Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren, das den organweiten Nachweis pathogener Bakterien während der Infektion und die Quantifizierung der fluoreszierenden Reporteraktivitäten ermöglicht.
Abstract
Die meisten Infektionen finden in dreidimensionalen Wirtsgeweben mit komplizierter Anatomie und lokal unterschiedlicher Wirtsphysiologie statt. Die Positionierung der Erregerzellen in dieser vielfältigen Umgebung hat einen erheblichen Einfluss auf ihr Stressniveau, ihre Reaktionen, ihr Schicksal und ihren Beitrag zum allgemeinen Fortschreiten der Krankheit und zum Versagen der Behandlung. Aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Lokalisierung von μm-großen Erregerzellen in cm-großen Wirtsorganen war dieses Forschungsgebiet jedoch noch relativ unerforscht. Hier stellen wir eine Methode vor, um diese Herausforderung anzugehen. Wir setzen serielle Zwei-Photonen-Tomographie und KI-gestützte Bildanalyse ein, um einzelne Salmonellenzellen in der gesamten Milz, in den Leberlappen und in ganzen Lymphknoten infizierter Mäuse zu lokalisieren. Mit Hilfe von Fluoreszenzreportern und in vivo der Verabreichung von Antikörpern können die Replikationsrate einzelner Salmonellenzellen , ihre lokale Interaktion mit spezifischen Immunzellen und die bakterielle Reaktion auf Antibiotika bestimmt werden. Diese Methoden eröffnen Wege für eine umfassende Untersuchung von Infektionen, deren Prävention und Behandlung im dreidimensionalen Gewebekontext.
Introduction
Infektionen treten in Geweben mit komplexer Anatomie und kompartimentierter Physiologie auf. Die vielfältigen Mikroumgebungen, die im infizierten Gewebe koexistieren, können das Schicksal lokaler Erregeruntergruppen und ihren Beitrag zum Gesamtausgang der Erkrankung bestimmen 1,2,3. Eine umfassende 3D-Kartierung von mikrobiellen Krankheitserregern in zentimetergroßen Geweben bleibt jedoch eine Herausforderung4. Die Bildgebung des Gehirns und anderer Organe ist ein sehr aktives Forschungsfeld mit ständig verbesserten experimentellen Strategien5, aber vielen Methoden fehlt noch die Auflösung im Sub-μm-Bereich, die erforderlich wäre, um μm-große bakterielle Krankheitserreger sicher zu identifizieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht die serielle Zwei-Photonen-Tomographie (STP)6 die automatisierte, mehrfarbige, verformungsfreie Bildgebung ganzer Gewebe mit einer Auflösung von unter μm in der Ebene, wodurch vollständige volumetrische Datensätze erhalten werden. Diese Methode kombiniert das wiederholte physikalische Schneiden des Gewebes mit einem Vibratom mit intermittierender Zwei-Photonen-Bildgebung der austretenden Blockflächen mit Infrarotlicht. Die STP-Tomographie wird häufig zur Kartierung dünner Axone im Gehirn eingesetzt, um Konnektivitätskarten zu erstellen 7,8,9,10.
Die STP-Tomographie ermöglicht auch die 3D-Kartierung einzelner mikrobieller Erregerzellen (Salmonellen, Toxoplasmen) im gesamten infizierten Gewebe11,12 mit Hilfe eines Tomographen. Die Generierung der zweiten Harmonischen zeigt Kollagenhüllen um Arterien und in fibrösen Banden wie den Trabekeln der Milz und liefert so den anatomischen Kontext. In vivo injizierte fluoreszierende Antikörper können zur Färbung von Wirtszellen verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen einzelnen Erregerzellen und infiltrierenden Immunzellen wie Neutrophilen aufzudecken. Hier wird die Pipeline beschrieben, die die Verarbeitung des Gewebes, die Bildgebung, das Zusammenfügen von Bildgebungskacheln mit Beleuchtungskorrektur, das Stapeln von Bildern in drei Dimensionen und die Segmentierung mit Hilfe von Werkzeugen des maschinellen Lernens umfasst. Diese Pipeline liefert 3D-Positionen von einzelnen Krankheitserregern, Zellen und Mikrokolonien innerhalb ihres Wirtskontextes. Die Anzahl der einzelnen Zellen innerhalb von Mikrokolonien bleibt aufgrund der Auflösungsgrenzen schwierig, aber diese Zahlen können auf der Grundlage der integrierten Helligkeit der Mikrokolonie geschätzt werden. Die Pipeline kann problemlos an andere Infektionsmodelle angepasst werden, wenn rekombinante GFP- oder YFP-exprimierende Erreger zur Verfügung stehen.
Protocol
Alle hier beschriebenen Tierversuche sind behördlich bewilligt (Bewilligung 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) und folgen den lokalen Richtlinien (Tierschutz-Verordnung, Basel) und dem Schweizer Tierschutz-Gesetz.
1. Vorbereitung und Lagerung von infiziertem Gewebe
- Verwenden Sie ein Infektionsmodell Ihrer Wahl. Hier werden 10 bis 16 Wochen alte Mäuse beiderlei Geschlechts mit ~1.000 koloniebildenden Einheiten (KBE) durch intravenöse Injektion oder 5 x 107 KBE durch intragastrische Verabreichung mit einer Rundnadel infiziert. Geeignete Mausstämme sind BALB/c und C57BL/6.
HINWEIS: Der gleiche Ansatz kann leicht für andere Wirtsarten angepasst werden. - Stellen Sie sicher, dass Krankheitserreger fluoreszierende Proteine exprimieren, um die Identifizierung in ungefärbtem Gewebe zu ermöglichen. Krankheitserreger, die GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 oder mWasabi16 exprimieren, können alle mit 940 nm Anregung17 sichtbar gemacht werden. Salmonellen , die mCherry18 in Konzentrationen exprimieren, die durch Durchflusszytometrie19 leicht nachweisbar sind, konnten mittels 800-nm-Anregung abgebildet werden, weisen jedoch in infizierter Milz und Leber ein schlechtes Signal-Hintergrund-Verhältnis auf, das eine erhebliche Autofluoreszenz aufweist.
- Stellen Sie sicher, dass alle fluoreszierenden Proteine nach der Fixierung mit Paraformaldehyd bei neutralem pH-Wert auf der Grundlage der Quantifizierung mit Durchflusszytometrie >70 % ihrer Fluoreszenzintensität behalten. Hier wird infiziertes Mausgewebe verwendet, nämlich Milz, Leber, Lymphknoten und Peyer-Pflaster.
- Färben Sie Oberflächenmarker von Wirtszellen in vivo durch Injektion von Phycoerythrin (PE)-markierten Antikörpern 10 Minuten vor der Perfusion. Um Neutrophile zu färben, injizieren Sie intravenös 4 μg Anti-Ly-6G-PE in 100 μl PBS. Zur Färbung von Marginalzonen-Makrophagen in der Milz injizieren Sie 4 μg Anti-CD169-PE in 100 μl PBS (siehe Materialtabelle).
- Fixieren Sie infiziertes Gewebe durch standardmäßige transkardiale Perfusion20 mit 15 ml eiskaltem 50 mM Phosphatpuffer (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), gefolgt von 35 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA; Fixiermittel) in PB (Abbildung 1A).
- Kurz gesagt, verabreichen Sie dem infizierten Tier eine Tiefenanästhesie durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 16 mg/kg Xylazin. Stellen Sie eine ordnungsgemäße Anästhesie sicher, indem Sie den Verlust des Zehenkneifreflexes bestätigen.
- Desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol, trocknen Sie es mit einem sterilen Papiertuch ab und öffnen Sie die Brust chirurgisch mit Pinzette und Schere. Platzieren Sie eine sterile Nadel in der linken Herzkammer, öffnen Sie den rechten Vorhof mit einer sterilen Schere und führen Sie den ersten Puffer und dann das Fixiermittel mit einer Pumpe durch die Nadel, die linke Herzkammer und das gesamte Gefäßsystem. Dadurch werden alle Gewebe schnell und gleichmäßig fixiert und die Euthanasie bewirkt.
- Entnehmen Sie das Gewebe nach der Perfusion, inkubieren Sie es in einem 20-fachen Volumen von 4 % kaltem Paraformaldehyd in PB-Puffer und legen Sie es über Nacht bei 4 °C auf einen Schüttler (Abbildung 1B). Die Bildgebung ist für Gewebe im Größenbereich von 0,05 bis 2 cmmöglich 3. Für größere Taschentücher in geeignete Stücke schneiden.
- Am nächsten Tag das Tuch 3x für je 10 min mit PB-Puffer waschen und bei 40 U/min bei Raumtemperatur schütteln, um PFA zu entfernen.
HINWEIS: Aufgrund der PFA-Toxizität müssen diese Schritte in einem Abzug durchgeführt werden. Entsorgen Sie die PFA-Abfälle gemäß den institutionellen Richtlinien. - Entfernen Sie überschüssigen PB-Puffer und geben Sie das 20-fache Volumen des Kryoprotektivum-Lagerpuffers21 (876 mM Saccharose, 0,25 mM Polyvinylpyrrolidon, 40 % (v/v) Ethylenglykol, gelöst in 50 mM PB-Puffer) in die Probe unter Schütteln bei 40 U/min bei 4 °C für 6-8 h oder bis das Gewebe auf den Boden sinkt. Die Proben werden mindestens 3 Tage lang bei -20 °C inkubiert, um eine wirksame Reduzierung der Gewebeautofluoreszenz zu gewährleisten11. Die Proben können bei einer Lagerung bei -20 °C bis zu 5 Jahre lang verwendet werden.
HINWEIS: Das Absinken des Gewebes deutet auf ein ordnungsgemäßes Eindringen des Speicherpuffers in das Gewebe hin.
2. Einbettung von Beispielen
- Betten Sie das Gewebe in einen Agaroseblock ein, um einen reibungslosen Schnitt mit einem Vibratom zu erzielen. Die Agarose durch Oxidation mit Periodat chemisch voraktivieren und dann mit Borhydrid reduzieren, um eine Vernetzung mit dem Gewebe zu bilden, um die Stabilität während des Schneidprozesses zu verbessern. Führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
- Bereiten Sie 4% oxidierte Agarose vor, indem Sie 2,25 g Agarose wiegen und 0,21 g NaIO4 hinzufügen. Fügen Sie 100 mL PB zu Agarose und NaIO4 hinzu. Bei Raumtemperatur in einem Abzug 2-3 h unter Lichtschutz umrühren.
HINWEIS: Kritischer Schritt: Rühren Sie nicht länger als 3 Stunden ein, da die Agarose sonst schlecht polymerisiert. - Rückgewinnung der Agarose durch Membranfiltration in einem Standard-Vakuumfilter mit einer 0,2 μm Membran. Entfernen Sie das restliche NaIO4 , indem Sie 3x mit 50 mL PB-Puffer waschen. Die oxidierte Agarose wird in 50 ml PB-Puffer resuspendiert.
HINWEIS: Schmelzen Sie die Agarose in dieser Phase nicht. Die Agarose kann bei 4 °C bis zu 2-3 Wochen lichtgeschützt gelagert werden. - Bereiten Sie Borhydridlösung vor, indem Sie 19 g Borax und 3 g Borsäure zu 1 l Wasser geben. Rühren, bis es sich aufgelöst hat, und den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 9-9,5 einstellen. Auf einer Rührplatte in einem Abzug 100 ml Boratpuffer auf 40 °C erhitzen. 0,2 g NaBH4 dazugeben und 15-30 min unter Lichtschutz rühren.
HINWEIS: Die Borhydridlösung kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert werden. Kritischer Schritt: Bei der Zugabe von NaBH4 zum Boratpuffer bildet sich Gas, führen Sie diesen Schritt daher in einem Abzug durch. Führen Sie diesen Schritt nicht in einem dicht verschlossenen Behälter durch, da dies zu einer Explosion führen kann. - Entnehmen Sie das Gewebe nach ausreichender Inkubation für eine verminderte Autofluoreszenz (≥ 3 Tagen) aus dem Gefrierschrank, entfernen Sie überschüssigen Kryoprotektiva-Lagerpuffer und waschen Sie das Gewebe 3x für jeweils 10 Minuten mit PB-Puffer unter Schütteln bei 40 U/min bei Raumtemperatur (RT).
- Schmelzen Sie ca. 20 mL oxidierte Agarose-Suspension (hergestellt in Schritt 1) in einer Mikrowelle (700 W für ~30 s), lassen Sie sie so weit abkühlen, dass sie verarbeitet werden kann (~45 °C), und gießen Sie sie in eine Kunststoffform.
HINWEIS: Kritischer Schritt: Geben Sie die Agarose nicht direkt nach dem Erhitzen in der Mikrowelle auf die Probe, da dies zur Zerstörung des Gewebes führen kann. - Nehmen Sie das Taschentuch mit einer Pinzette vorsichtig auf und führen Sie es schnell in die untere Mitte der Agarose ein. Inkubieren Sie die Form 15 Minuten lang bei RT, damit die Agarose polymerisieren kann.
- Öffnen Sie nach der Agarosepolymerisation die Kunststoffform mit einem Skalpell von den vier Ecken her und nehmen Sie den Agarosewürfel vorsichtig mit behandschuhten Fingern auf.
- Die Probe wird 2-3 Stunden lang bei 4 °C in Borhydridlösung (in Schritt 2 hergestellt) getaucht, um die Vernetzung der oxidierten Agarose und des Gewebes einzuleiten. Dadurch wird verhindert, dass sich das Gewebe beim Schneiden ablöst.
HINWEIS: Kritischer Schritt: Die in Borhydrid getauchte Probe sollte vor Licht geschützt bei 4 °C inkubiert werden. - Den Agarosewürfel 2x mit PB Puffer 10 min waschen. Drehen Sie den Agarosewürfel so, dass sich das Gewebe an der Oberseite befindet und befestigen Sie den Block mit ein paar Tropfen Sekundenkleber an einem Magnetobjektträger (Objektträger mit zwei Magneten, die an der Rückseite befestigt sind). Es dauert 10-20 Minuten, bis sich der Kleber verfestigt hat, legen Sie also ein Papiertuch mit Tropfen PB-Puffer auf die Agarose, um sicherzustellen, dass die Probe durchgehend ausreichend hydratisiert bleibt (Abbildung 1C).
3. Vorbereitung des Mikrotoms und Vorbereitung der Inszenierung
- Platzieren Sie den magnetischen Objektträger auf dem Metall in der Mitte des Probenkastens des Tomographen.
- Füllen Sie die Box mit PB-Puffer und positionieren Sie sie vorsichtig auf dem Tisch und ziehen Sie die Schraube links fest, um die Probenbox auf dem Tisch des Tomographen zu befestigen.
HINWEIS: Ziehen Sie die Schrauben nicht zu fest an, da sonst die Kunststoffbox beschädigt wird. - Legen Sie die Klinge auf das Mikrotom und verschieben Sie die Position der Probe vorsichtig in der Nähe und unter dem Mikrotom. Die Oberseite der Agarose sollte sich auf der gleichen Höhe wie die Klinge des Mikrotoms befinden.
HINWEIS: Wenn Sie ihn zu niedrig positionieren, verschwenden Sie Schnittzeit, während bei einer zu hohen Positionierung ein großer Teil des Blocks beim ersten Schnitt entfernt wird. - Bewegen Sie den Tisch, um den Agarose-Würfel in der Mitte des Objektivs zu positionieren, und klicken Sie wiederholt auf die Schaltfläche Slice in der Tomograph-Software, bis Sie eine intakte Scheibe des gesamten Agarose-Würfels erhalten.
4. Zuordnung der Oberfläche und Aufnahme von 2D-Bildern
- Zentrieren Sie die Objektivlinse in x- und y-Richtung auf die Gewebeprobe.
- Öffnen Sie die Lasersoftware und schalten Sie den Laser in der Software ein. Wenn Sie ein tickendes Geräusch hören, schalten Sie den Laserschalter ein und stellen Sie die Wellenlänge auf 800 nm ein.
HINWEIS: Die Laserquelle muss vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten, idealerweise 1 Stunden, aufgewärmt werden. - Schließen Sie die Gehäusetüren des Mikroskops, schalten Sie alle Lichtquellen im Raum aus, schalten Sie die PMTs ein und stellen Sie die Spannung auf 750 V ein.
HINWEIS: Kritischer Schritt: PMTs sind sehr lichtempfindlich, lassen Sie es ausgeschaltet, es sei denn, die Schranktüren sind geschlossen und alle Lichtquellen im Raum sind ausgeschaltet. - Passen Sie die Protokolleinstellungen der Tomographensoftware wie beschrieben an und stellen Sie den Mikroskopverschluss auf automatisch und die Spannung auf 20 bzw. 3 für V1 bzw. V2.
- Klicken Sie auf die 2D-Schaltfläche in der Tomograph-Software, um einen Schnappschuss der Probe aufzunehmen.
- Sobald ein Bild mit sichtbarer Autofluoreszenz angezeigt wird, passen Sie den Z-Piezo an, um die Fokusebene auf der Oberfläche des Agarosewürfels festzulegen. Der erste Scan erfolgt 20 μm unter der Oberfläche, um ein stabiles Bild der Probe zu erhalten.
- Wenn kein Autofluoreszenzhintergrund sichtbar ist, erhöhen Sie den Kontrast, bis ein Signal erscheint. Es kann vorkommen, dass kein sichtbares Signal vorhanden ist (z. B. aufgrund der Agarose auf der Oberseite des Gewebes). Stellen Sie in diesem Fall die z-Achse mit dem z-Piezo Gerät ein, bis sie die Agaroseoberfläche erreicht. Eine manuelle Bewegung der Linse kann erforderlich sein, wenn die gewünschte Position außerhalb des Bereichs des Z-Piezo-Geräts liegt.
- Schneiden Sie mehrere 50-μm-Scheiben, nachdem Sie die Oberfläche der Probe gefunden haben, und nehmen Sie nach jedem Schnitt 2D-Bilder auf, um sicherzustellen, dass die Fokusebene richtig auf der Oberfläche der Blockfläche ausgerichtet ist.
5. Ermitteln der Kanten der Proben und Einstellen des Lasers auf den Startpunkt
- Basierend auf den xy-Koordinaten des Laserscanbereichs (4 Eckkoordinaten) beschränken Sie den Bildgebungsbereich auf das Gewebe mit minimaler Bildgebung des umgebenden Agaroseblocks.
- Schalten Sie die PMTs aus, stellen Sie die Laserwellenlänge auf 800 nm ein und schalten Sie den Laserverschluss auf Öffnen. Die Position des Laserlichts, das in den Agaroseblock eintritt, ist als roter Streulichtfleck sichtbar (Abbildung 2A,B).
Kritischer Schritt: Seien Sie besonders vorsichtig mit dem Laser der Klasse 4. Es kann menschliches Gewebe und Augen schnell schädigen. Das Personal benötigt eine spezielle Schulung, um ein solches Instrument sicher bedienen zu können. - Verwenden Sie den Laserspot beim Verschieben des Tisches, um die Koordinaten der Geweberänder anhand der Sequenz hinten, rechts, vorne und links zu ermitteln.
- Überprüfen Sie die Koordinaten und positionieren Sie den Laserpunkt in der rechten vorderen Ecke, die der Standardstartpunkt für die Bildgebung des Gewebes ist.
- Konvertieren Sie die Koordinaten aus dem Konsolenfenster in maschinenerkennbare Blockgrößen, die durch die xy-Schritte definiert werden. Tragen Sie diese Schrittmessungen in das Protokoll der Software ein. Schließen Sie die Schranktüren.
6. 3D Scannen / Schneiden
- Ändern Sie die Wellenlänge auf 940 nm, um GFP, mWasabi oder YPet und PE anzuregen.
HINWEIS: Der Laser ist für das menschliche Auge bei dieser Wellenlänge unsichtbar. Um das Signal-Hintergrund-Verhältnis für GFP, mWasabi und die grün emittierende Komponente von TIMERbac zu verbessern, platzieren Sie einen schmalbandigen Passfilter 510/20 nm vor PMT 2. Dadurch wird die Interferenz durch grün-gelbe Gewebeautofluoreszenz reduziert. - Schalten Sie den Mikroskop-Verschluss in den Automatikmodus und die Verschlussspannung auf 20 für V1 und 1,71 für V2.
- Stellen Sie die folgenden drei Parameter in der Software ein: Querschnittsdicke - für die meisten Zwecke auf 50 μm eingestellt. Für die Leber auf 30 μm einstellen, da die Bildgebungstiefe begrenzt ist. Die Anzahl der physikalischen Schnitte – dies bestimmt die Gesamtgewebetiefe, die abgebildet wird, und wird entsprechend eingestellt. Die Anzahl der Ebenen, die für jeden Schnitt erfasst werden sollen – dies bestimmt die z-Auflösung. Verwenden Sie für die meisten Zwecke 5 Ebenen (mit einer vertikalen Auflösung von 10 μm). Für die Leber verwenden Sie 3 oder weniger Ebenen.
- Stellen Sie die Laserverstärkung ein. Dies muss für verschiedene Gewebe und Scantiefen empirisch getestet werden.
- Definieren Sie den Ordnerpfad und den Namen zum Speichern der erfassten Bilder und geben Sie die entsprechenden Informationen für die Imaging-Metadatei an.
- Überprüfen Sie alle eingegebenen Werte.
- Klicken Sie auf 3D-Mosaikeinstellung , um den Scanvorgang zu starten (Abbildung 1D).
- Entnehmen Sie nach Abschluss der Bildgebung die Gewebeschnitte vorsichtig aus dem Wassertank und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung in einem Lagerpuffer bei -20 °C (Abbildung 1E; Abbildung 2C,D).
7. Bildverarbeitung und Datenanalyse
- Laden Sie die MATLAB-Skripte von https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020 auf einen Linux-Computer herunter. Kopieren Sie die Skripte in einen Ordner, z. B. /home/user/Program/.
HINWEIS: Das Add-on Computer Vision Toolbox für MATLAB und Fidschi (oder ImageJ) muss auf Linux-Computern installiert sein, damit das Skript voll funktionsfähig ist. - Fügen Sie Kachelbilder wie unten beschrieben zusammen.
- Übertragen Sie Daten vom Tomographenserver auf den Linux-Rechner.
- Öffnen Sie das MATLAB-Skript StepOneStitchingAndArchive.m und suchen Sie den Quellordner mit den Rohdaten. Definieren Sie die Quell- und Zielordner im Skript.
- Wechseln Sie zur Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen. Fortschrittsinformationen werden im Befehlsfenster angezeigt. Die Verarbeitung umfasst das Lesen von Informationen aus der Mosaik-Datei, das Generieren des Kachelindex vor dem Zusammenfügen von Bildern, die Korrektur der Hintergrundbeleuchtung mit Cidre22 (Abbildung 3) sowie die Beleuchtungskorrektur zwischen optischen Schichten, die in unterschiedlicher Tiefe erfasst wurden. Suchen Sie die zusammengefügten Bilder in einem Unterordner namens stitchedImages_100 im Quellordner. Komprimieren Sie die Rohdaten für die langfristige Speicherung mit dem Befehl tar, und speichern Sie sie als einzelne Datei mit der Dateinamenerweiterung tar.bz2 (Abbildung 1F).
- Führen Sie Modelltraining und Segmentierung mit der Support Vector Machine durch. Um die Support Vector Machine zu trainieren und die Segmentierung durchzuführen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
HINWEIS: Die zusammengefügten Bilder für jeden der drei Fluoreszenzkanäle werden in 3 Unterordnern (mit den Namen 1, 2 und 3, entsprechend roter, orangefarbener und grüner Fluoreszenz) von stitchedImages_100 gespeichert. Jeder Unterordner enthält alle zusammengefügten Bilder aus demselben Kanal.- Zeigen Sie eine Vorschau der zusammengefügten Bilder an. Öffnen Sie ein Bild mit demselben Dateinamen aus jedem Unterordner mit Fiji (oder ImageJ). Führen Sie die drei Kanäle zu einem Farbbild zusammen. Passen Sie die Helligkeit jedes Kanals an, bis klare Signale von Bakterien und Gewebeautofluoreszenz zu sehen sind. Notieren Sie sich die angepasste maximale Intensitätsstufe jedes Kanals für den nächsten Schritt.
- Öffnen Sie das MATLAB-Skript StepTwoSegmentationAndAnalysis.m, und navigieren Sie zur Quelle. Definieren Sie den Quellordner und die Image-Namen für das Training. Zum Beispiel
sourceD = '/' ;
red_name = [sourceD '1/section_020_01.tif']; green_name = [sourceD '2/section_020_01.tif'];
blue_name = [QuelleD '3/section_020_01.tif']; - Gehen Sie zur Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen.
- Es erscheint ein Dialogfeld, in dem nach Farbschwellenwerten gefragt wird, füllen Sie es basierend auf der vorherigen manuellen Überprüfung mit Fiji (Schritt 7.3.1).
- Wählen Sie Regionen für den Hintergrund und interessante Bereiche (z. B. Bakterien) gemäß den Dialogfeldern aus. Es werden Diagramme angezeigt, die zeigen, wie gut das Modell trainiert wurde, und gefragt werden, ob weitere Regionen hinzugefügt werden müssen. Fügen Sie weitere Bereiche von Interesse und Hintergrund hinzu, bis die Bakterien eindeutig segmentiert werden können (Abbildung 4A, B).
- Benennen und speichern Sie das Modell. Das Skript lädt die Bilder automatisch und wendet einen Medianfilter (Radius 2 Pixel) an.
- Der Segmentierungsprozess wird automatisch ausgeführt, und die Fortschrittsinformationen werden im Befehlsfenster angezeigt. Beobachten Sie den Fortschritt der Segmentierung. Wenn die Segmentierung mit dem Modell bei anderen zusammengefügten Bildern nicht gut funktioniert, wiederholen Sie das Modelltraining, um mehr Hintergrund- und Bakterienregionen einzubeziehen.
- Um die Ergebnisse der Segmentierung zu sehen, überprüfen Sie die Datei mit dem Namen Allpositions_filter3D.txt. Diese Datei enthält die Koordinaten des Schwerpunkts für jedes Bakterium oder jede bakterielle Mikrokolonie und die entsprechende integrierte Fluoreszenzintensität (Abbildung 1G).
- Entfernen Sie zusätzliche Artefakte mit Convolutional Neural Network, wie unten beschrieben.
HINWEIS: Bei einigen Bakterien enthält die einfache Segmentierung mit der Support Vector Machine immer noch einige Bildgebungsartefakte. Dies gilt insbesondere für YPet-exprimierende Bakterien. Die auf neuronalen Netzen basierende Segmentierung kann diese Artefakte effizient beseitigen (Abbildung 4C). Das Add-on Computer Vision Toolbox für MATLAB und Fidschi (oder ImageJ) muss auf Windows-Computern installiert sein, damit das Skript voll funktionsfähig ist. Informationen zum zugrundeliegenden neuronalen Netz finden Sie unter: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html- Bereiten Sie die Bilder vor. Konvertieren Sie tif-Dateien in jpg-Dateien mit unterschiedlichen Helligkeitsanpassungen mit Fiji. Identifizieren Sie mit manueller Kuration mindestens 600 Bakterien und 600 Artefakte und sichern Sie zugeschnittene Bilder dieser Objekte in entsprechenden Ordnern.
- Öffnen Sie das MATLAB-Skript CNNtestV4.m und navigieren Sie zu den Quelldateien, die die Objektbilder aus Schritt 7.4.1 enthalten.
- Definieren Sie den Image-Ordner für das Training. Zum Beispiel
digitDatasetPath = fullfile ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
Definieren Sie die Anzahl der Bilder für das Training, z. B. numTrainFiles = 600. - Gehen Sie zur Registerkarte Editor und klicken Sie auf Ausführen. Nach dem Training wird die CNN-Modelldatei als gregnet1.mat im Quellordner gespeichert.
- Definieren Sie einen Ordner mit Testbildern. Zum Beispiel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Die Ergebnisse werden in einer Datei gespeichert YourFile.txt die Informationen über den Bildnamen und die Klassifizierung als Bakterien oder Artefakt enthält. - Definieren Sie einen Ordner mit Testbildern. Zum Beispiel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Die Ergebnisse werden in einer Datei YourFile.txt gespeichert, die Informationen über den Bildnamen und die Klassifizierung als Bakterien oder Artefakt enthält.
- Schätzen Sie die Größe von Mikrokolonien basierend auf der Fluoreszenzintensität einzelner Bakterien, wie unten beschrieben.
HINWEIS: Die räumliche Auflösung des Tomographen reicht nicht aus, um einzelne Bakterienzellen innerhalb dicht gepackter Mikrokolonien aufzulösen. Die Anzahl der Bakterien in jeder Mikrokolonie kann jedoch auf der Grundlage der Gesamtfluoreszenz der Mikrokolonie im Verhältnis zur Fluoreszenz einzelner Bakterien geschätzt werden. Diese Schätzgenauigkeit hängt von der Homogenität der Fluoreszenzintensität in der gesamten Bakterienpopulation ab.- Bestätigung der Identität von GFP-positiven Ereignissen in der STP-Tomographie durch Färbung bakterieller Bestandteile wie Lipopolysaccharid mittels Immunhistochemie von Schnitten aus dem Tomographen (Abbildung 1H; Abbildung 5).
- Identifizieren Sie mindestens 30 einzelne Bakterien und ermitteln Sie deren Fluoreszenzintensität aus den entsprechenden Segmentierungsergebnissen. Verwenden Sie den mittleren Intensitätswert als Referenz für ein einzelnes Bakterium. Berechnen Sie die Bakterienzahl jeder Mikrokolonie, indem Sie die Gesamtfluoreszenzintensität der Mikrokolonie durch den Referenzwert für ein einzelnes Bakterium dividieren (Abbildung 1I).
- Führen Sie eine 3D-Rekonstruktion mit einer Visualisierungssoftware durch, wie unten beschrieben.
- Bildvorbereitung
- Nehmen Sie die Bilder des blauen Kanals, die Signale der zweiten Harmonischen von Kollagen enthalten, die eine nützliche anatomische Referenz darstellen, einschließlich Gewebekapseln, Arterien und Trabekeln. Verwenden Sie Bilder, die nach Bakterien als 2. Kanal segmentiert sind.
- Ordnen Sie die Bilder aus dem 1. Kanal sowohl in der x- als auch in der y-Achse um das 10-fache ab und speichern Sie die verkleinerten Bilder in einem neuen Ordner. Erstellen Sie 3 Replikate von verkleinerten Bildern im selben Ordner. Der Name neuer Replikate sollte die gleiche Reihenfolge beibehalten. Beispiel: section_001_01.tif replizieren Sie 1 mit dem Namen section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Wenden Sie diese Schritte auch auf die Bilder aus dem 2. Kanal an. Durch die Verkleinerung werden die Dateigrößen besser überschaubar. Die Dreifachbilder glätten die z-Achse.
- Führen Sie die Bilder aus den einzelnen Kanälen zusammen, um Bildstapel mit Fidschi zu bilden. Klicken Sie auf Bild > Stapel > Tools > Stapelsortierer > Nach Beschriftungen sortieren.
- Führen Sie eine 3D-Filterung durch. Klicken Sie auf > Filter verarbeiten > 3D-Filter und legen Sie die Z-Filtergröße auf 6 fest. Speichern Sie die Bildstapel.
- Führen Sie die 3D-Visualisierung wie unten beschrieben durch.
- Öffnen Sie die Visualisierungssoftware in der Arena-Ansicht (Standardeinstellung). Verwenden Sie das Symbol "Überwachter Ordner", um Ordner zur Arena-Ansicht hinzuzufügen. Mit einem Doppelklick öffnen Sie die Datei *.ims oder *.tif (vorbereitet in 7.6.1).
- Passen Sie mit der Option "Bearbeiten>Bildeigenschaften" die Farbdarstellungen (LUTs) der verschiedenen Kanäle im Fenster "Anzeigeanpassung" an.
- Klicken Sie auf Erweitert , um die Min-/Max-Werte und einen Wert für die Gammakorrektur manuell einzustellen.
Klicken Sie auf die Kanalnamen , um die Namen und LUTs zu ändern. - Nachdem Sie das Erscheinungsbild des Bildes angepasst haben, exportieren Sie die aktuelle Ansicht mit dem Schnappschuss-Werkzeug.
- Verwenden Sie das Symbol Animation, um die 3D-Daten als Film darzustellen. Verwenden Sie den Navigationszeiger, um eine Perspektive/Ansicht zu finden, und zoomen Sie und verwenden Sie + Hinzufügen, um Schlüsselbilder hinzuzufügen. Bewegen Sie sich an eine andere Position und fügen Sie den nächsten Keyframe hinzu. Drücken Sie die rote Aufnahmetaste , um den Film zu erstellen. Speichern Sie es im gewünschten Zielordner und Dateityp (Abbildung 1J).
- Bildvorbereitung
Representative Results
Das beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis einzelner Salmonellenzellen in ganzen Mausorganen wie Milz, Leber, mesenterialen Lymphknoten und Peyer-Pflastern11 (Abbildung 5 und Abbildung 6). Es weist auch Toxoplasma gondii-Parasiten im Gehirn von Mäusennach 12. Einige infizierte Gewebe wie Leber, Peyer-Pflaster und Milz emittieren eine erhebliche Autofluoreszenz im grün-gelben Bereich. Die Autofluoreszenz wird durch die Fixierung mit Paraformaldehyd, die zur Erhaltung der Gewebestruktur notwendig ist, weiter verstärkt. Die Detektion der grünen Fluoreszenz von GFP, mWasabi und der grünen Komponente von TIMERbac vor diesem Autofluoreszenzhintergrund wird verbessert, indem ein Schmalbandpassfilter 510/20 nm (der die meisten GFP-Emissionen durchlässt, aber einen großen Teil des Autofluoreszenzspektrums blockiert) vor den Photomultiplier 2 (der grüne Emissionen sammelt) gesetzt wird und die Autofluoreszenz des Gewebes reduziert wird, indem fixiertes Gewebe für 3 oder mehr Tage in Kryoprotektivumgelagert wird 11. Bakterien sollten jedoch immer noch mindestens einige tausend Kopien pro Zelle von GFP oder anderen fluoreszierenden Proteinen exprimieren. Auf der anderen Seite sollten übermäßige Fluoreszenzproteinspiegel vermieden werden, um die Fitnesskosten zu minimieren, die zu einer abgeschwächten Virulenz führen könnten23.
Die korrekte Segmentierung von fluoreszierenden Bakterien im Gewebe kann durch Immunhistochemie der entnommenen Gewebeschnitte nach der Bildgebung bestätigt werden. Insbesondere Objekte, die mit einem Antikörper gegen bakterielle Oberflächenkomponenten wie Lipopolysaccharid gefärbt wurden, können mit dem Fluoreszenzbild ausgerichtet werden, das durch die STP-Tomographie erhalten wurde (Abbildung 5). Es ist wichtig zu beachten, dass einigen gefärbten Salmonellenzellen fluoreszierende Proteine und damit sowohl in der konfokalen Mikroskopie als auch in der STP-Tomographie nachweisbare Fluoreszenz fehlen. Bei diesen Zellen handelt es sich um Salmonellen , die vom Immunsystem des Wirts abgetötet wurden, wie durch durchflusszytometrische Sortierung und Wachstumskulturen aus einzelnen sortierten Zellen nachgewiesen wurde, sowie durch die enge Korrelation zwischen der Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf Agarplatten und der Anzahl fluoreszierender Salmonellenzellen , wie sie durch Durchflusszytometrie bestimmt wurde24. Darüber hinaus kann der Plasmidverlust zu nicht fluoreszierenden lebensfähigen Zellen führen, und dies muss durch Plattieren auf Medien mit und ohne geeignete Antibiotika entsprechend dem Selektionsmarker auf dem Plasmid getestet werden. Bei pSC101-abgeleiteten Plasmiden ist der Plasmidverlust in vivo selten19. Bei den meisten chromosomal integrierten Expressionskassetten, wie z.B. sifB::gfp , die inNummer 11 verwendet werden, ist ein Expressionsverlust in vivo nicht nachweisbar. Wenn die Segmentierung nicht mit immunhistochemischen Daten übereinstimmt, muss die Segmentierungspipeline geändert werden.
Die Auflösung der STP-Tomographie reicht nicht aus, um einzelne Bakterienzellen innerhalb dicht gepackter Mikrokolonien aufzulösen. Die Gesamtfluoreszenzintensität der Mikrokolonie ermöglicht jedoch eine Abschätzung der Anzahl der Salmonellenzellen . Dies erfordert einen fluoreszierenden Stamm mit sehr homogenen Fluoreszenzwerten wie z.B. Salmonella sifB::gfp11. Die Kombination der geschätzten Anzahl von Salmonellenzellen für alle Mikrokolonien und Einzelzellen ergibt eine bakterielle Gesamtgewebebelastung, die mit alternativen Methoden wie Plattierung oder Durchflusszytometrie von Gewebehomogenaten übereinstimmt11. Plattierung und Durchflusszytometrie können nicht direkt aus demselben Gewebe durchgeführt werden, da sie für die STP-Tomographie perfusionsfixiert werden müssen. Stattdessen müssen sie mit zusätzlichen Tieren durchgeführt werden, die nicht fixiert sind. Wenn sich die mediane Bakterienlast, die durch die verschiedenen Ansätze ermittelt wurde, um mehr als das 3-fache unterscheidet, könnte die Lebensfähigkeit fluoreszierender Bakterien beeinträchtigt sein (im Falle von niedrigeren koloniebildenden Einheiten) oder einige Bakterien könnten das fluoreszierende Reporterkonstrukt verloren haben (im Falle von höheren koloniebildenden Einheiten). Ein Kontrollversuch ist erforderlich, um die Ursache solcher Diskrepanzen zu ermitteln.
Die STP-Tomographie ermöglicht die Lokalisierung von Bakterienzellen innerhalb der 3D-Struktur des infizierten Gewebes. Die zweiten harmonischen Signale von Kollagen liefern anatomische Orientierungspunkte wie Arterien und Trabekel. Darüber hinaus können Wirtszellen in vivo gefärbt werden, indem vor der Perfusion ein Antikörper in Oberflächenmarker injiziert wird (Abbildung 5 und Abbildung 6). Diese Färbung bietet zusätzliche Orientierungspunkte für Gewebekompartimente und spezifische Mikroumgebungen, einschließlich Entzündungsherde (intrazelluläre Marker und einige Kompartimente mit Diffusionsbarrieren, wie z. B. die Milz, die weiße Pulpa oder das Gehirn, sind für diese In-vivo-Färbung nicht leicht zugänglich). Dieser Ansatz enthüllte die Milz-weiße Pulpa als Gewebekompartiment, das ein langfristiges Überleben von Salmonellen während einer antimikrobiellen Chemotherapie ermöglicht11.
Schließlich können Salmonellen, die sich mit moderaten oder langsamen Raten replizieren, identifiziert und innerhalb der 3D-Struktur von Geweben lokalisiert werden, indem Stämme verwendet werden, die den Timerbac exprimieren, einen Einzelzellreporter für die Replikationsrate11,15.
Abbildung 1: Verfahren zur Ganzorganbildgebung mittels serieller Zwei-Photonen-Tomographie (STP). (A-B) Das Organ wird nach der transkardialen Perfusion entnommen und über Nacht in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C gelagert. (C-E) Das Organ wird in oxidierte Agarose eingebettet und vernetzt, dann wird das Gewebe gescannt und mittels STP-Tomographie in Scheiben geschnitten. Die Scheiben werden für die anschließende Immunhistochemie gesammelt. (F-J) Pipelines für die computergestützte Analyse zur Quantifizierung der Bakterienzahl, zur Bestätigung fluoreszierender Bakterien und zur 3D-Rekonstruktion von Bakterienpositionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aufbau einer seriellen Zwei-Photonen-Tomographie (STP). (A) Tomograph, der (B) 2-Photonen-Bildgebung mit (C) automatisierter serieller Gewebeschnitterstellung umfasst. (D) Entnommene Gewebeschnitte für Nachuntersuchungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kachel-Stitching und Beleuchtungskorrektur. Die Kacheln werden vernäht und ungleichmäßige Ausleuchtungen werden durch korrigierte Intensitätsverteilungen mit Hilfe von Regularized Energy Minimization (CIDRE) korrigiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Segmentierung von Salmonellen , die das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, unter Verwendung einer Support Vector Machine (SVM) und eines Convolutional Neural Network (CNN). (A) Repräsentative Bilder von GFP-Objekten, segmentiert nach SVM (links) und entsprechende Bilder (rechts) mit Regionen, die nach SVM segmentiert sind (Maßstabsleiste: 10 μm). (B) Verteilung der gruppierten Rot-Grün-Blau-Werte (RGB) für die segmentierten Regionen. (C) Repräsentative Bilder von Nicht-GFP-Objekten, die von der SVM fälschlicherweise als Bakterien identifiziert wurden (links). CNN verwirft sie korrekterweise als Hintergrund (rechts, Maßstabsleiste: 10 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Nachweis von Salmonellen, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, mittels Tomographie und Bestätigung durch Immunhistochemie. Bilder desselben Schnitts, die durch Tomographie (links) oder konfokale Mikroskopie nach der Färbung mit einem Antikörper gegen Salmonella-Lipopolysaccharid (rechts) aufgenommen wurden. Neutrophile (rot) wurden durch In-vivo-Injektion eines PE-markierten Anti-Ly-6G-Antikörpers vor der Perfusion gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: 3D-Rekonstruktion und Lokalisierung von Salmonellen in infizierter Milz von Mäusen. (A) Dreidimensionale (3D) Rekonstruktion eines 5 mm dicken Milzschnitts, der in vivo vor der Perfusion mit einem Anti-CD169-Antikörper (rot) gefärbt wurde. Das blaue Signal stellt Kollagen dar, das durch die zweite Harmonische erkannt wird. (B) Eine optische Ebene des in (A) gezeigten 3D-Stacks. Die Positionen von Salmonellenzellen oder Mikrokolonien sind durch Sterne gekennzeichnet. (C) 3D-Rekonstruktion der Salmonellenpositionen (Sterne) in der infizierten Leber. Die Arterien sind anhand ihrer Kollagenscheiden (blau) sichtbar. Maßstabsleiste: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Der lokale Gewebekontext bakterieller Krankheitserreger ist entscheidend für die Bestimmung lokaler Wirtsangriffe, bakterieller Anpassungen, des lokalen Ergebnisses der Wirtserreger-Interaktionen und der antimikrobiellen Chemotherapie sowie der individuellen Beiträge zum Gesamtergebnis der Erkrankung. Die Abbildung von mikrometergroßen Bakterien in zentimetergroßen Organen war eine Herausforderung. Die serielle Zwei-Photonen-Tomographie (STP) bietet eine ausreichende räumliche Auflösung zum Nachweis einzelner Bakterienzellen in ganzen Organen, automatisierte Schnitte und Bildgebung sowie einen ausreichenden Durchsatz (~1 Organ pro Tag)11. Während Wirtsantigene in vivo gefärbt werden können, sollten Erregerzellen geeignete fluoreszierende Proteine exprimieren, um einen umfassenden Nachweis intrazellulärer Erregerzellen zu gewährleisten. Die daraus resultierenden Datensätze (0,5-1,5 TeraByte pro Organ) stellen IT-Infrastrukturen zur Datenanalyse und -speicherung vor erhebliche Herausforderungen.
Diese Methode umfasst mehrere kritische Schritte. Zunächst wird ein Erregerstamm mit nachweisbarer und homogener Expression des fluoreszierenden Proteins GFP oder YFP benötigt. Idealerweise wird eine chromosomale Expressionskassette25 verwendet, um die Fluoreszenzheterogenität aufgrund von Variation der Plasmidkopienzahl zu minimieren. Eine ausreichende Fluoreszenzintensität ist erforderlich, aber übermäßige Mengen an fluoreszierendem Protein sollten vermieden werden, um Fitnessbeeinträchtigungen des Erregerszu vermeiden 23. Geeignete Expressionsniveaus können durch Auswahl eines geeigneten Promotors und Feinabstimmung der ribosomalen Bindungsstelle25 oder der gesamten 5'-untranslatierten Region (UTR)26 erreicht werden. Zweitens sollte die Perfusionsfixierung eine erste Reinigung mit Puffer beinhalten, um so viele Erythrozyten wie möglich aus dem Blutkreislauf zu entfernen. Dies ist besonders kritisch für Milz und Leber (obwohl eine vollständige Entfernung von Erythrozyten aus diesen Organen schwierig ist). Verbleibende Erythrozyten absorbieren Licht im sichtbaren Teil des Spektrums und beeinträchtigen die Bildqualität27. Drittens ist die Lagerung des fixierten Gewebes im Kryoprotektivum entscheidend, um die Autofluoreszenz des Gewebes zu reduzieren, die bei entzündeten Geweben besonders hoch ist und die vergleichsweise schwache Fluoreszenz der Erregerzellen überschatten kann11. Viertens ist die effektive Vernetzung des Gewebes mit dem umgebenden Agaroseblock entscheidend für ein reibungsloses Vibratomschneiden, ohne dass das Gewebe aus dem Agaroseblock herausspringt. Fünftens müssen Fluoreszenzsignale und ihre Identifizierung als Erregerzellen unabhängig verifiziert werden, indem orthogonale Ansätze wie die Färbung mit Antikörpern gegen Erregerkomponenten (z. B. Lipopolysaccharid für gramnegative Bakterien) und die konfokale Mikroskopie der vom Tomographen entnommenen Schnitte11 verwendet werden. Einige infizierte Gewebe enthalten autofluoreszierende Partikel mit ähnlicher Form und überlappenden Fluoreszenzspektren, die leicht als Krankheitserregerzellen fehlinterpretiert werden können. Sechstens sollte die Menge der Erregerzellen innerhalb von Mikrokolonien mit orthogonalen Ansätzen wie der konfokalen Mikroskopie verglichen werden, um die Genauigkeit zu beurteilen. Die auf diesen Berechnungen basierende bakterielle Gesamtbelastung sollte durch Vergleich mit orthogonalen Ansätzen wie Durchflusszytometrie und Plattierung verifiziert werden.
Zu den wichtigen Modifikationen des weit verbreiteten STP-Protokolls gehört die Platzierung eines Schmalbandfilters 510/20 nm vor dem Photomultiplier 211, um die Interferenz der grün-gelben Autofluoreszenz zu reduzieren, die bei infizierter und entzündeter Leber, Milz und Peyer-Pflastern besonders stark ist. Die starke Autofluoreszenz und die erhöhte Lichtstreuung solcher Organe im Vergleich zum Gehirn (die andere Anwendungen von STP dominiert) erzeugen auch einen Bedarf an einer effektiveren Korrektur für ungleichmäßige Beleuchtung. Als weitere Modifikation verwendet dieses Protokoll zu diesem Zweck den CIDRE-Ansatz22 (Abbildung 3) und die KI-basierte Segmentierung von Bakterien. Schließlich wurde die Gewebevorbehandlung verändert, indem ein Inkubationsschritt in einem Kryoprotektivum bei -20 °C eingeschlossen wurde, der die Gewebeautofluoreszenz reduziert und somit den Nachweis kleiner Erregerzellen mit relativ schwacher Fluoreszenz erleichtert11.
Eine Fehlerbehebung kann erforderlich sein, wenn keine Erregersignale erkannt werden können oder die Segmentierung zu einer unzureichenden Sensitivität (zu viele Erregerzellen werden übersehen) oder zu einer unzureichenden Präzision (zu viele Hintergrundpartikel werden als Erregerzellen segmentiert) führt. Wenn die Autofluoreszenz des Hintergrundgewebes nachweisbar ist, aber zu wenige Erregersignale vorhanden sind, könnten die Erreger zu wenig fluoreszierende Proteine enthalten. Dies kann mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie von Gewebeschnitten aus demselben infizierten Gewebe oder der Durchflusszytometrie von Gewebehomogenaten getestet werden19,28. Dahinterliegende Gründe können unzureichende Expressionsniveaus oder eine Instabilität der Expressionskassette sein. Zu den Minderungsstrategien könnten alternative Promotoren gehören, um die Expression zu steuern, die Codon-Anpassung der Gene, die für das fluoreszierende Protein für die Erregerspezies kodieren, die Verwendung episomaler Konstrukte mit höherer Kopienzahl oder die Stabilisierung von Expressionskassetten durch chromosomale Integration oder balanciert-letale Komplementierung29. Die Wahl des fluoreszierenden Proteins ist ebenfalls wichtig, aber der Nachweis ist mit GFP.mut2, mWasabi, YPet und TIMERbac möglich. Wenn die Segmentierung ungenau ist, kann dies durch eine zu schwache Erregerfluoreszenz verursacht werden, die wie oben beschrieben behoben werden könnte, oder durch einen zu hohen Autofluoreszenzhintergrund des Gewebes. Eine umfangreiche Perfusion der Waschlösung oder eine längere Inkubation in Lagerpuffer unmittelbar vor der Einbettung in den Agaroseblock und die Tomographie können diese Probleme beheben. Schließlich ist für eine präzise Klassifizierung ein ausreichendes Training des neuronalen Netzes erforderlich, aber übermäßiges Training kann zu einer Überanpassung führen, die die Leistung für neue Stichproben beeinträchtigt.
Derzeit ist keine andere Methode in der Lage, ganze Organe mit ausreichender räumlicher Auflösung in 3D abzubilden, um einzelne Bakterien nachzuweisen. Zukünftige Verbesserungen bei der Gewebereinigung und der Lichtblattmikroskopie könnten eine ähnliche Auflösung erreichen. Dies könnte eine Bildgebung mit höherer Geschwindigkeit und mit mehr Fluoreszenzkanälen ermöglichen.
Eine wichtige Einschränkung von STP ist die Pixelauflösung in der Ebene von ~0,5 μm und die vertikale Auflösung von 5 bis 10 μm, die nicht ausreicht, um nahe gelegene Bakterien, z. B. innerhalb einer dicht gepackten Mikrokolonie, aufzulösen. Es ist jedoch möglich, Gewebeschnitte nach der Tomographie für die sekundäre hochauflösende konfokale Mikroskopie ausgewählter Gewebeteile zu gewinnen. Eine weitere Einschränkung von STP ist die Verfügbarkeit von nur drei Fluoreszenzkanälen, was die Anzahl der Fluorophore, die gleichzeitig abgebildet werden können, einschränkt. Auch hier kann die Sekundäranalyse von entnommenen Gewebeschnitten mit Multiplexing-Methoden die Lage und Intensität vieler weiterer Marker für ausgewählte Gewebeteile aufzeigen. Diese Informationen könnten in die gesamte 3D-Struktur des umgebenden Gewebes integriert werden, wie sie mit STP bestimmt wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll detaillierte Untersuchungen von Wirt-Pathogen-Interaktionen auf lokaler und ganzorganlicher Ebene ermöglicht. Das Protokoll sollte leicht an andere Krankheitserreger (sofern sie als fluoreszierende Stämme gewonnen werden können), andere Organe und verschiedene Wirtsarten angepasst werden können.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds 310030_156818, 310030_182315 und NCCR_ 180541 AntiResist (zur DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
| Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
| Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
| Equipment | |||
| Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
| MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
| Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
| TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
| Antibody/dyes | |||
| DAPI | Merck | D9542-5MG | |
| Primary antibodies | |||
| anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
| anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
| anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | ||
| chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
| Software | Company | Version | |
| Fiji | Image J | 1.54g or later | |
| MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
| Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
| Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
References
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