identifikatorer er blevet bestemt til at være ikke-menneskelige forsøgspersoner forskning i overensstemmelse med organdonationslove og -bestemmelser og klassificeret som ikke-menneskelige emner af University of Florida Institutional Review Board (IRB; IRB nr. 392-2008), der giver afkald på behovet for samtykke. nPOD-væv, der specifikt blev brugt til dette projekt, blev godkendt som ikke-menneskeligt af University of Florida IRB (IRB20140093).
BEMÆRK: For læsere, der er helt nye inden for skiveteknikken og dens anvendelser, såsom perifusion og calciumbilleddannelse, kan det være tilrådeligt at få praktisk erfaring og udvikle grundlæggende færdigheder ved hjælp af muse- eller rotteskiver 3,28, før de arbejder med menneskelige prøver.
1. Forberedelser
BEMÆRK: Disse præparater skal udføres før vævsankomst.
- Forbered HEPES-buffer ved at blande 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, 2 mM L-alanin, L-arginin og L-glutamin. Juster pH til 7,4 og filtrer steriliser.
- Tilsæt glukose og eller andre stimuli til bufferen for at forberede opløsninger til perifusionseksperiment. Til baseline buffer tilsættes 5,5 mM glucose. Denne buffer vil blive brugt til udskæringsprocedurer, skiveopsamling og perifusionspræparater.
- Forbered mindst to retter til skiveopsamling ved at tilsætte aprotinin (10 μg/ml) til baselinebufferen.
- Der fremstilles 3,8 % agaroseopløsning med lavt smeltepunkt i HEPES-buffer uden BSA og aminosyrer (125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mMCaCl2, 1 mMMgCl2, 25 mM HEPES), og den opbevares ved 37 °C.
- Saml vibratumet ved at placere et nyt blad i holderen. Indstil knivvinklen, hvis det er relevant, til 15° (hvis du bruger Leica VT1200S). Hvis det er relevant, kalibreres vibratumet.
- Tænd perifusionsmaskinen, vælg antal kamre og programprotokol.
- Anbring alle nødvendige opløsninger i perifusionsmaskinen, klargør systemet og hold opløsningerne opvarmede. Maskinen beregner de nødvendige volumener af hver opløsning, der bruges til protokollen.
2. Behandling af væv
BEMÆRK: Udsnit skal genereres umiddelbart efter modtagelsen. Enhver forsinkelse kan forårsage vanskeligheder i proceduren og føre til nedbrydning af væv.
- Anbring bugspytkirtelvæv i en skål med baselinebuffer under et stereomikroskop (figur 1A). Fjern forsigtigt bindevæv, fibrotisk og fedtvæv ved hjælp af tang og saks.
- Skær væv i flere små stykker på ca. 0,5 cm3 (figur 1B) ved hjælp af en saks eller en skalpel. Blot tørre bugspytkirtelstykker på silkepapir.
- Overfør 4 stykker til en 35 mm petriskål og fyld skålen med agaroseopløsning, indtil alle stykker er helt nedsænket. Lad agarose størkne fuldt ud.
- Skær forsigtigt stykker ud af agarose. Kør skalpellen langs kanten af skålen for at fjerne agarose og adskil forsigtigt vævsblokke. Sørg for, at stykkerne er omgivet af et tyndt lag agarose.
3. Udskæring
- Lim vævsstykker på vibratomens metalplade ved at placere dem på hovedet.
- Monter pladen i bakken, og fyld bakken med baselinebuffer (HEPES indeholdende 5,5 mM baseline glucose).
- Indstil vibratome til automatiseret udskæring ved 120 μm, og juster start- og slutposition.
- Flyt bladet kort over vævet, og begynd at skære med langsom hastighed (0,1 mm / s) og amplitude ved 0,8 mm. Hastigheden kan øges, hvis vævet tillader det (figur 1C).
- Saml skiver ved hjælp af buede tang eller en lille børste. Akkumuler skiver i baselinebuffer indeholdende aprotinin (figur 1D).
- Lad skiverne hvile i mindst 1 time i baselinebuffer med aprotinin. Placer skiver på en langsom orbitalryster for at tillade skylning ud af enzymer, der frigives ved skæreproceduren.
4. Levende/død analyse
BEMÆRK: Dette er et valgfrit assay, der viser levedygtighed af vævsskiver efter proceduren. Skiver kan dog ikke genbruges, når de er farvet.
- Overfør en enkelt skive i en brønd fyldt med baselinebuffer.
- Tilsæt fluoresceindiacetat (FDA, 50 μg/ml), inkuber i 1 min ved stuetemperatur og beskyt mod lys.
- Tilsæt propidiumiodid (PI,50 μg/ml), inkuber i 1 min ved stuetemperatur og beskyt mod lys.
- Overfør skiven til en anden brønd fyldt med PBS for at vaske i 1 min.
- Overfør skiver til en petriskål eller monter på et glasglas med dæksel til billeddannelse (figur 2A, B).
5. Perifusion
BEMÆRK: Denne protokol beskriver, hvordan man udfører dynamisk perifusion for vævsskiver, men den er også velegnet til isolerede øer. Økamre skal klargøres med filterpapir og perleopløsning, inden holmene lægges i, som beskrevet i maskinens brugervejledning. Imidlertid kan holm- og skivekammer bruges sammen i samme eksperiment.
- Vælg 3 skiver og trim agaroseen ned til et minimum under et stereomikroskop ved hjælp af børste og skalpel.
- Tilsæt en dråbe baselinebuffer (HEPES indeholdende 5,5 mM baseline glucose) på risten i skivekammeret, og placer forsigtigt en skive på gitteret. Gentag for hver af de 3 udsnit (figur 3A). Hvis skiverne er meget små, skal du stable mere end 3 kamre for at øge antallet af øer. Anbring ikke mere end én skive pr. kammer.
BEMÆRK: Antallet af holme pr. skive varierer meget mellem donorer og afhænger af skivestørrelse (10-100 holme / skive). I alt 3 skiver har vist sig tilstrækkelige til at måle både insulin og glukagonsekretion. - For isolerede øer skal du bruge mindst 30 øer pr. Kolonne til insulinsekretion. Anbefales at bruge 100 øer til glukagondetektion. Saml individuelle skivekammerdele fra top til bund.
- Tilslut skivekammeret til ind- og udstrømningsslangen i maskinen, og start protokollen (figur 3C).
- Brug kammeropvarmning og bakkekølepumpe under protokollen. Opsamlingspladerne udskiftes under forsøgsprotokollen, og indtil da opbevares ved 4 °C, hvis kvantificeringen foretages samme dag, eller indtil da opbevares ved -80 °C.
- Når protokollen er færdig, skal du fjerne kamre, adskille og samle skiver til lysis (3% HCI i absolut ethanol) eller fiksering (i 4% paraformaldehyd).
- Rengør maskinen ved at skylle den med vand, 10% blegemiddel, vand og luft.
- Kvantificer hormonsekretion ved hjælp af kommercielt tilgængelige detektionssæt.
BEMÆRK: Figur 4 viser absolutte niveauer af insulin og glukagonsekretion på 3 skiver for at estimere koncentrationsområder.
6. Billeddannelse af calcium
- Forbered calciumfarvestof (f.eks. Fluo4-AM, Calbryte) opløsning i henhold til producentens anvisninger.
- Fortynd farvestof i baseline HEPES bufferopløsning og tilsæt aprotinin (10 μg / ml).
- Overfør en enkelt skive og inkuber i 30-60 minutter på en orbitalryster ved stuetemperatur og beskyt mod lys.
- Under inkubationstiden skal du forberede skivebilleddannelse ved at fylde perifusionssprøjterne og grunding af slanger (figur 5A, B).
- Tilslut alle enheder, tænd for varmeapparatet, og start pumpeflowet. Anbefales at bruge både in-flow opvarmning og platformvarmer og strømningshastighed på 0,5 ml / min.
- Placer forsigtigt en enkelt skive i billedkammeret og fastgør den ved hjælp af en harpe.
- Brug et mål med lav forstørrelse til at identificere billedområdet. Brug af refleksion hjælper med at identificere øområdet (figur 5C).
- Skift til et højere forstørrelsesmål (f.eks. 20x eller 40x), og juster positionen i henhold til eksperimentel opsætning.
BEMÆRK: For at sikre optimal cellelevedygtighed og øintegritet anbefales det, at de optiske sektioner skal være 1-2 cellelag under skærefladen. - Indstil z-stack og eller flisescanningsposition. Indstil billedinterval og optagevarighed. Her blev en opløsning på mindst 256 x 256 brugt til at tillade diskrimination af individuelle celler, et billeddannelsesinterval på 5-10 s og et z-stack-område (hvis relevant) på 30-60 μm med et interval på 10 μm mellem planer (et cellelag). Se Figur 6 for detaljerede billedindstillinger.
BEMÆRK: Indstil billedparameteren for at få den bedste opløsning og det maksimale areal, men undgå blegning af prøven. - Start billeddannelse og skift opløsningsindstrømning i henhold til eksperiment. Når du er færdig, saml skiver og fastgør dem til immunhistokemi.
Representative Results
Når protokollen udføres med succes, giver 1 g bugspytkirtelvæv ca. 100-200 skiver. Derefter skal disse skiver gennemgå stereomikroskopinspektion for at identificere dem, der er rige på holme, inden de fortsætter med funktionelle vurderinger. Levedygtighed, bestemt ved mærkning med fluoresceindiacetat (FDA) og propidiumiodid (PI), forventes at nå 80% -90% (figur 2A). Levedygtigheden kan være betydeligt lavere på skærefladen på grund af celleskader under udskæringsprocessen. I levedygtige skiver observeres dynamisk hormonsekretion (figur 2B), hvilket resulterer i robust insulinfrigivelse ved eksponering for høj glukose- og membrandepolarisering med kaliumchlorid (KCl).
Omvendt, når der er forsinkelser under udskæringsproceduren, eller vævskvaliteten ikke er optimal, adskiller resultaterne sig betydeligt. Antallet af opnåede skiver kan falde, og levedygtighedsvurderingen kan indikere en højere andel af ikke-levedygtige celler mærket med PI (figur 2C). I disse tilfælde indikerer den funktionelle vurdering et formindsket eller endog fraværende respons på høj glukose- og membrandepolarisering (figur 2D). Data fra suboptimale eksperimenter illustrerer vigtigheden af præcis udførelse i tide og vævskvalitet, da de kan føre til nedsat vævslevedygtighed og nedsat funktionalitet. Disse negative resultater tjener som en værdifuld påmindelse om de kritiske faktorer, der skal overvejes i succesen med denne metode.
Almindelige fund i calciumbilleddannelse visualiseres som et varmekort, som afbildet i figur 5D, eller som separate spor for individuelle celler, som vist i figur 5E. Det er vigtigt at understrege, at farvestoffet mærker alle celletyper uden forskel, hvorfor specifikke stimuli er afgørende for at skelne celler baseret på deres reaktioner. For at identificere levedygtige celler anvender vi KCl og sorterer cellerne baseret på svar, der overstiger det gennemsnitlige baseline-respons med mere end to standardfejl. Desuden kan skiver fastgøres og farves, hvilket muliggør identifikation af celletyper.
Figur 1: Behandling og udskæring af væv. A) 1 g uforarbejdet bugspytkirtelvæv. (B) Rengjorte bugspytkirtelstykker klar til agaroseindlejring. C) Udskæring ved hjælp af et vibraatom. (D) Friskskårne skiver af menneskelig bugspytkirtel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Data om vævslevedygtighed og insulinsekretion. (A) Repræsentative billeder for levedygtige vævsskiver. Maksimal intensitetsprojektion af reflekteret laserlys (grå, øverst til venstre), PI for døde celler (rød, nederst til venstre), FDA for levende celler (grøn, nederst til højre) og flettede billeder for levende og døde celler (øverst til højre). Stiplet linje angiver en holm. Skalastang 50 μm. (B) Dynamisk insulinsekretion af humane skiver af bugspytkirtelvæv fra en enkelt ikke-diabetisk donor. Insulinkinetikken viser en første fase peak respons efter 6 min høj glukosestimulering, efterfulgt af en plateau anden fase. Data normaliseres til den gennemsnitlige baselinesekretion ved 5,5 mM glucose (stimuleringsindeks, foldændring). Der er udført sekretion på skiver fra samme donor som vist i (A). C) Repræsentative billeder for ikke-levedygtige vævsskiver. Maksimal intensitetsprojektion af reflekteret laserlys (grå, øverst til venstre), PI for døde celler (rød, nederst til venstre), FDA for levende celler (grøn, nederst til højre) og flettede billeder for levende og døde celler (øverst til højre). Stiplet linje angiver en holm. Skalastang 50 μm. (D) Dynamisk insulinsekretion af humane skiver af bugspytkirtelvæv fra en enkelt ikke-diabetisk donor. Insulinkinetikken viser et klart tab af både glukosestimuleret insulinsekretion og membrandepolarisering med KCl. Data normaliseres til den gennemsnitlige baselinesekretion ved 5,5 mM glucose (stimuleringsindeks, foldændring). Der er udført sekretion på skiver fra samme donor som vist i (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vævsbelastning med henblik på dynamisk perifusion. (A) Stablede skivekamre. Individuelle skiver lægges på et metalgitter som vist i indsatsen. (B) Indlæsning af isolerede øer i holmkamre. Skive- og økamre forbundet til perifusionsmaskine. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hormonsekretion i skiver og isolerede holme. Data vist i panel (A) og (B) stammer fra en anden donor sammenlignet med panel (C) og (D). (A) Absolut hormonsekretion fra 3 skiver af bugspytkirtelvæv fra en enkelt ikke-diabetisk donor. Insulinsekretion vises i grønt og glukagonsekretion i magenta. (B) Hormonsekretion vist under (A) normaliseret til det samlede hormonindhold (% af indholdet). Indhold måles fra alle 3 udsnit, der bruges i eksperimentet. (C) Dynamisk insulinsekretion af isolerede øer (100 øer) og pancreasvævsskiver (3 skiver) fra samme ikke-diabetiske donor. Data vises i absolutte tal (mU/L). (D) Insulinsekretion vist i (C) normaliseret til det samlede insulinindhold (% af indholdet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Billedopsætning og forventede resultater. (A) Opsætning til funktionel billeddannelse med et opretstående konfokalmikroskop og en perifusionsopsætning. B) Billeddannelseskammer forbundet med ind- og udstrømning. (C) Z-stak af konfokale billeder af en ø i en vævsskive fra en sund menneskelig donor, der viser reflekteret lys (øverst) og Fluo4-signal (nederst). Refleksion bruges til at identificere holme inden for skiven (stiplet linje). (D) Heatmap, der viser in vitro Ca2+ dynamikken i øceller udtrykt som den fluorescerende intensitet af Fluo4 normaliseret til basalsignalintensiteten ved 5,5 mM glucose og stimulering med høj glucose (16,7 mM). Hver række repræsenterer en enkelt celle fulgt over tid i x-aksen og deres respons i størrelsesorden ændring (%) af den fluorescerende intensitet over baseline (dF/F) vist på farveskalaen fra blå (lav intensitet) til rød (høj intensitet). (E) Repræsentative spor af 4 individuelle celler, der viser en reaktion på høj glukose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Indstillinger for calciumbilleddannelse. Skærmbillede af softwaren med repræsentative indstillinger, der er valgt til at udføre time-lapse-optagelser på 40 μm (XYZT-billeddannelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Her præsenterer vi en protokol til generering af levedygtige bugspytkirtelvævsskiver og deres anvendelse til funktionelle aflæsninger som dynamisk hormonsekretion og funktionel billeddannelse. I lighed med isolering af human ø påvirkes skiveprocedurens succes af forskellige faktorer, herunder donoregenskaber, vævsforsendelsestid og vævskvalitet25,29. Derfor er det afgørende nøje at udvælge vævsprøver til forsøget og holde iskæmitiderne på et minimum. I den forbindelse bør andre potentielle kilder til humant væv ud over kadaveriske donorer overvejes nøje. Inkludering af kirurgiske donorer giver mulighed for at kombinere funktionelle skivedata med relevante in vivo-oplysninger fra den samme patient, hvilket styrker den translationelle relevans11. Denne vævskilde bringer imidlertid andre faktorer ind, da biopsier normalt er fra ældre patienter, der gennemgår pancreatectomy, hovedsagelig på grund af en lokaliseret tumor. Især udføres bugspytkirtelbiopsier ikke i forbindelse med diabetes.
Ved udførelse af den faktiske udskæringsprocedure er rettidig vævsbehandling kritisk. Skiver kan opbevares i flere timer, som beskrevet i denne protokol, eller dyrkes i længere perioder, som beskrevet af Qadir et al.19. På nuværende tidspunkt står denne protokol som den eneste metode til at opretholde skivens levedygtighed over længere varighed, men fremtidige bestræbelser bør vurdere funktionelle ændringer på tværs af forskellige kulturtider og drage sammenligninger med isolerede øer fra den samme donor.
Det mest kritiske trin i processen er omhyggelig vævsforberedelse inden indlejring i agarose. Store kanaler og fibrotisk væv kan komplicere udskæringsprocessen og potentielt føre til, at vævsblokke bryder ud af agarose. Hvis dette sker, og stykkerne forbliver rimelige størrelser, kan de oparbejdes og indlejres til udskæring. Opretholdelse af god vævskvalitet og omhyggelig behandling forbedrer i høj grad udskæringsprocedurens effektivitet og giver den maksimale mængde og kvalitet af skiver. Den tid, der går fra vævsforberedelse til skivegenerering, bør ikke overstige 2-3 timer, da længere intervaller påvirker vævets levedygtighed betydeligt.
Under skiveperifusion er et enkelt, men kritisk trin den præcise trimning af skiven for at sikre en perfekt pasform i kammeret. Dette giver mulighed for korrekt badning af vævet og uafbrudt strømning. Når protokollen er indledt, er det vigtigt at undgå yderligere manipulation af kamrene for at forhindre uønskede pigge i hormonfrigivelsen. Der skal forberedes tilstrækkelig buffer, og slangen skal nå opløsningens bund for at forhindre, at luftsugning og kamre løber tør.
For calciumbilleddannelse er det vigtigt at vælge interesseområdet omhyggeligt afhængigt af eksperimentelle behov og design. Det er vigtigt at minimere fotoblegning ved at vælge billeddannelsesparametre, der reducerer lyseksponeringen eller forkorter den samlede protokoltid. Ligesom dynamisk hormonsekretion er det afgørende at opretholde korrekt opløsningsflow og en opvarmet indstilling, da skiver kræver næsten fysiologiske forhold for optimal funktion (f.eks. 37 ° C).
Bugspytkirtelvævsskiver opretholder effektivt bugspytkirtlens strukturelle integritet og bevarer celle-celleforbindelser mellem dens forskellige celletyper. Derfor giver de et alternativ til at arbejde med isolerede holme, hvilket letter den samtidige udforskning af både endokrine og eksokrine funktioner og deres samspil. For at vurdere samspillet mellem de enkelte celletyper er det afgørende at skelne mellem dem. Farvning bagefter er en mulighed, men det har begrænsninger med hensyn til tilgængelige fluorescerende sonder og udfordringen med at lokalisere nøjagtige cellelag. Derfor er det tilrådeligt at inkorporere cellespecifikke stimuli i protokollen for at muliggøre cellediskrimination baseret på svar. For at skelne mellem celletyper i mus eller humane skiver inkluderer effektive stimuli adrenalin til alfaceller21,30, ghrelin til deltaceller31, cerulein til acinarceller 5,32, galdesyrer til duktalceller33 og noradrenalin til vaskulære celler22. Lignende stimuli kan anvendes til måling af sekretoriske reaktioner. Mens billeddannelsesundersøgelser fokuserer på individuelle celler, analyserer sekretionsundersøgelser det kollektive respons. Derfor er det afgørende at inkludere et rigeligt antal skiver for at opdage de ønskede resultater. Den optimale mængde kan variere mellem celletyper, hvor tre skiver viser sig tilstrækkelige til endokrine celler; Det er dog tilrådeligt at bruge flere udsnit for at sikre detekterbarhed i stedet for at risikere at gå glip af værdifuld information.
Som enhver anden metode har vævsskiver begrænsninger, der bør overvejes ved fortolkning af resultater. Stimulusapplikation rettet mod specifikke celletyper kan føre til virkninger på andre celletyper i skiven, hvilket potentielt udløser feedback-sløjfer. Disse er imidlertid også vigtige at studere, og derfor kan målte responser være mere repræsentative for et fysiologisk respons. Til selektiv cellemålretning kan traditionelle in vitro-protokoller anvendes. Det er vigtigt, at acinarceller indeholder bugspytkirtelenzymer, der kan nedbryde proteiner og fordøje vævsskiven, hvilket resulterer i cellulær nedbrydning inden for få timer. For at opretholde levedygtighed er den konsekvente anvendelse af trypsinhæmmere afgørende, når skiverne er i statisk tilstand, selvom deres anvendelse kan forstyrre den vellykkede overførsel af vira, der anvendes til mærkningsformål.
Sammenlignet med øisolering kan donorvariabilitet og vævskvalitet påvirke både mængden og levedygtigheden af de opnåede skiver. Utilstrækkelig levedygtighed efter udskæring kan resultere i en kort levetid og hindre evnen til at dyrke skiverne. Desuden kan øtællinger variere betydeligt blandt donorer, hvilket gør det udfordrende at estimere øindhold, før der udføres eksperimenter. Derfor er omhyggelig udvælgelse af donoracceptkriterier og implementering af passende normaliseringsmetoder, såsom procentdelen af hormonindhold til sekretion eller foldændring til baseline, afgørende. For konsistente resultater anbefales det at vurdere vævsskivens levedygtighed før eksperimentet. Desuden anbefales det at inkorporere relevante kontrolstimuli (f.eks. KCl) i eksperimentet. I tilfælde af individuel celleanalyse, såsom billeddannelse, kan forsortering af celler baseret på deres respons på disse kontrolstimuleringer implementeres. På trods af de nævnte udfordringer tilbyder skiver en værdifuld udvidelse af nuværende forskningsmetoder.
Den beskrevne protokol kan bruges som udgangspunkt for flere applikationer, og bugspytkirtelskiver kan manipuleres, og svar undersøges efter en række stimuli. Vi leder også læserne til adskillige forskningsundersøgelser, der bruger skiver fra mus eller menneskelig bugspytkirtel, hvilket giver værdifuld indsigt for dem, der planlægger deres eksperimenter. I fremtiden er det muligt, at potentielle terapier kan undersøges ved hjælp af bugspytkirtelskiver, eller at sygdomsmekanismer kan modelleres.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev udført med støtte fra netværket for pancreas organdonorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), et forskningsprojekt om type 1-diabetes støttet af JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) og The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). Det udtrykte indhold og synspunkter er forfatternes ansvar og afspejler ikke nødvendigvis nPODs officielle holdning. Organ Procurement Organizations (OPO), der samarbejder med nPOD om at levere forskningsressourcer, er opført på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Forfatterne er taknemmelige over for donorerne og deres familier for deres uvurderlige bidrag. Dette arbejde blev støttet af American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) og Leona M. og Harry B. Helmsley Charitable Trust (tilskud 2015-PG-T1D-052).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
| AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
| AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
| AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
| Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
| Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
| Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
| Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
| Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
| Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
| Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
| Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
| Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
| Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
| Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
| Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
| Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
| Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |
References
- Abdelli, S., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Lyon, J., et al. Research-focused isolation of human islets from donors with and without diabetes at the alberta diabetes institute isletcore. Endocrinology. 157 (2), 560-569 (2016).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Arch. 446 (5), 553-558 (2003).
- Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
- Marolt, U., et al. Calcium imaging in intact mouse acinar cells in acute pancreas tissue slices. PLoS One. 17 (6), 0268644 (2022).
- Stozer, A., et al. Confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62293 (2021).
- Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS One. 8 (1), e54638 (2013).
- Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released atp to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
- Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. Katp-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar atp. Mol Cell Endocrinol. 230 (1-2), 51-58 (2005).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Mol Metab. 6 (9), 943-957 (2017).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Rep. 31 (1), 107469 (2020).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of langerhans and acinar cell biology. Nat Protoc. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
- Campbell-Thompson, M., et al. Network for pancreatic organ donors with diabetes (npod): Developing a tissue biobank for type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 28 (7), 608-617 (2012).
- Kaddis, J. S., Pugliese, A., Atkinson, M. A. A run on the biobank: What have we learned about type 1 diabetes from the npod tissue repository. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 22 (4), 290-295 (2015).
- Pugliese, A., et al. New insight on human type 1 diabetes biology: Npod and npod-transplantation. Curr Diab Rep. 14 (10), 530 (2014).
- Pugliese, A., et al. The juvenile diabetes research foundation network for pancreatic organ donors with diabetes (npod) program: Goals, operational model and emerging findings. Pediatr Diabetes. 15 (1), 1-9 (2014).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. J Biol Chem. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nat Commun. 11 (1), 3265 (2020).
- Huber, M. K., et al. Observing islet function and islet-immune cell interactions in live pancreatic tissue slices. J Vis Exp. (170), e62207 (2021).
- Panzer, J. K., Tamayo, A., Caicedo, A. Restoring glutamate receptor signaling in pancreatic alpha cells rescues glucagon responses in type 1 diabetes. Cell Rep. 41 (11), 111792 (2022).
- Mateus Goncalves, L., Almaca, J. Functional characterization of the human islet microvasculature using living pancreas slices. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 602519 (2020).
- Doke, M., et al. Dynamic scrna-seq of live human pancreatic slices reveals functional endocrine cell neogenesis through an intermediate ducto-acinar stage. Cell Metab. 35 (11), 1944-1960 (2023).
- Mateus Goncalves, L., et al. Pericyte dysfunction and impaired vasomotion are hallmarks of islets during the pathogenesis of type 1 diabetes. Cell Rep. 42 (8), 112913 (2023).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85 (7), 950-955 (2008).
- Hart, N. J., Powers, A. C. Use of human islets to understand islet biology and diabetes: Progress, challenges and suggestions. Diabetologia. 62 (2), 212-222 (2019).
- Henquin, J. C. The challenge of correctly reporting hormones content and secretion in isolated human islets. Mol Metab. 30, 230-239 (2019).
- Panzer, J. K., Caicedo, A. Protocol to generate and utilize pancreatic tissue slices to study endocrine and exocrine physiology in situ from mouse and human tissue. STAR Protoc. 4 (3), 102399 (2023).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34 (3), 826-827 (2002).
- Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by tpc2-dependent ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic alpha-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
- Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), e78706 (2013).
- Gal, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Front Physiol. 10, 938 (2019).
