新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製
Summary
このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。
Abstract
成体マウスから骨髄を分離するためのさまざまな技術が確立されています。しかし、新生児マウスから骨髄を分離することは困難で時間がかかりますが、一部のモデルでは、翻訳的に関連性があり、必要です。このプロトコルは、7〜9日齢の子犬から骨髄細胞を調製するための効率的で簡単な方法を説明しています。その後、これらの細胞をさらに単離したり、目的の特定の細胞タイプに分化させたりすることができます。マクロファージは、炎症や感染に大きな役割を果たす重要な免疫細胞です。発生中、新生児マクロファージは組織のリモデリングに大きく寄与します。さらに、新生児マクロファージの表現型と機能は、成人のマクロファージの表現型と機能とは異なります。このプロトコルはまた、L929馴化培地の存在下での単離された骨髄細胞からの新生児マクロファージの分化を概説しています。分化した新生児マクロファージの表面マーカーをフローサイトメトリー解析を用いて評価した。機能性を実証するために、pH感受性色素標識大 腸菌を用いて食作用効率も試験しました。
Introduction
骨髄は、自家再生可能でさまざまな細胞系譜に分化できる造血幹細胞集団と間葉系幹細胞集団の両方を囲んでいます。骨髄の造血幹細胞は、骨髄系およびリンパ系1を生じさせます。間葉系幹細胞は、骨芽細胞(骨)、脂肪細胞(脂肪)、または軟骨細胞(軟骨)を産生します2。これらの細胞は、遺伝子治療3,4を含む細胞生物学および組織工学の分野で複数の用途があります。骨髄に存在する前駆細胞は、系統特異的な成長因子の存在下で特定の細胞型に分化します。エリスロポエチンは赤血球前駆細胞の増殖を促進し、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は好中球コロニーの成長を刺激し、トロンボポエチンは血小板の産生を調節するなど、系統特異的な成長因子のいくつかの例として挙げられます5。細胞表面抗原標識FACSおよび磁気活性化セルソーティング(MACS)は、特定の骨髄由来細胞タイプの単離および精製のための確立された方法です6。
新生児研究は、新生児の死亡原因の解明や早産時の合併症への対処に向けて進んでいますが、直接的な治療法の開発は依然としてアンメットメディカルニーズです。スミスとデイビスは、「小児患者は依然として治療的孤児である」と述べています7。新生児の臨床試験で同意を得るには、サンプルが少ないこと、結果の生涯にわたる影響、倫理的問題など、いくつかの課題があります8。したがって、翻訳関連性を達成するために、新生児に特化した in vivo および in vitro 研究モデルに対する高い需要があります。解剖学的レベルと組織レベル、妊娠期間の短さ、および同腹児数の間に類似性があるため、げっ歯類は最も研究されている哺乳類のモデルシステムです。
ここでは、7-9日齢のマウスの子犬から骨髄を分離するための詳細で、非常に実現可能で、再現性のある手順と、マクロファージに分化する能力について説明します。しかし、異なる分化シグナルを用いることで、さまざまな細胞系譜を達成することができます。また、細胞表面マーカーの存在と、骨髄由来マクロファージ(BMDM)に期待される in vitro 食作用の存在も示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
新生児マウスモデルを用いた研究には、多くの課題があります。新生児は、大人に比べてユニークな発達中の免疫システムを持っています8。そのため、成体動物モデルから生成されたデータは新生児に適用されると想定すべきではなく、いくつかの公開された研究はこの考えをよく明確にしています18,19。したがって、新生児特?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所 [R01 AI163333] から CMR の支援を受けました。ウェストバージニア大学フローサイトメトリーおよびシングルセルコアファシリティに対して、WV CTSI助成金GM104942、腫瘍微小環境CoBRE助成金GM121322、NIH助成金OD016165の助成金により、追加の資金援助が提供されていることを認めます。
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
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