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Artigo de método

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

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DOI:

10.3791/66613

⸱

24 de maio de 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Resumo

Várias técnicas para isolar a medula óssea de camundongos adultos foram bem estabelecidas. No entanto, isolar a medula óssea de camundongos neonatais é desafiador e demorado, mas para alguns modelos, é translacionalmente relevante e necessário. Este protocolo descreve um método eficiente e direto para preparar células da medula óssea de filhotes de 7 a 9 dias de idade. Essas células podem então ser isoladas ou diferenciadas em tipos específicos de células de interesse. Os macrófagos são células imunológicas cruciais que desempenham um papel importante na inflamação e infecção. Durante o desenvolvimento, os macrófagos neonatais contribuem significativamente para a remodelação tecidual. Além disso, o fenótipo e as funções dos macrófagos neonatais diferem daqueles de seus homólogos adultos. Este protocolo também descreve a diferenciação de macrófagos neonatais das células isoladas da medula óssea na presença de meio condicionado por L929. Marcadores de superfície para macrófagos neonatais diferenciados foram avaliados por meio de análise por citometria de fluxo. Para demonstrar a funcionalidade, a eficiência fagocítica também foi testada usando Escherichia coli conjugada com corante sensível ao pH.

Introdução

A medula óssea envolve populações de células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais que são auto-renováveis e podem ser diferenciadas em várias linhagens celulares. As células-tronco hematopoiéticas na medula óssea dão origem a linhagens mieloides e linfóides1. As células-tronco mesenquimais produzem osteoblastos (osso), adipócitos (gordura) ou condrócitos (cartilagem)2. Essas células têm múltiplas aplicações no campo da biologia celular e engenharia de tecidos, incluindo terapia gênica 3,4. As células progenitoras presentes na medula óssea se diferenciam em tipos celulares específicos na presença de fatores de crescimento específicos da linhagem. A eritropoietina promove a proliferação de células progenitoras eritroides, o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) estimula o crescimento de colônias de neutrófilos e a trombopoetina regula a produção de plaquetas como alguns exemplos de fatores de crescimento específicos da linhagem5. O FACS marcado com antígeno de superfície celular e a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) são métodos bem estabelecidos para isolamento e purificação dos tipos específicos de células derivadas da medula óssea6.

Embora os estudos neonatais estejam avançando para encontrar as causas das mortes neonatais e abordar as complicações durante os partos prematuros, o desenvolvimento terapêutico direto continua sendo uma necessidade médica não atendida. Smith e Davis afirmaram: "Os pacientes pediátricos permanecem órfãos terapêuticos"7. Existem vários desafios, como amostras pequenas, efeitos do resultado ao longo da vida e questões éticas na obtenção de consentimento em estudos clínicos de neonatos8. Portanto, há uma alta demanda por modelos de estudo in vivo e in vitro específicos para neonatos para alcançar relevância translacional. Devido às semelhanças entre os níveis anatômicos e teciduais, períodos gestacionais curtos e tamanhos de ninhada, os roedores são o sistema modelo de mamíferos mais estudado.

Aqui, descrevemos um procedimento detalhado, altamente viável e reprodutível para isolar a medula óssea de filhotes de camundongos de 7 a 9 dias de idade e sua capacidade de se diferenciar em macrófagos. No entanto, uma variedade de linhagens celulares pode ser alcançada com o uso de sinais de diferenciação distintos. Também demonstramos a presença de marcadores de superfície celular e a presença de atividade fagocítica in vitro esperada para macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs).

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Virgínia Ocidental e foram realizados seguindo as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa. Filhotes de camundongos C57BL/6J foram usados para este estudo. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia

  1. Prepare 3 mL de meio de cultura MEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 μg / mL) em um tubo de centrifugação de 5 mL e mantenha-o no gelo.
  2. Se necessário para armazenar progenitores da medula óssea em nitrogênio líquido, prepare meios de congelamento contendo 10% de DMEM, 80% de FBS e 10% de DMSO.
  3. Para DMEM completo, prepare DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 μg / mL).
  4. Para diferenciação de macrófagos, prepare DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de glutamina, penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 μg / mL) e 10% de sobrenadante de células L929 9,10,11.

2. Preparação do sobrenadante de células L929

  1. Descongele as células L929 armazenadas em nitrogênio líquido e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de DMEM completo. Centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente.
  2. Ressuspenda as células em 5 mL de meio DMEM completo e semeie-as em um frasco de cultura de tecidos T25 na densidade de 2×105 células. Conte as células com um contador de células automatizado usando 0,4% de azul de tripano. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 até atingir 70% de confluência.
  3. Para separar as células, primeiro lave-as com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Aspire o PBS e substitua-o por 2,5 mL de tripsina-EDTA a 0,05%.
  4. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 5 min e adicionar 5 ml de DMEM completo.
  5. Colete as células e centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente.
  6. Ressuspenda o pellet celular em 15 ml de meio DMEM completo e transfira-o para um balão T75.
  7. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 até que as células atinjam 90% de confluência e, em seguida, recolher o meio e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Filtrar o meio contendo M-CSF através de um filtro de 0,45 μm e congelar a -80 °C em alíquotas de 5 ml.

3. Preparação do animal

  1. Sob um gabinete de biossegurança, separe cuidadosamente os filhotes de camundongo C57BL / 6J de 7 a 9 dias (uma ninhada de 6 filhotes) da barragem e coloque-os em uma gaiola separada.
  2. Mergulhe uma bola de algodão em 2 mL de isoflurano de grau veterinário em uma campânula ou outra câmara de contenção.
  3. Coloque um filhote na câmara e feche a tampa. Monitore o recém-nascido por aproximadamente 90 s para garantir que ele fique imóvel e inconsciente.
  4. Remova rapidamente o filhote e decapite-o com uma tesoura afiada (seguindo os protocolos aprovados institucionalmente) antes que ele possa recuperar a consciência.
    NOTA: Os neonatos não respiram suficientemente fundo para a eutanásia apenas por inalação de isoflurano.
  5. Certifique-se de fechar a tampa do recipiente depois que cada filhote for removido. A mesma bola de algodão pode ser usada para 5-7 filhotes.

4. Isolamento da medula óssea neonatal

  1. Esterilize o corpo do neonato com etanol a 70%.
  2. "Usando fórceps e tesouras cirúrgicas de ponta fina, faça uma incisão entre os
    abdômen e patas traseiras. Remova a pele puxando em direção ao pé dos membros posteriores.
  3. Raspe o tecido conjuntivo e o músculo preso aos ossos usando uma pinça afiada.
  4. Corte a tíbia e o fêmur, conforme mostrado na Figura 1, com uma tesoura para destacá-la e removê-la. Usando uma pinça, coloque esses ossos no tubo de mídia no gelo. Repita o processo para cada filhote.
  5. Transfira os ossos com a ajuda de uma pinça para um filtro de 40 μm com um tubo de coleta. Esmague os ossos e libere a medula pressionando com um êmbolo de seringa de 3 mL contra o filtro.
  6. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g durante 5 min a 4 °C.
  7. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células pipetando suavemente em NaCl a 0,2%, uma solução hipotônica para a lise dos eritrócitos. Adicione imediatamente um volume igual de NaCl a 1,6% para tornar a solução isotônica.
  8. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C e retirar a solução de lise.
  9. Ressuspenda em DMEM completo para uso imediato ou meio de congelamento para armazenamento e conte as células usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado.
    NOTA: Para o presente estudo, este método rendeu 6,55 (± 1,44) × 106 células da medula óssea/filhote (Figura 1E).
  10. Conservar as células a -80 °C em meios de congelação ou utilizá-las imediatamente conforme descrito abaixo.
    NOTA: Por causa da idade, os ossos são transparentes e claros o suficiente para visualizar a medula através deles. É importante ter cuidado ao puxar os ossos, pois a aplicação de uma leve pressão sobre eles pode ser suficiente para liberar a medula. A medula nos ossos neonatais está na forma de líquido, em vez de um fio intacto encontrado nos ossos adultos. É difícil coletar a medula se ela escapar durante a coleta dos ossos.

5. Diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea neonatal

  1. Semear 2 × 107 células da medula óssea por frasco T75 em 10 mL de DMEM completo que contém 10% de sobrenadante de células L929 (2,5 mL) como fonte de M-CSF. Incubar as placas de cultura a 37 °C com 5% de CO2 durante 5 dias. Adicione 2 mL de meio condicionado a L929 no dia 3 de diferenciação.
  2. Observe as células ao microscópio diariamente usando um microscópio invertido e um sistema de imagem com ampliação de 20x. Após a diferenciação, os macrófagos devem parecer aderentes, alongados e heterogêneos (Figura 2).
  3. Para colher os macrófagos para ensaios a jusante, aspirar os meios de diferenciação.
  4. Lave as células com 5 mL de PBS para remover as células não aderentes e as proteínas séricas que irão interferir no descolamento. Aspire o PBS.
  5. Colha as células adicionando 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% ao frasco. Colocar o balão de cultura a 37 °C com a incubadora de CO2 a 5% durante 5 min e adicionar 5 ml de DMEM.
  6. Pipete as células para se destacarem e centrifugue a 350 x g por 5 min em temperatura ambiente.
  7. Dissocie o pellet celular em 1 mL de DMEM completo e conte e verifique a viabilidade celular usando azul de tripano. Os BMDMs isolados usando este método são 7,05 (± 2,52) ×105 células/filhote (Figura 1E).
    NOTA: Observe a presença de células fusiformes que começam a aparecer no segundo dia de diferenciação (Figura 1B, setas vermelhas). Se a cor da mídia ficar amarela, indicando que está gasta, adicione mais mídia condicionada por L929 no dia 4 de diferenciação; A substituição completa da mídia não é recomendada.

6. Imunomarcação e análise por citometria de fluxo

  1. Bloqueie a marcação de anticorpos não específicos dos BMDMs (2x105/marcador) tratando com 10 μL/107 células de reagente bloqueador de FcR de acordo com as recomendações do fabricante em um volume de 100 μL/tampão de citometria de fluxo de marcação (PBS suplementado com 2 mM de EDTA e 0,5% de albumina de soro bovino). Mantenha no gelo por 10 min.
    NOTA: As células podem ser bloqueadas em massa ou em poços ou tubos individuais. Todas as etapas subsequentes indicam quantidades e volumes por marcador celular individual em um volume final de 100 μL.
  2. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de citometria de fluxo e centrifugue a 525 x g por 7 min à temperatura ambiente.
  3. Remover o sobrenadante e semear as células numa placa de 96 poços com fundo em U a uma densidade de 5 × 105 células por alvéolo. Corar células adicionando corante FVS780-Vivo / Morto diluído a 3.000 vezes e 0,625 μL de BV786-CD11b, PE-F4 / 80 e AlexaFluor488-CD206 em 100 μL de tampão de citometria de fluxo individualmente ou em combinação 12,13,14,15. Incube as células por 45 min em gelo coberto com papel alumínio.
  4. Adicione 100 μL de tampão de citometria de fluxo e lave as células centrifugando a 525 x g por 7 min à temperatura ambiente.
  5. Aspirar o sobrenadante e vorticar suavemente o sedimento celular. Adicione 100 μL de paraformaldeído a 0,4% em cada poço e incube durante a noite a 4 °C.
  6. Lave as células adicionando 100 μL de tampão de citometria de fluxo e pellet por centrifugação a 525 x g por 7 min à temperatura ambiente.
  7. Ressuspenda as células em 400 μL de tampão de citometria de fluxo e analise usando um citômetro de fluxo.

7. Ensaio in vitro para avaliar a eficácia fagocítica de macrófagos derivados da medula óssea neonatal

  1. Ressuspender os BMDMs em DMEM completo sem vermelho de fenol ou antibióticos e semeá-los a uma densidade de 2 × 105 / quadrante em uma placa quádrupla de 35 mm a um volume de 500 μL.
  2. Para preparar o inóculo bacteriano a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 25 ou outro MOI desejado, remova um estoque pré-calculado de Escherichia coli O1:K1:H7 armazenado a -80 °C.
  3. Aliquota o volume desejado de bactérias em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Lave as bactérias adicionando PBS a um volume total de 1 mL. Pelotizar as bactérias por centrifugação a 2.000 x g por 5 min em temperatura ambiente. Repita a etapa de lavagem.
  4. Ressuspenda o pellet bacteriano em 50 μL de PBS e adicione corante verde fluorescente sensível ao pH até uma concentração final de 500 μM. Este é um corante sensível ao pH sem sinal fluorescente em pH neutro e fluoresce intensamente em ambientes ácidos, como fagossomos acidificados, durante o processo de fagocitose.
  5. Incube as células bacterianas por 20 min no escuro para conjugação do corante.
  6. Lave as bactérias quatro vezes com 1 mL de PBS por centrifugação a 1000 × g por 5 min em temperatura ambiente.
  7. Ressuspenda as bactérias em 500 μL de DMEM completo sem vermelho de fenol e adicione às culturas de BMDM.
  8. Incubar os BMDMs a 37 °C em incubadora de CO2 a 5% por 4 h e, em seguida, adicionar 200 ng de um corante fluorescente vermelho permeável às células que cora os lisossomos.
    NOTA: As bactérias fagocíticas podem ser visualizadas por microscopia fluorescente.

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Resultados

Usando o método descrito neste estudo, 25 a 37 milhões de células da medula óssea podem ser isoladas com sucesso de uma ninhada de cinco filhotes de camundongos C57BL / 6. Este método foi validado com tamanhos de ninhada que variam de 5 a 7 filhotes. A idade mínima para isolamento em nossos experimentos foi de 7 dias. Dependendo do tamanho da ninhada e do número de células necessárias para o experimento ser inferior a um milhão, os pesquisadores podem tentar esse protocolo para camundongos com menos de 7 dias de idade. N...

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Discussão

Pesquisas envolvendo modelos de camundongos neonatais podem apresentar uma série de desafios. Os neonatos têm um sistema imunológico em desenvolvimento que é único em comparação com os adultos8. Como tal, os dados gerados a partir de modelos animais adultos não devem ser considerados aplicáveis a recém-nascidos, e vários trabalhos publicados articularam bem essa ideia18,19. Portanto, modelos específicos para neonatais e fontes de células s...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse relevantes para este artigo.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health [R01 AI163333] para CMR. Reconhecemos o apoio financeiro adicional fornecido à Instalação de Citometria de Fluxo e Núcleo de Célula Única da West Virginia University pelas seguintes doações: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 e NIH grant OD016165.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
40 µ filtro mGreiner542040Cultura de células
96 poços redondos (U) placa inferiorThermo Scientific12-565-65Cultura de células
Anti-mouse CD11b-BV786BD Biosciences740861Análise FACS
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709Análise FACS
Anti-mouse F4/80-PEBD Biosciences565410Análise FACS
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCContador de células automatizado
DMEMHycloneSH30022.01Cultura de células
DMSOVWRWN182Cultura de células
DPBS, 1xCorning21-031-CVCultura de células
Escherichia coli O1:K1:H7Infecção por ATCC11775
EVOS FL Sistema de Imagem CelularInvitrogen12-563-649
FBSAvantor 76419-584Cultura de células
FluoroBright BMDMThermo fisher ScientificA1896701Meios de cultura sem corantes
GlutaminaCytivaSH30034.01Cultura de células
HEPESCytivaSH30237.01Cultura de células
L-929ATCCDiferenciação
LSRFortessaBecton DickinsonCitômetro
de Fluxo Lysotracker vermelho DND 99InvitrogenL7528Corante fluorescente
MEMCorning15-010-CVCultura de células
Penicilina /estreptomicina HycloneSV30010Cultura de células
pHrodo verde STP éster InvitrogenP35369Corante fluorescente
T75 frascoCell star658170Cultura de células
Tripsina-EDTAGibco25300120Cultura de células
Zeiss 710 ZeissP20GM103434Confocal

Referências

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