Isolement de moelle osseuse de souris néonatale et préparation de macrophages dérivés de la moelle osseuse
Summary
Ce protocole décrit une méthode non enzymatique et simple pour isoler des cellules de moelle osseuse de souris néonatales âgées de 7 à 9 jours et générer des macrophages différenciés en utilisant un surnageant de cellules L929 comme source de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (M-CSF). Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été analysés plus en détail pour les antigènes de surface F4/80, CD206, CD11b et la compétence fonctionnelle.
Abstract
Diverses techniques permettant d’isoler la moelle osseuse de souris adultes ont été bien établies. Cependant, l’isolement de la moelle osseuse de souris néonatales est difficile et prend du temps, mais pour certains modèles, cela est pertinent et nécessaire sur le plan translationnel. Ce protocole décrit une méthode efficace et simple pour préparer les cellules de moelle osseuse de chiots âgés de 7 à 9 jours. Ces cellules peuvent ensuite être isolées ou différenciées en types de cellules d’intérêt spécifiques. Les macrophages sont des cellules immunitaires cruciales qui jouent un rôle majeur dans l’inflammation et l’infection. Au cours du développement, les macrophages néonatals contribuent de manière significative au remodelage des tissus. De plus, le phénotype et les fonctions des macrophages néonatals diffèrent de ceux de leurs homologues adultes. Ce protocole décrit également la différenciation des macrophages néonatals à partir des cellules isolées de la moelle osseuse en présence d’un milieu conditionné par L929. Les marqueurs de surface des macrophages néonatals différenciés ont été évalués à l’aide d’une analyse cytométrique en flux. Pour démontrer la fonctionnalité, l’efficacité phagocytaire a également été testée à l’aide d’Escherichia coli conjugué à un colorant sensible au pH.
Introduction
La moelle osseuse renferme des populations de cellules souches hématopoïétiques et mésenchymateuses qui sont auto-renouvelables et peuvent être différenciées en diverses lignées cellulaires. Les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse donnent naissance aux lignées myéloïdes et lymphoïdes1. Les cellules souches mésenchymateuses produisent des ostéoblastes (os), des adipocytes (graisse) ou des chondrocytes (cartilage)2. Ces cellules ont de multiples applications dans le domaine de la biologie cellulaire et de l’ingénierie tissulaire, y compris la thérapie génique 3,4. Les cellules progénitrices présentes dans la moelle osseuse se différencient en types de cellules spécifiques en présence de facteurs de croissance spécifiques à la lignée. L’érythropoïétine favorise la prolifération des cellules progénitrices érythroïdes, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF) stimule la croissance des colonies de neutrophiles et la thrombopoïétine régule la production de plaquettes comme quelques exemples de facteurs de croissance spécifiques à la lignée5. L’antigène de surface cellulaire marqué FACS et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) sont des méthodes bien établies pour l’isolement et la purification des types cellulaires spécifiques dérivés de la moelle osseuse6.
Bien que les études néonatales progressent vers la découverte des causes des décès néonatals et la résolution des complications lors des naissances prématurées, le développement thérapeutique direct reste un besoin médical non satisfait. Smith et Davis ont déclaré que « les patients pédiatriques restent des orphelins thérapeutiques »7. Il y a plusieurs défis, tels que la petite taille des échantillons, les effets à vie du résultat et les questions éthiques liées à l’obtention du consentement dans les études cliniques sur les nouveau-nés8. Par conséquent, il existe une forte demande de modèles d’étude in vivo et in vitro spécifiques aux nouveau-nés pour atteindre une pertinence translationnelle. En raison des similitudes entre les niveaux anatomiques et tissulaires, des courtes périodes de gestation et de la taille des portées, les rongeurs sont le système modèle de mammifère le plus étudié.
Ici, nous décrivons une procédure détaillée, hautement réalisable et reproductible pour isoler la moelle osseuse de petits souris âgés de 7 à 9 jours et leur capacité à se différencier en macrophages. Cependant, une variété de lignées cellulaires pourrait être obtenue en utilisant des signaux de différenciation distincts. Nous démontrons également la présence de marqueurs de surface cellulaire et la présence d’une activité phagocytaire in vitro attendue pour les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM).
Protocol
Representative Results
Discussion
La recherche sur des modèles de souris néonatales peut présenter un certain nombre de défis. Les nouveau-nés ont un système immunitaire en développement qui est unique par rapport aux adultes8. En tant que telles, les données générées à partir de modèles animaux adultes ne doivent pas être supposées s’appliquer aux nouveau-nés, et plusieurs travaux publiés ont bien articulé cette idée18,19. Par conséquent, des modèle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [R01 AI163333] à CMR. Nous tenons à souligner le soutien financier supplémentaire apporté à la plateforme de cytométrie en flux et de cellule unique de l’Université de Virginie-Occidentale par les subventions suivantes : GM104942 de subvention CTSI de WV, GM121322 de subvention CoBRE de microenvironnement tumoral et OD016165 de subvention NIH.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
Referências
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
- Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
- Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
- Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), lsa.202000957 (2021).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecida de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. 196, e64566 (2023).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
- Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
- Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
- Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
- Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
- Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages. Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
- de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).
.