Helcells-Inspelningar av Ljus Evoked excitatoriska Synaptic strömmar i näthinnan Slice
Summary
Denna video visar processen helcells-inspelningar spänning klämma i retinal bit av vattenlevande tiger salamandern. Vi visar förberedelserna för den del, liksom hur man utför inspelningar patch clamp under visuell stimulering av näthinnan.
Abstract
Vi använder helcells-tekniken patch clamp att studera de synaptiska kretsar som ligger bakom visuell information bearbetning i näthinnan. I den här videon kommer vi att guida dig genom processen att utföra helcells-inspelningar av ljuset framkallade strömmar av enskilda celler i näthinnan skiva beredning. Vi använder vattenlevande tiger salamandern som en djurmodell. Vi börjar med att beskriva dissekering av ögat och visa hur skivor är monterade för elektrofysiologiska inspelningar. När skiva är placerad i inspelningen kammare, visar vi hur du utför helcells-inspelningar spänning klämma. Vi projicerar då visuella stimuli på fotoreceptorer i segmentet att framkalla ljus framkallat Dagens svar. Under inspelningen vi BEGJUTA segmentet med farmakologiska medel, där en 8-kanals perfusion systemet tillåter oss att snabbt växla mellan olika aktörer. Näthinnans skiva preparatet används ofta för inspelningar patch clamp i näthinnan, i synnerhet för att studera amakrina eller bipolär celler, som inte är tillgängliga i hela montera beredning.
Protocol
Discussion
Fördelar:
- Alla celltyper är tillgängliga
- Enkel identifiering av celltyper, särskilt om en fluorescerande färg läggs till elektroden lösningen
- Farmakologiska agenter kan lätt nå målceller
- Plåstret clamp tekniken tillåter att undersöka betydelsen av olika jonkanaler i retina beräkningar. Samma information kan inte erhållas genom extracellulära spik inspelningar eller inspelningar med skarpa elektroder.
- Denna teknik kan tillämpas på andra djurmodelle…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Multiclamp 700A | Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| SZX9 | Dissection Micropscope | Olympus | ||
| BX50WI | Upright Microscope | Olympus | Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instruments | ||
| Lucivid | Microscope image injector | Mbf bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | Microperfusion | Parker Hannfin corporation | ||
| Bits++ | Digital Video Processor | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | Other | ITT | ||
| Adhesive silicone wells | Other | Molecular Probes | 20mm diameter, 1.0mm deep | |
| Membrane Filters | Filter | Milipore | HAWPO1300 | .45µm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | Electrode glass | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | Filter | Whatman | 6789-0402 | 4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing |
| IR camera | Micropscope mounted camera | Sony | SPT-M324 | Extrawave HAD, B7W video camera |
| Picrotoxin | Reagent | Sigma | P1675 | |
| Strychnine | Reagent | Sigma | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | Reagent | Sigma | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | Animal | Charles E. Sullivan (Nashville, TN) |
References
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
