عزل نخاع عظم الفأر الوليدي وإعداد الضامة المشتقة من نخاع العظم
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة غير إنزيمية ومباشرة لعزل خلايا نخاع عظم الفأر الوليدي البالغة من العمر 7-9 أيام وتوليد بلاعم متباينة باستخدام طاف من خلايا L929 كمصدر لعامل تحفيز مستعمرة المحببات (M-CSF). تم تحليل الضامة المشتقة من نخاع العظم بشكل أكبر للمستضدات السطحية F4 / 80 و CD206 و CD11b والكفاءة الوظيفية.
Abstract
تم تأسيس تقنيات مختلفة لعزل نخاع العظم عن الفئران البالغة. ومع ذلك ، فإن عزل نخاع العظم عن الفئران الوليدية يمثل تحديا ويستغرق وقتا طويلا ، ولكن بالنسبة لبعض النماذج ، فهو مناسب وضروري من الناحية الانتقالية. يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة ومباشرة لإعداد خلايا نخاع العظم من الجراء البالغة من العمر 7-9 أيام. يمكن بعد ذلك عزل هذه الخلايا أو تمايزها إلى أنواع معينة من الخلايا ذات الأهمية. البلاعم هي خلايا مناعية حاسمة تلعب دورا رئيسيا في الالتهاب والعدوى. أثناء التطور ، تساهم البلاعم الوليدية بشكل كبير في إعادة تشكيل الأنسجة. علاوة على ذلك ، يختلف النمط الظاهري ووظائف الضامة الوليدية عن نظيراتها البالغة. يحدد هذا البروتوكول أيضا تمايز البلاعم الوليدية عن خلايا نخاع العظم المعزولة في وجود وسط مكيف L929. تم تقييم الواسمات السطحية للبلاعم الوليدية المتمايزة باستخدام تحليل التدفق الخلوي. لإثبات الوظيفة ، تم اختبار كفاءة البلعمة أيضا باستخدام الإشريكية القولونية المقترنة الحساسة للصبغة ذات الأس الهيدروجيني.
Introduction
يحيط نخاع العظم بمجموعات الخلايا الجذعية المكونة للدم واللحمة المتوسطة التي تكون ذاتية التجدد ويمكن تمييزها إلى سلالات خلايا مختلفة. تؤدي الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظم إلى ظهور سلالات نخاعية ولمفاوية1. تنتج الخلايا الجذعية الوسيطة بانيات العظم (العظام) أو الخلايا الشحمية (الدهون) أو الخلايا الغضروفية (الغضروف)2. هذه الخلايا لها تطبيقات متعددة في مجال بيولوجيا الخلية وهندسة الأنسجة ، بما في ذلك العلاج الجيني 3,4. تتمايز الخلايا السلفية الموجودة في نخاع العظم إلى أنواع معينة من الخلايا في وجود عوامل نمو خاصة بالنسب. يعزز الإريثروبويتين تكاثر الخلايا السلفية للكريات الحمر ، ويحفز عامل تحفيز مستعمرة المحببات (G-CSF) نمو مستعمرات العدلات ، وينظم الثرومبوبويتين إنتاج الصفائح الدموية كأمثلة قليلة على عوامل النمو الخاصة بالنسب5. مستضد سطح الخلية المسمى FACS وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) هي طرق راسخة لعزل وتنقية أنواع الخلايا المشتقة من نخاع العظم6.
على الرغم من أن دراسات حديثي الولادة تتقدم نحو إيجاد أسباب وفيات الأطفال حديثي الولادة ومعالجة المضاعفات أثناء الولادات المبكرة ، إلا أن التطوير العلاجي المباشر لا يزال حاجة طبية غير ملباة. صرح سميث وديفيس ، “يظل مرضى الأطفال أيتاما علاجيين”7. هناك العديد من التحديات ، مثل العينات الصغيرة ، والآثار مدى الحياة للنتيجة ، والقضايا الأخلاقية في الحصول على الموافقة في الدراسات السريرية لحديثي الولادة8. وبالتالي ، هناك طلب كبير على نماذج الدراسة في الجسم الحي وفي المختبر الخاصة بحديثي الولادة لتحقيق أهمية متعدية. بسبب أوجه التشابه بين المستويات التشريحية والأنسجة ، وفترات الحمل القصيرة ، وأحجام القمامة ، فإن القوارض هي أكثر أنظمة نماذج الثدييات التي تمت دراستها.
هنا ، نصف إجراء مفصلا وممكنا للغاية وقابلا للتكرار لعزل نخاع العظم من جراء الفئران البالغة من العمر 7-9 أيام وقدرتها على التمايز إلى البلاعم. ومع ذلك ، يمكن تحقيق مجموعة متنوعة من سلالات الخلايا باستخدام إشارات تمايز متميزة. نظهر أيضا وجود علامات سطح الخلية ووجود نشاط البلعمة في المختبر المتوقع للبلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs).
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تمثل الأبحاث التي تتضمن نماذج الفئران الوليدية عددا من التحديات. يتمتع حديثو الولادة بجهاز مناعي متطور فريد من نوعه مقارنة بالبالغين8. على هذا النحو ، لا ينبغي افتراض أن البيانات الناتجة عن نماذج البالغة تنطبق على الأطفال حديثي الولادة ، وقد أوضحت العديد من الأعمال ال…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [R01 AI163333] إلى CMR. نحن نقر بدعم التمويل الإضافي المقدم إلى مرفق قياس التدفق الخلوي بجامعة ويست فرجينيا ومرفق نواة الخلية الواحدة من خلال المنح التالية: منحة WV CTSI GM104942 ، ومنحة CoBRE للبيئة الدقيقة للورم GM121322 ومنحة المعاهد الوطنية للصحة OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
Referências
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
- Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
- Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
- Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), lsa.202000957 (2021).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecida de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. 196, e64566 (2023).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
- Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
- Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
- Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
- Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
- Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages. Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
- de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).
.