Summary
Este protocolo describe los pasos principales para obtener embriones de peces libres de gérmenes (GF) y mantenerlos desde las larvas hasta la etapa juvenil, incluido el muestreo y la detección de su estado estéril. El uso de modelos de GF con infección es importante para comprender el papel de los microbios en la salud del huésped.
Abstract
El pez cebra sirve como modelos valiosos para la investigación sobre el crecimiento, la inmunidad y la microbiota intestinal debido a sus similitudes genómicas con los mamíferos, embriones transparentes desarrollados en un entorno de corion relativamente limpio y un desarrollo extremadamente rápido de las larvas en comparación con los modelos de roedores. El pez cebra libre de gérmenes (Danio rerio) es crucial para evaluar la toxicidad de los contaminantes y establecer modelos de enfermedades similares a las humanas relacionadas con las funciones microbianas. En comparación con los modelos de cría convencional (CR) (peces en cría común), el pez cebra GF permite una manipulación más precisa de la microbiota del huésped, lo que ayuda a determinar la relación causal entre los microorganismos y los huéspedes. En consecuencia, desempeñan un papel fundamental en el avance de nuestra comprensión de estas relaciones. Sin embargo, los modelos de pez cebra GF generalmente se generan e investigan durante las primeras etapas de la vida (desde embriones hasta larvas) debido a limitaciones en la función inmune y la absorción de nutrientes. Este estudio optimiza la generación, el mantenimiento y la identificación de modelos tempranos de pez cebra GF sin alimentación y con alimentación a largo plazo utilizando alimentos GF (como Artemia sp., camarones en salmuera). A lo largo del proceso, se realizaron muestreos e identificados diariamente a través de múltiples detecciones, incluidas placas y secuenciación de ARNr 16S. Se registraron la tasa de aséptica, la supervivencia y los índices de desarrollo del pez cebra GF para garantizar la calidad y cantidad de los modelos generados. Es importante destacar que este estudio proporciona detalles sobre el aislamiento bacteriano y las técnicas de infección para peces GF, lo que permite la creación eficiente de modelos de peces GF desde las etapas larvales hasta juveniles con el apoyo alimenticio de GF. Al aplicar estos procedimientos en la investigación biomédica, los científicos pueden comprender mejor las relaciones entre las funciones bacterianas intestinales y la salud del huésped.
Introduction
La microbiota (es decir, arqueas, bacterias, eucariotas y virus) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud del huésped y contribuye al desarrollo de diversas enfermedades al influir en los procesos fisiológicos y patológicos a través de interacciones simbióticas dentro de la barrera intestinal, la superficie epitelial y las funciones de la mucina en los individuos 1,2,3. La composición de la microbiota en las diferentes etapas de la vida, desde la infancia hasta la juventud, la adultez y el envejecimiento, así como su presencia en diversos lugares, como las narinas, la boca, la piel y los intestinos, está moldeada dinámicamente por diversos hábitats y entornos4. La microbiota intestinal de los organismos está implicada en la absorción de nutrientes, la respuesta inmunitaria, la invasión de patógenos, la regulación metabólica, etcétera 5,6. Los estudios en pacientes han demostrado que las alteraciones de la microbiota intestinal están relacionadas con la obesidad humana, los trastornos del sueño, la depresión, la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), las enfermedades neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), el envejecimiento y diversos tipos de cáncer 7,8,9. Además, las vías interactivas entre la microbiota intestinal y los huéspedes involucran factores inflamatorios, neurotransmisores, metabolitos, barrera intestinal y estrés oxidativo, como se observó en investigaciones anteriores con modelos de ratones y peces10,11.
Recientemente, se han explorado múltiples enfoques o terapias relacionados con las bacterias, incluidos los posibles probióticos y el trasplante de microbiota fecal (TMF), para estos trastornos en modelos clínicos y animales. Estas exploraciones se basan en descubrimientos relacionados con el eje microbiota-intestino-cerebro/hígado/riñón, los productos derivados de la microbiota y la alteración de la actividad de los receptores12,13. Sin embargo, el desarrollo, las diversas funciones y los mecanismos del sistema microbiota-huésped aún no se comprenden e identifican completamente debido a la complejidad de la comunidad microbiana y al desafío de generar modelos potentes de enfermedades similares a los humanos.
Para abordar estos problemas, a mediadosdel siglo XIX se propusieron urgentemente modelos animales libres de gérmenes (GF) y se desarrollaron principalmente durante el sigloXX. Los refinamientos posteriores, incluidos los modelos tratados con antibióticos y gnotobióticos, junto con los avances en las tecnologías de detección y observación microbiana, perfeccionaron aún más estos modelos 14,15,16. Los animales GF, creados borrando su propio fondo y evitando los microbios ambientales, ofrecen una excelente estrategia para explorar las interacciones entre los microorganismos y sus huéspedes17. A través de la aplicación de modelos animales y protocolos refinados, los investigadores han replicado con éxito composiciones microbianas similares encontradas en pacientes con ratones y peces GF. Además, otros modelos animales de GF, como perros, pollos y cerdos, ofrecen diversas opciones como sujetos de investigación 18,19,20,21. Este enfoque ha permitido investigar los posibles efectos terapéuticos de los microbiomas comensales en diversas enfermedades, incluida la inmunoterapia contra el cáncer en humanos16,18. Los modelos GF ofrecen información más precisa sobre las características y los mecanismos de la colonización, migración, multiplicación e interacción bacteriana específica dentro de los huéspedes. Esto proporciona nuevos conocimientos cruciales sobre la aparición y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microbiota22,23. La historia del establecimiento y la aplicación del pez cebra GF en la investigación microbiana ha evolucionado desde los informes de Rawls et al. en 2004 y Bates et al. en 2006 hasta el protocolo de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Sin embargo, la viabilidad de los modelos de GF adultos o reproductivos sigue siendo un proceso prolongado, acompañado de longevidad, tasas de éxito y desafíos de salud variables.
Entre varios modelos animales, el pez cebra (Danio rerio) se destaca como una herramienta crítica para la investigación básica y biomédica debido a su ventajosa similitud con los órganos humanos y la genómica, su corto ciclo de desarrollo, su alta fecundidad y sus embriones transparentes19,26. El pez cebra, que sirve como modelo fiable de enfermedades humanas, ofrece una representación visual de los procesos fisiológicos y patológicos in vivo, proporcionando información sobre las atractivas características de las interacciones huésped-microbio. En particular, el pez cebra exhibe linajes celulares distintos, lo que permite obtener imágenes de la fisiología intestinal, la dinámica microbiana, las gónadas y el desarrollo reproductivo, la maduración del sistema inmunológico del huésped, el comportamiento y el metabolismo. Los embriones de pez cebra se desarrollan dentro de coriones protectores hasta la eclosión, convirtiéndose en larvas a los 3 días después de la fertilización (dpf). Cazan activamente alimento a los 5 dpf y alcanzan la madurez sexual alrededor de los 3 meses después de la fertilización (mpf)28. El primer pez cebra libre de gérmenes (GF) exitoso, reportado por Rawls et al.24, mostró que las larvas alimentadas con alimento esterilizado en autoclave después de la absorción de la yema exhibieron necrosis tisular a partir de 8 dpf y muerte total a 20 dpf. Esto indicó los efectos de la dieta o la importancia de considerar el suministro de nutrientes exógenos en experimentos con peces GF a largo plazo (>7 dpf)29. Estudios posteriores mejoraron el protocolo de generación de peces GF, empleando alimentos estériles y métodos perfeccionados en diferentes modelos de peces16.
Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre modelos de pez cebra GF se han centrado en las primeras etapas de la vida, involucrando infección bacteriana a 5 dpf durante 24 h a 48 h, con muestras recolectadas antes de 7 dpf al final de los experimentos 25,30,31. Es ampliamente reconocido que la microbiota de los organismos, incluidos los humanos y el pez cebra, se coloniza al comienzo de la vida y se moldea durante el crecimiento y el desarrollo. La composición se mantiene estable en las etapas adultas, y el papel de la microbiota en el huésped es crucial a lo largo de la vida, especialmente en los aspectos relacionados con el envejecimiento, la obesidad neurodegenerativa, la obesidad metabólica y las enfermedades intestinales3. Por lo tanto, las perspectivas de los animales GF con una supervivencia más larga pueden proporcionar información sobre los mecanismos de los roles microbianos en el desarrollo y las funciones de los órganos del huésped, considerando los sistemas inmunológico y reproductivo inmaduros de las larvas de peces en los primeros años de vida. Si bien las cepas bacterianas en los intestinos del pez cebra se han aislado e identificado en estudios previos, lo que ofrece el potencial de infectar modelos animales GF para seleccionar probióticos o investigar las funciones bacterianas en el huésped19,25, la generación y aplicación de modelos de peces GF se ha restringido principalmente a las primeras etapas de la vida. Esta limitación, atribuida al complejo proceso de producción, a los elevados costes de mantenimiento y a los problemas asociados con la alimentación y la inmunidad, dificulta los esfuerzos de investigación destinados a investigar los efectos crónicos y del desarrollo de la microbiota en el huésped.
La tasa de supervivencia, el comportamiento, el crecimiento, la maduración y la salud general de los peces, especialmente en modelos libres de gérmenes (GF), están significativamente influenciados por las prácticas de alimentación, que abarcan la ingesta y absorción de nutrientes durante el período de apertura de la boca desde las larvas tempranas hasta los juveniles32,33. Sin embargo, uno de los desafíos en la cría de peces transgénicos es la escasez de dietas estériles adecuadas, lo que limita la efectividad del apoyo nutricional para mantener el crecimiento y la supervivencia de las larvas. Resolver este problema es crucial para restaurar la vida de los peces GF, teniendo en cuenta sus mecanismos de defensa del desarrollo y su débil capacidad de digestión debido a la ausencia de un microbioma intestinal. En términos de alimentación, el camarón de salmuera vivo (Artemia sp.) emerge como la dieta más adecuada para las larvas con la boca abierta a los peces juveniles. Se ha observado que los peces alimentados con camarones vivos exhiben mayores tasas de crecimiento y supervivencia en comparación con los alimentados con yema de huevo cocida u otros cebos naturales y sintéticos34. Si bien los modelos de vida temprana de los peces GF pueden sobrevivir con el apoyo de la yema y los modelos de larvas GF pueden mantenerse con alimentación estéril, la generación de modelos a largo plazo desde larvas hasta juveniles y alcanzar la madurez sexual sigue siendo un desafío. Además, los alimentos en escamas o en polvo están limitados por una composición nutricional desigual y pueden afectar la calidad del agua. Por el contrario, la Artemia viva tiene ventajas como la supervivencia tanto en agua salada como dulce, tamaño pequeño adecuado para larvas y adultos, facilidad de procesamiento por lotes y mayor calidad de eclosión35. Sobre la base de los métodos anteriores 16,24,30, hemos simplificado el complejo proceso de tratamiento y abordado el desafío de la dieta al establecer Artemia sp. viva GF fácilmente incubable como alimento estéril durante períodos más largos que los peces GF tempranos.
Este estudio presenta un protocolo optimizado que cubre (1) la generación, (2) el mantenimiento, (3) la identificación de la tasa de esterilidad y (4) el mantenimiento y la alimentación para garantizar el crecimiento del pez cebra libre de gérmenes (GF) desde los embriones hasta las larvas y las etapas juveniles. Los resultados ofrecen evidencia preliminar sobre la eclosión, supervivencia, crecimiento y esterilidad del pez cebra GF, junto con índices esenciales para GF Artemia sp. como alimento estéril. Los pasos detallados en la generación de modelos y la preparación de alimentos vivos estériles proporcionan un apoyo técnico crucial para la construcción y aplicación de modelos a largo plazo de peces GF, así como de GF Artemia sp. en la investigación de la interacción entre la microbiota y el huésped. El protocolo aborda el aislamiento, la identificación y la infección bacteriana en modelos de peces GF, describiendo métodos para el etiquetado de fluorescencia bacteriana y observando su colonización en los intestinos de los peces bajo un microscopio. Los peces GF, los peces gnotobióticos con infección bacteriana o los modelos de microbiota humana transferidos se someterán a diversas detecciones para dilucidar sus funciones y efectos sobre la inmunidad del huésped, la digestión, el comportamiento, la regulación transcriptómica y los aspectos metabólicos. A largo plazo, este protocolo puede extenderse a diferentes especies de peces de tipo salvaje, como la medaka marina, y potencialmente a otras líneas de pez cebra transgénicas seleccionadas correlacionadas con tejidos o enfermedades específicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los experimentos con peces se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Chongqing y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Chongqing, China, así como con las normas para animales de experimentación emitidas por la Oficina Estatal de Calidad y Supervisión Técnica (ID de aprobación: GB14922-2001 a GBT14927-2001). El pez cebra (Danio rerio, tipo salvaje, cepa AB) se obtuvo del Instituto de Hidrobiología de la Academia China de Ciencias y se mantuvo en el laboratorio siguiendo los procedimientos previamente informados36.
1. Mantenimiento y recolección de embriones de pez cebra adulto
NOTA: Sobre la base de las modificaciones de los estudios e informes anteriores 16,37,38,39, el mantenimiento del pez cebra adulto, la cría de larvas y las prácticas para modelos libres de gérmenes (GF) en nuestro laboratorio se llevaron a cabo siguiendo los pasos que se describen a continuación. El sistema de flujo ultrapuro para el cultivo de peces se obtuvo comercialmente (ver Tabla de Materiales). El agua, mantenida con un pH, sal y álcali equilibrados, se filtra durante el ciclo para garantizar condiciones limpias.
- Mantener peces adultos con el siguiente procedimiento estándar en el sistema de ciclo automático (ver Tabla de Materiales) con un fotoperiodo de oscuridad: luz = 10 h: 14 h a 28 °C ± 0,5 °C y alimentados con Artemia sp fresca incubada. dos veces al día.
- Coloque el pez cebra adulto sexualmente maduro (macho: hembra = 2:1) en tanques con agua fresca y limpia la noche anterior.
- Deje que los peces desoven a la mañana siguiente (aproximadamente a las 8:30 a.m.) bajo estimulación lumínica regular en el laboratorio. Después de 1-2 h, transfiera el pez a otro tanque.
- Recoja los embriones en agua desde el sistema de auto-ciclado como medio de cría en una placa de cultivo utilizando una pipeta Pasteur desechable.
2. Generación de pez cebra GF de embriones a larvas
NOTA: El procedimiento para generar peces libres de gérmenes (GF) se describe en la Figura 1, mientras que los índices básicos de desarrollo de los modelos convencionales (CR) y GF se presentan en la Figura 1 suplementaria. Siga los pasos que se describen a continuación en una cabina de seguridad biológica de sobremesa o una campana de flujo laminar utilizando una técnica aséptica estéril en una sala limpia.
- Lavar los embriones con el agua de cultivo de peces y eliminar las heces, las impurezas y los huevos muertos o no fertilizados.
- Transfiera los embriones a 2 hpf a placas esterilizadas (hasta 480 embriones por placa estéril de 10 cm de diámetro) llenas de solución de medio antibiótico para pez cebra libre de gérmenes (AB-GZM, consulte la tabla de materiales) y cultive a 28,5 °C durante 6-8 h.
NOTA: AB-GZM se utiliza para tratar los embriones durante varias horas para eliminar los microorganismos de la superficie, y GZM sin antibióticos se utiliza para cultivar peces GF en subsecuencia. Por lo general, el tiempo de cultivo perfeccionado es de 6 h). - Excluya los huevos con manchas blancas o de aspecto blanquecino, y seleccione aquellos que estén normalmente desarrollados, mostrando sobres transparentes e intactos para su posterior procesamiento.
- Enjuague los embriones con AB-GZM tres veces en 10 minutos.
- Remojar los embriones en una solución de povidona yodada (PVP-I) de 0,2 g/L durante 1 min (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Una concentración más alta y más de 2 minutos influirá en la tasa de muerte y eclosión de los embriones. - Lave los embriones con medio de pez cebra libre de gérmenes (GZM) tres veces en 10 minutos.
- Agregue los embriones a la solución de trabajo de hipoclorito de sodio (NaClO), cubra herméticamente los tubos de microcentrífuga de 50 ml y lejíbase durante 15 minutos. Durante este período, suspenda los embriones en una solución de lejía agitándolos suavemente.
- Lavar los embriones con GZM tres veces en 10 minutos.
- Transfiera los embriones a placas estériles de 6 pocillos con 5 embriones y 10 mL de GZM por pocillo. Cultivarlos en una plataforma o incubadora ultralimpia con un fotoperiodo de oscuridad: luz = 10 h: 14 h a 28 °C ± 0,5 °C. La densidad de cultivo influirá en la tasa de esterilidad.
- Renueve el medio de cultivo diariamente eliminando el GZM gastado, recogiéndolo como muestras para la detección del estado estéril y reponiendo cada pocillo con el mismo volumen de GZM estéril.
- Registre los índices básicos de desarrollo de los embriones/larvas GF, incluida la tasa de supervivencia, la tasa de eclosión, los latidos del corazón, la longitud y el peso corporales, etcétera19.
- Transfiera el pez GF a recipientes adecuados (platos, matraces de cultivo celular o botellas de vidrio con tapas) con volumen expandido, proporcionando alimento estéril durante todo el proceso de crecimiento.
3. Mantenimiento del pez cebra GF desde larvas hasta juveniles
- Renueve el GZM sin alimentación antes de los 7 dpf y detecte diariamente los estados estériles (ver paso 5).
- Alimente las larvas de pez cebra desde los 8 dpf hasta las etapas juveniles con yema de huevo estéril (10 μL de solución madre preparada por pocillo) una vez al día antes de cambiar GZM.
- Alimente a los juveniles GF a partir de 14 dpf con yema de huevo esterilizada mezclada con GF Artemia sp. una vez al día (1-3 Artemia/larvas, ver paso 4), aumentando gradualmente la masa alimenticia con el crecimiento y desarrollo de los peces GF.
- Proporcione yema de huevo hasta que todos los peces puedan consumir nauplios de Artemia.
NOTA: GF Artemia debe someterse a pruebas de esterilidad antes de su uso. Evalúe el número de nauplios de Artemia que quedan, observe el progreso de la persecución y la captura, y examine el cuerpo del pez con el alimento consumido para indicar el éxito de la alimentación. - Desde los 28 dpf hasta las primeras etapas adultas, alimentar a GF Artemia una vez al día (3-5 Artemia/larvas) y limpiar Artemia muerta o sin explotar, y peces muertos en los residuos de GZM como muestras diarias.
- Durante el crecimiento de los peces GF, cambie las placas de 6 pocillos después de 7 dpf por placas estériles o matraces de cultivo celular de 8 a 21 dpf, y luego a botellas estériles después de 21 dpf. Aumente el medio de cultivo y la masa de alimento de acuerdo con el número y peso de peces GF en cada recipiente.
- Renueve GZM diariamente y verifique las muestras para garantizar el éxito de los modelos GF.
NOTA: Mantener modelos de peces libres de gérmenes (GF) hasta la edad adulta temprana y la madurez sexual es un desafío, con una tasa de supervivencia promedio baja a 30 dpf, generalmente menos del 10%. Esto se atribuye principalmente a una inmunidad débil, un retraso en el desarrollo y un deterioro de la función intestinal.
4. Preparación de nauplios de Artemia GF como alimento estéril para modelos de peces GF crónicos
NOTA: El método de cultivo y preparación de Artemia libre de gérmenes (GF) se describe en la Figura 2. Tenga en cuenta que todos los pasos siguientes se llevan a cabo en un gabinete de seguridad biológica de sobremesa, utilizando una técnica aséptica estéril.
- Enjuague 0,25 g de quistes de Artemia con 2,4 g/L de hipoclorito de sodio (NaClO, ver Tabla de Materiales) durante 5 min.
- Filtre los quistes de Artemia enjuagados con un filtro ultradenso esterilizado (alrededor de 170 mallas de apertura) y lave con agua ultrapura esterilizada tres veces, cada vez durante 1-2 minutos.
- Transfiera los quistes de Artemia lavados a 100 mL de agua salina esterilizada al 2.5%, mezcle y empaque para la eclosión aséptica de acuerdo con los pasos que se mencionan a continuación.
- Envasar la solución de mezcla de quistes de Artemia tratados con 50 ml en un frasco estéril con un volumen de 100 ml, sellarlo con una película e incubar en una incubadora agitadora a 150 rpm, 30 °C durante 18 h a 24 h con luz.
- Extraiga aproximadamente 30 mL de nauplios de Artemia para eclosionar de las capas intermedia e inferior utilizando una pipeta Pasteur desechable.
NOTA: Evite que los huevos flotantes y las cáscaras vacías alcancen la capa superior. En la Figura 3 se presentan los índices de quistes y nauplios de Artemia libres de gérmenes (GF) incubados durante 24 h. - Filtre las Artemias con un filtro esterilizante y lávelas en un vaso de precipitados esterilizante con agua ultrapura esterilizante tres veces, aproximadamente de 30 s a 1 min cada vez. Por último, añadir 4 mL de agua ultrapura esterilizada para preparar la solución mezclada de Artemia .
- Con una pipeta Pasteur desechable, recupere la Artemia que nada activamente de la capa superior, lave y prepare la solución de nauplios para la alimentación y la identificación aséptica.
5. Identificación de modelos de peces GF en todas las etapas de la vida
NOTA: A lo largo de todas las etapas de vida de los peces libres de gérmenes (GF), los índices clave y las detecciones diarias de muestras son cruciales para garantizar el éxito de los modelos. Este paso resume la clasificación común de las muestras y los métodos habituales de identificación (Figura 4).
- Observe y cuente diariamente el estado de supervivencia y la tasa de larvas de pez cebra GF. En experimentos que calculan tasas relacionadas, los peces GF se cultivan en placas de 24 o 48 pocillos con un pez por pocillo.
- Tasa de supervivencia = (número de peces vivos en el momento de la observación / número total de huevos) × 100%.
- Tasa de esterilidad = (número de peces estériles/número de peces supervivientes) × 100%.
NOTA: Este protocolo se centra en la tasa de esterilidad de peces vivos. El número de peces estériles se determina contando los peces GF exitosos después de múltiples controles entre los peces vivos. Cualquier modelo de GF de peces muertos o peces vivos que haya fallado debido a la presencia bacteriana se elimina durante los procedimientos posteriores de GF.
- Recoja las siguientes muestras de larvas de pez cebra GF.
- Medio de cultivo de pez cebra GF de cada pocillo o contenedor de botella.
- Alimento para peces, como yema de huevo estéril y GF Artemia.
- Medio de desecho, incluidos fragmentos de la membrana del huevo después de la eclosión y residuos de alimentos o heces durante los períodos de alimentación de larvas a peces juveniles.
- Muestras de peces muertos para identificar la presencia de bacterias.
- Medio y agentes de peces utilizados en el tratamiento embrionario como control estéril.
- Muestras de materiales, plataforma operativa e incubadora, etcétera.
- Detecte las muestras recogidas diariamente utilizando múltiples métodos.
- En primer lugar, utilice el método de la placa extendida y las placas de cultivo en una incubadora a 30 °C.
- Cubra con 20-50 μL de muestra de medio residual en la placa de agar de soja tripticasa (TSA) (consulte la tabla de materiales) en condiciones aeróbicas.
- Cubrir con 20-50 μL de muestra de medio residual en la placa TSA en condiciones anaeróbicas.
- Cubrir con 20-50 μL de muestra de medio residual en las placas de TSA de sangre (ver Tabla de Materiales) en condiciones aeróbicas.
- Cubrir con 20-50 μL de muestra de medio residual en las placas de TSA de sangre en condiciones anaeróbicas.
- En segundo lugar, utilice el método de cultivo líquido.
- Introducir 200 μL de muestra en tubos aeróbicos con medio Brain Heart Infusion Calth (BHI) (ver Tabla de Materiales) y cultivar en la incubadora de agitación a 30 °C, 150-180 rpm.
- Añadir 200 μL de muestra en tubos anaeróbicos con medio BHI y cultivar en la incubadora a 30 °C.
- Añadir 200 μL de muestra en tubos aeróbicos con medio de caldo de soja tripticasada (TSB) y, a continuación, cultivar en la incubadora agitadora a 30 °C, 150-180 rpm.
- Añadir 200 μL de muestra en tubos anaeróbicos con medio TSB y cultivar en la incubadora a 30 °C.
- En tercer lugar, utilice técnicas moleculares-ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 16s.
- Analice la muestra de aguas residuales con dos pares de cebadores 27F y 1492R, así como 63F y 1387R (Tabla 1).
NOTA: La mezcla maestra de PCR se preparó de acuerdo con la Tabla 2 utilizando un kit de ADN polimerasa disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales), y la máquina de PCR se configuró con el programa especificado en la Tabla 3. - Una vez completado el programa de PCR, examine los productos mediante electroforesis en gel de agarosaal 1% 40 en bandas objetivo de 1465 pb (utilizando los cebadores 27F y 1492R) o 1324 pb (utilizando los cebadores 63F y 1387R) para inferir la esterilidad de las muestras.
- Analice la muestra de aguas residuales con dos pares de cebadores 27F y 1492R, así como 63F y 1387R (Tabla 1).
- En primer lugar, utilice el método de la placa extendida y las placas de cultivo en una incubadora a 30 °C.
- Registre y observe las pruebas de esterilidad, incluyendo el cultivo en placa y en medio de 24 h a 3 días y 7 días, durante los cuales ninguna colonia en las placas y ninguna turbidez en el líquido indican el éxito de la construcción de los modelos GF. Observe y registre la placa y el medio a las 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h y 168 h.
6. Identificación de muestras de Artemia GF antes de alimentarse de peces GF
NOTA: Para detectar las muestras de GF Artemia , que son indispensables como alimento vivo antes de alimentarse de peces GF (Figura 4), siga los pasos a continuación.
- Recoja muestras de modelos de GF Artemia .
- Quistes de artemia no tratados.
- Quistes de artemia GF tratados.
- Nauples de Artemia GF eclosionados.
- Agua ultrapura esterilizada como control.
- Detecte la artemia GF con los siguientes métodos.
- Utilice el método de placa extendida para detectar las muestras recubriéndolas con placas TSA y placas TSA sanguíneas en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Incubarlos a 30 °C.
- Utilice un medio líquido para detectar las muestras en tubos TSB y BHI aeróbicos y anaeróbicos. Cultivo en agitador a 150-180 rpm, 30 °C.
- Utilice el ensayo de PCR para detectar la presencia de bacterias en las muestras recogidas utilizando los genes diana de ARN ribosómico 16s cebadores 27F y 1492R, 63F y 1387R (Tabla 1). El volumen y el programa se muestran en la Tabla 2 y la Tabla 3.
- Registre los resultados: Detecte el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosaal 1% 40 para bandas diana que midan 1465 pb (con cebadores 27F y 1492R) o 1324 pb (con cebadores 63F y 1387R). Los resultados de las placas y el medio líquido pueden garantizar el estado estéril de GF Artemia antes de ser utilizado como alimento para peces GF.
7. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas intestinales de pez cebra
NOTA: Para explorar las funciones intestinales in vitro e in vivo, es necesario aislar las cepas bacterianas del pez cebra, que también proporcionan la fuente de la especie para los posibles probióticos cribados por infección con animales GF (Figura 5). En este protocolo, describimos el método tradicional de disección para obtener el contenido intestinal, mientras que las muestras también se pueden recolectar directamente de peces vivos anestesiados (datos no mostrados).
- Elija peces cebra adultos sanos y lávelos con agua estéril. Realice los siguientes pasos en el banco limpio.
- Anestesiar al pez con 100 mg/L MS-222 durante 5-10 min.
- Use alcohol al 75% para tratar la superficie corporal del pez.
- Diseccionar los intestinos de los peces y extruir el contenido intestinal con medio TSB o BHI.
- Incubar el sobrenadante intestinal mediante la aplicación de TSA, placa de sangre, TSB y medio BHI en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
- Traduzca las bacterias para obtener la tensión de señal y registre las características de las diferentes colonias.
- Almacene las bacterias dentro de un 30% de glicerol a -80 °C.
- A continuación, identificar las bacterias intestinales mediante extracción de ADN genómico y secuenciación por PCR.
NOTA: Los pasos principales de la extracción de ADN genómico bacteriano incluyen la centrifugación líquida, la disociación de la RNasa A y la proteasa K, la extracción, el enjuague y la disolución con alcohol etílico utilizando kits disponibles comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). - Analice las secuencias 16S utilizando el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST) con la base de datos de Bacterias y Arqueas40,41 (ver Tabla de Materiales).
- Elija las bacterias y los caracteres que mejor coincidan para identificar las cepas intestinales aisladas a nivel de género.
- Detectar las funciones metabólicas de las cepas bacterianas utilizando kits disponibles en el mercado (ver Tabla de Materiales).
8. Etiqueta de gripe, infección y colonización de bacterias en intestinos de pez cebra GF
NOTA: Antes de infectar al pez cebra GF, las bacterias aisladas se modificaron con colorantes y se contaron, haciendo visible la colonización y migración microbiana de forma continua e in vivo (Figura 6).
- Elija bacterias potencialmente beneficiosas o cepas dominantes con alta abundancia en el huésped para infectar los modelos de peces GF.
NOTA: Las bacterias utilizadas en este estudio fueron Aeromonas sp. y Vibrio sp. (ver Tabla de Materiales), seleccionadas de los 8 géneros que se aislaron e identificaron a partir de peces cebra adultos tipo silvestre en el laboratorio42. - Etiquete las bacterias frescas con colorantes CM-Dil (consulte la Tabla de materiales) y expóngalas al pez cebra GF a 5 dpf con una concentración de 10 6-10 8 Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/mL.
- Observe la fluorescencia bajo el microscopio fluorescente con un aumento de 3× para indicar la colonización y distribución de bacterias en el intestino de las larvas de pez cebra GF de 6 dpf a 14 dpf.
- Cuente manualmente el número de bacterias en los peces GF por cultivo en placa en cada punto de tiempo.
- Detecte las colonias y secuencias para asegurarse de que la infección tuvo éxito con las cepas bacterianas objetivo.
- Recoja muestras de peces GF con infección bacteriana para ensayos posteriores, incluidos el comportamiento neurológico, los índices de desarrollo, el análisis histopatológico y las mediciones hormonales, etcétera 43,44,45.
NOTA: Las bacterias utilizadas en el experimento de infección deben ser recién recuperadas y recién cultivadas por el medio líquido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los modelos de pez cebra GF se pueden producir de manera eficiente utilizando los abundantes huevos desovados por parejas de peces cebra, con el protocolo optimizado sobre la base de modelos anteriores de peces GF35. Una sola placa de 6 pocillos puede cultivar aproximadamente de 30 a 48 embriones/larvas, lo que permite una amplia recopilación de datos y análisis estadísticos. Después del tratamiento estéril, los embriones GF se cultivan en una incubadora limpia hasta la eclosión de las larvas a las 48-72 h, y se cambian diariamente de GZM con la detección de las muestras recogidas, lo cual es crucial para mantener el estado libre de gérmenes (Figura 1). Después de 7 dpf, el alimento de yema de huevo y Artemia viva debe prepararse para las etapas de larvas a juveniles. Durante el crecimiento y desarrollo de los peces, el volumen, el recipiente y la densidad de GZM deben regularse o cambiarse a tiempo para evitar la muerte y el fracaso del estado estéril. Si la detección no muestra contaminación bacteriana, los modelos exitosos de GF pueden mantenerse como crónicos desde la juventud hasta la edad adulta temprana, pero la tasa de supervivencia es mucho menor en la práctica. Por último, se puede medir la tasa de esterilidad, la tasa de supervivencia, el índice de desarrollo, el comportamiento, el análisis histopatológico y el perfil de transcripción de los modelos de peces GF y CR para explorar la influencia de la microbiota y los campos de cribado de fármacos. En este estudio, se compararon los índices clave de desarrollo (Figura suplementaria 1), y la tasa de eclosión de los peces GF fue un 45,7% más baja que la de los peces CR, con un 60% a 72 hpf. Las frecuencias cardíacas de las larvas de GF a 7 dpf fueron significativamente más bajas a 18,2 latidos/10 s en comparación con los peces CR con 22,6 latidos/10 s, pero no hubo diferencia entre los dos grupos a 14 dpf con tasas de 23,5-23,8 latidos/10 s. La tasa de supervivencia de los peces GF a 7 dpf fue la misma que la de los peces CR en un 86,7%, pero disminuyó al 60% a 14 dpf en comparación con el 80% de los peces CR. Sin embargo, las tasas de supervivencia de los peces GF y CR disminuyeron a 25%-10% después del período de boca abierta cuando adquirieron habilidades o hábitos alimenticios. El hecho de que los peces no mantuvieran el estado estéril fue una de las razones de la menor tasa de supervivencia. Por lo tanto, la alimentación y el mantenimiento de nutrientes desde las etapas juveniles hasta la adultez temprana son desafíos críticos en la piscicultura.
Otro factor clave que afecta el crecimiento y desarrollo de los peces es la alimentación. En este estudio, exploramos múltiples métodos para obtener GF Artemia como alimento vivo para larvas de pez cebra GF a largo plazo para juveniles y adultos (proceso mostrado en la Figura 2). Debido al uso diario de alimentos para los peces GF, el protocolo optimizado para GF Artemia debería ser fácil, rápido y económico en la práctica. Después de comparar el movimiento activo y la muerte/inmovilidad de los nauplios observados por el microscopio, las características de los nauplios, los huevos no eclosionados y la cáscara, se perfecciona el método. Después de la incubación diaria, se observaron y midieron bajo el microscopio los índices de GG Artemia fresca obtenidos de los biberones, incluyendo la eclosión, la supervivencia y la tasa de deformidad, y la longitud y el peso de los nauplios (Figura 3). Después del tratamiento, la tasa de eclosión de los quistes de Artemia fue alta, con un promedio del 88,15%, la supervivencia de los nauplios nadadores fue del 77,83% y la tasa de malformaciones fue del 1,87%. La longitud corporal de los nauplios fue de 546,70 μm y el índice de peso corporal fue de 3,80 mg/100, los cuales son adecuados para la captura y alimentación de peces desde el período de larvas hasta las etapas juveniles y adultas.
La detección de peces GF y GF Artemia también es importante para el mantenimiento del modelo. De acuerdo con la recolección de muestras y múltiples métodos de prueba, los resultados pueden proporcionar el éxito de los embriones de pez cebra tratados y los quistes de Artemia en la placa cultivada y en el medio líquido (Figura 4). Las distintas muestras recogidas diariamente deben detectarse como estériles en todos los métodos de ensayo, que pueden indicar los modelos GF en el momento de la recogida. La artemia GF debe detectarse antes de alimentarse con peces GF, o los resultados de la incubadora en placa y medio deben referirse al estado estéril de los nauplios vivos frescos. Es decir, cultivar GF Artemia a partir de quistes en placas TSA o vidrio de medio líquido TSB o BHI en incubación por batido, que podría usarse para generar GF Artemia y verificación estéril al mismo tiempo. El protocolo GF Artemia puede acomodar un número limitado de larvas para alimentarse. Durante el proceso de alimentación, se evidenció que la Artemia GF nadaba dentro de la GZM y luego fue capturada y consumida por las larvas de peces GF.
Las aplicaciones de los modelos de peces GF involucran diversos campos de la biología y la medicina, permitiendo la investigación de las funciones microbianas, el crecimiento y el desarrollo, los mecanismos de enfermedades y el cribado de probióticos o fármacos, entre otros46. En este estudio, por ejemplo, se aislaron dos bacterias intestinales principales, Aeromonas sp. y Vibrio sp., del pez cebra. Se realizaron las características e identificación de las colonias, y se midieron múltiples funciones metabólicas in vitro utilizando kits disponibles en el mercado (Figura 5). Estas bacterias fueron aisladas e identificadas con secuenciación 16S, y los resultados del blasto fueron presentados en un informe previo42. Las cepas bacterianas identificadas permiten la investigación científica sobre el impacto de la microbiota única o combinada en la salud del huésped mediante la infección de los modelos de peces GF. La transparencia de las larvas de peces permite la observación de células bacterianas marcadas con fluorescencia utilizando colorantes CM-Dil, revelando la colonización y distribución en los intestinos de los peces GF (como se muestra en la Figura 6). Después de una infección bacteriana a 5 dpf, las larvas de pez cebra GF pueden ser visualizadas con un microscopio de fluorescencia y observadas continuamente de 6 a 14 dpf, proporcionando información sobre las funciones microbianas combinadas con los índices de desarrollo, los cambios histopatológicos y las alteraciones moleculares47.
Figura 1: Protocolo del pez cebra GF desde embriones hasta larvas y juveniles. Los pasos clave en la generación del pez cebra GF incluyen: (1) Recolección de embriones de pez cebra de tipo salvaje y colocación en AB-GZM. (2) Tratamiento de enjuague con agentes PVP-I y NaClO para garantizar una esterilidad completa. (3) Cultivo de embriones/larvas GF en placas de 6 pocillos con GZM, renovando el medio diariamente. (4) Regulación de las condiciones de cultivo para un crecimiento y desarrollo óptimos. (5) Toma de muestras en varias etapas de desarrollo, seguidas de pruebas de esterilidad utilizando métodos de placa y medio líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Protocolo de preparación de GF Artemia como alimento vivo para peces GF. Los pasos clave incluyen: (1) Tratamiento de enjuague de los quistes de Artemia para una esterilidad completa. (2) Preparación de quistes GF en el medio. (3) Incubación en una solución salina durante 24 h para favorecer la eclosión. (4) Filtración de eclosión fallida y huevos vacíos para recolectar nauplios activos. (5) Lavado de nauplios recolectados para eliminar los desechos, asegurando alimentos vivos de alta calidad y libres de contaminantes. (6) Pruebas de esterilidad de la Artemia GF antes de alimentar a las larvas de peces GF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Índices de quistes y nauplios de GF Artemia incubados durante 24 h. (A) Quistes de Artemia sin tratar con película de impurezas (barra de escala: 500 μm). (B) Quistes de Artemia tratados con una superficie ligeramente convexa después de la absorción de agua y una apariencia más limpia (barra de escala: 500 μm). (C) Examen microscópico de nauplios vivos de Artemia GF incubados en fresco (barra de escala: 2000 μm) y (D) aumento con una barra de escala de 1000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detección estéril de peces GF en cada etapa de la vida y GF Artemia. (A) Pruebas estériles de muestras de peces CR y GF utilizando medio líquido TSB y BHI, TSA y placas de sangre en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. (B) Pruebas estériles de quistes de Artemia no tratados, quistes de Artemia GF y nauplios utilizando medio líquido TSB y BHI, TSA y placas de sangre en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Aislamiento e identificación de bacterias intestinales en pez cebra. (A) Cepas bacterianas, características de las colonias, mapas de secuenciación 16S (ejemplos: Aeromonas sp. y Vibrio sp.). (B) Géneros y accesiones NCBI. (C) Funciones metabólicas de bacterias aisladas del intestino del pez cebra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Infección y colonización de cepas de bacterias intestinales en el pez cebra GF. (A) Recuperación de cepas bacterianas aisladas e identificadas para experimentos de infección. (B) Marcaje de bacterias con colorantes fluorescentes e infección de larvas de pez cebra GF a 5 dpf. Aumento: 1x. (C) Observación de la distribución y colonización de bacterias (Vibrio sp.) en los tejidos intestinales in vivo. Aumento: 3x. (D) Recuento de UFC de bacterias (Aeromonas sp. y Vibrio sp.) en cada larva de pez por muestreo diario. Los datos presentan la media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Imprimaciones | Secuencias (5'-3') | Longitud del producto |
| 27F | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 1465 bp |
| 1492R | ACGGYTACCTTGTTACGACTT | |
| 63F | CAGGCCTAACACATGCAAGTC | 1324 bp |
| 1387R | GGGCGGWGTGTACAAGGC |
Tabla 1: Imprimaciones utilizadas para la detección de bacterias.
| Componentes | Unidades | Volumen (μL) |
| ADN polimerasa Taq | 2,5 U/μL | 0.1 |
| 10× tampón (mg2+) | --- | 2.1 |
| Mezcla dNTP | 2,5 mM | 1.6 |
| Imprimación 27F | 10 μM | 1 |
| Imprimación 1492R | 10 μM | 1 |
| Libre de ADN/ARN H2O | --- | 13.2 |
| Plantilla de ADN | --- | 1 |
| Volumen total | --- | 20 |
Tabla 2: Concentración final y volumen de componentes por reacción.
| Paso | Temperatura | Hora | Ciclos |
| Desnaturalización inicial | 95 °C | 4 minutos | -- |
| Desnaturalización | 94 °C | 1 minuto | 35 |
| Recocido | 55 °C | 1 minuto | |
| Extensión | 72 °C | 1 minuto | |
| Prórroga final | 72 °C | 10 minutos | -- |
| Sostener | 4 °C | ∞ | -- |
Tabla 3: Programa de PCR para la amplificación del gen 16S rRNA.
Figura complementaria 1: Los índices críticos de desarrollo de los modelos de pez cebra GF y CR. (A) La tasa de eclosión de los peces cebra CR y GF a 72 hpf, y (B) latidos cardíacos/10 s de los peces CR y GF a 7 dpf y 14 dpf. Las tasas de supervivencia (%) de los peces CR y GF disminuyeron de 7 días a 14 días con 86%, 60%-80% a 10%-25% a 30 dpf. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pasos críticos dentro de los protocolos de preparación de pescado y alimentos sin gluten
Durante la generación de los modelos de peces GF, se involucraron varios pasos críticos, incluida la preparación de materiales estériles, la esterilización de embriones, la renovación diaria de GZM, la recolección de varias muestras y el examen estéril de cada muestra utilizando múltiples métodos. Entre estos pasos, el tratamiento inicial de los embriones es fundamental y decisivo para el éxito de los modelos GF. El control de los agentes, sus concentraciones y los tiempos de tratamiento son cruciales para lograr tasas óptimas de esterilización y éxito en la eclosión. Es necesario prestar mucha atención cuando se manipulan embriones de peces GF a larvas, lo que implica cambios diarios de medios y garantiza que los materiales y las plataformas se esterilizen completamente con luz ultravioleta o en autoclave al retirar las placas de la incubadora. El monitoreo de las condiciones de temperatura y el tiempo de operación durante el invierno es esencial para prevenir la muerte de larvas causada por temperaturas más bajas en bancos limpios.
La yema de huevo estéril y la artemia GF deben someterse a una detección antes de ser alimentadas a los peces después de 7 dpf para garantizar su estado estéril para los modelos de GF a largo plazo. Durante el período de alimentación, la limpieza de los residuos de alimentos es importante como parte de las muestras recogidas para su detección al renovar el medio de desecho. El recipiente, el volumen de GZM y la masa de alimento deben ajustarse junto con las etapas de crecimiento y desarrollo para evitar la pérdida de peces GF debido a un entorno limitado y problemas de calidad del agua. El monitoreo regular y los ajustes en estos parámetros contribuyen al mantenimiento exitoso de los modelos de peces GF.
Modificaciones e importancia de estos protocolos
El proceso simplificado de tres pasos para generar embriones de pez cebra GF, que involucra agentes, concentraciones y tiempos de exposición optimizados de soluciones AB-GZM, PVP-I y NaClO, garantiza una alta tasa de esterilidad y un desarrollo saludable de los modelos. Además, los métodos de detección estéril para muestras diarias se han perfeccionado para incluir placas y cultivos de medios líquidos en condiciones aeróbicas y anaeróbicas, junto con técnicas moleculares que utilizan cebadores bacterianos comunes. Otras experiencias en las pruebas de contaminantes bacterianos y fúngicos tienen como objetivo optimizar los contaminantes aisladores y las pruebas estériles durante las técnicas de animales GF48.
En nuestro estudio se ha investigado el protocolo específico para los nauplios de GF Artemia como alimento vivo para modelos de peces, y la Administración Nacional de Propiedad Intelectual de China concedió una patente a PPJ y DSP (No. ZL202210482684.8). Los modelos de peces GF a largo plazo se ven consistentemente limitados por una nutrición inadecuada e inadecuada, lo que exacerba las debilidades en las funciones intestinales relacionadas con la digestión y la absorción. Como fuente de alimento creíble para modelos de medaka y pez cebra en diferentes etapas de la vida, GF Artemia sp. debe ser fácil de preparar con un procedimiento simple, un tiempo de incubación corto y una detección estéril en tiempo real para el uso diario. En este método, los quistes de Artemia normales se enjuagan en una concentración suficiente de NaClO para ser asépticos y luego se incuban en una botella recubierta con película, así como en una placa y en un medio líquido para su detección. Esto apoya los nauplios recién eclosionados para la alimentación de los peces GF. La tasa de esterilidad y la tasa de eclosión de Artemia, así como la longitud corporal, el peso y la actividad de la misma, son excelentes, lo que indica las aplicaciones disponibles en la práctica.
La importancia de estas modificaciones en los peces y los protocolos alimentarios de GF beneficia a los investigadores en la generación de modelos en embriones, larvas, etapas juveniles e incluso etapas adultas y adultas tempranas en especies marinas y de agua dulce. Los animales GF a largo plazo proporcionarán permiso como modelos in vivo en la investigación sobre la detección de fármacos y las funciones microbianas durante el crecimiento y desarrollo del huésped, especialmente en la madurez de la inmunidad y las líneas celulares intestinales relacionadas. Por ejemplo, las larvas de pez cebra solo poseen inmunidad innata en la primera semana, luego desarrollan el sistema de inmunidad adaptativo durante 7-21 dpf, junto con la madurez del timo31,49. Además, los modelos de peces GF pueden proporcionar la posibilidad de analizar las interacciones bacteria-bacteria y microbiota-huésped con la observación en vivo de los procesos dinámicos de colonización y migración en los organismos50,51.
Limitaciones del método
El cultivo de peces GF desde juveniles hasta adultos tempranos (28 dpf-2.5 mpf) y adultos sexualmente maduros (>2.5 mpf) sigue siendo un desafío debido al aumento de la mortalidad y el riesgo de contaminación bacteriana durante el mantenimiento del modelo. Estas limitaciones se derivan principalmente de la ausencia de sistemas de autocultivo adecuados para los peces que viven en un entorno de GF. Estos sistemas deben incluir aire limpio, agua y un sistema alimentario para mantener eficazmente a los animales y sus entornos, garantizando el aislamiento completo de los microorganismos externos. A diferencia de otros modelos animales GF, como ratones y pollos52, la obtención de pez cebra GF a través de operaciones anatómicas de los padres CR es un desafío debido a sus hábitos acuáticos y su estilo de fertilización natural.
Tratar a los animales adultos como si estuvieran completamente desprovistos de microbiota intestinal también es un desafío. Si bien el tratamiento con antibióticos puede inducir un estado similar al de los animales libres de patógenos específicos (SPF), caracterizado por una microbiota reducida detectada en muestras fecales, sigue siendo difícil lograr verdaderos modelos de peces adultos GF. Los desafíos que implica el establecimiento y mantenimiento de modelos de GF, especialmente durante la transición de los estados juveniles a los de largo plazo, son significativos. Se reconoce la importancia de la descendencia GF, como los huevos GF F1 o F2 de peces GF adultos, en la investigación microbiana. Sin embargo, superar los desafíos en el establecimiento y mantenimiento de modelos de peces GF adultos a largo plazo requiere mucho tiempo.
Vale la pena señalar que se ha desarrollado un pez cebra gnotobiótico con colonización bacteriana específica, que muestra una supervivencia crónica basada en modelos GF. Sin embargo, sigue siendo incierto si estos modelos pueden servir como alternativas viables a los modelos GF en la investigación biomédica y de infecciones bacterianas.
Futuras aplicaciones de los modelos de peces GF
En este estudio, hemos refinado el protocolo para generar modelos de pez cebra GF, progresando de embriones a juveniles. Este avance tiene aplicaciones significativas en la biología del desarrollo, la inmunología, la investigación de enfermedades humanas y la organogénesis. A través del aislamiento masivo y la identificación, el estudio explora las funciones, los mecanismos y los metabolitos derivados del intestino de cepas bacterianas individuales. La investigación consiste en infectar modelos de pez cebra GF después de que se abra el respiradero en la etapa47,53. Además, las bacterias marcadas con fluorescencia facilitan la observación de la colonización y distribución en larvas vivas de GF, libres de otras influencias microbianas54. Se pueden crear modelos similares de peces GF, como la medaka marina o de agua dulce, utilizando métodos comparables con varios agentes o cambios de medio.
Para investigar los mecanismos de las enfermedades humanas, el estudio emplea métodos de TMF, transfiriendo muestras de pacientes o donantes a animales sanos o modelos GF55. A diferencia de los animales criados convencionalmente (CR), los modelos GF ofrecen pruebas sólidas de las funciones, impactos o respuestas microbianas en el huésped, especialmente cuando se combinan con bacteriófagos para regular las bacterias objetivo en la microbiota46.
En resumen, el pez cebra GF sirve como modelos poderosos para evaluar la seguridad bacteriana, la efectividad de los medicamentos, la toxicidad de los contaminantes o la interferencia de compuestos, debido a su entorno intestinal sensible y puro. La exploración futura de las aplicaciones de los peces transgénicos debería abarcar varios campos, con la necesidad de crear modelos de peces adultos sin gluten para una comprensión más profunda de las funciones microbianas en las diferentes etapas de la vida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El protocolo de GF Artemia ha sido concedido como patente por la Administración Nacional de Propiedad Intelectual de China, lo que aliviará el uso restringido del método después de obtener el permiso de los autores. Los autores declaran que no tienen otros intereses contrapuestos o financieros.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente el apoyo del Proyecto de Talento de la Universidad Médica de Chongqing (No. R4014 para DSP y R4020 para PPJ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, No.32200386 para PPJ), el Estudio Mentor de Innovación Postdoctoral de Chongqing (X7928 DSP) y el Programa del Centro Conjunto China-Sri Lanka para la Investigación y Demostración de Tecnología del Agua de la Academia China de Ciencias (CAS) / Centro Conjunto China-Sri Lanka para la Educación y la Investigación de CAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. |
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
| 1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
| 2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
| 6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
| Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
| Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
| Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
| API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
| Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
| Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
| Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
| Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
| Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
| Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
| Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
| DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
| Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
| Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
| Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
| PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
| Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
| Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
| TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
| TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
| TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
| Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
| Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
References
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
- Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
- Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036 (2017).
- De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14 (2017).
- Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H.
- Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
- Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913 (2021).
- Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691 (2020).
- Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114 (2020).
- Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420 (2022).
- Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921 (2022).
- Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227 (2019).
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
- Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
- Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925 (2021).
- Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401 (2020).
- Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214 (2020).
- Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
- Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
- Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
- Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161 (2022).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
- Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373 (2015).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
- Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
- Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
- Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196 (2012).
- Wilson, C.
- Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C.
- Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984 (2017).
- Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844 (2023).
- Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
- Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458 (2021).
- Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
- Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
- Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
- Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
- Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109 (2023).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
- Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
- Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148 (2020).
- Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132 (2022).
- Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
- Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).
