Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.
Abstract
We gebruiken de whole-cell patch clamp techniek om de synaptische circuits die ten grondslag ligt visuele informatieverwerking in het netvlies te bestuderen. In deze video, zullen wij begeleiden u door het proces van het uitvoeren van whole-cell-opnamen van het licht opgeroepen stromingen van de individuele cellen in het netvlies slice voorbereiding. We gebruiken de in het water levende tijger salamander als een diermodel. We beginnen met een beschrijving van de dissectie van het oog en laten zien hoe schijfjes zijn gemonteerd voor elektrofysiologische opnames. Zodra het schijfje is geplaatst in de opname kamer, we laten zien hoe je whole-cell voltage clamp opnames uit te voeren. Vervolgens hebben we het project visuele prikkels op de fotoreceptoren in de slice aan het licht opgewekte stroom reacties uitlokken. Tijdens de opname hebben we perfuseren het segment met farmacologische stoffen, waarbij een 8-kanaals perfusie-systeem stelt ons in staat om snel te schakelen tussen verschillende agenten. Het netvlies slice voorbereiding wordt veel gebruikt voor patch clamp opnames in het netvlies, met name om amacrine of bipolaire cellen, die niet toegankelijk zijn in een geheel-mount voorbereiding van studie.
Protocol
Oplossingen Intracellulaire oplossing voor het ganglion cellen (in mm): 100 K-gluconaat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 uM sulforhodamine B (voor de kleuring), aangepast aan pH = 7,4 met KOH Intracellulaire oplossing voor bipolaire cellen (in mm): 90 K-gluconaat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 uM sulforhodamine B (voor de kleuring), aangepast aan pH = 7,4 met KOH Extracellulaire Ringer-oplossing (in mm): 112 NaCl, 5 Gluc…
Discussion
Voordelen:
Alle celtypen zijn toegankelijk
Eenvoudige identificatie van celtypen, met name wanneer een fluorescerende kleurstof wordt toegevoegd aan de elektrode oplossing
De patch clamp techniek maakt het mogelijk om de rol van verschillende ionenkanalen te onderzoeken in het netvlies berekeningen. Dezelfde informatie kan niet worden verkregen via extracellulaire spike-opnamen of opnamen met scherpe elektroden. <…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Multiclamp 700A
Patch Clamp Amplifier
Molecular Devices
SZX9
Dissection Micropscope
Olympus
BX50WI
Upright Microscope
Olympus
Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).