Questo video mostra il processo di registrazione di tensione a cellula intera pinza nella fetta della retina della tigre salamandra acquatica. Dimostriamo la preparazione della fetta e come effettuare registrazioni di patch clamp durante la stimolazione visiva della retina.
Abstract
Usiamo la cellula intera tecnica di patch clamp per lo studio dei circuiti sinaptici che sottende l'elaborazione delle informazioni visive nella retina. In questo video, vi guiderà attraverso il processo di esecuzione a cellula intera registrazioni di luce correnti evocato delle singole cellule nella preparazione fetta della retina. Usiamo il acquatici tigre salamandra come un modello animale. Cominciamo con la descrizione della dissezione degli occhi e mostrare come le fette sono montati per le registrazioni elettrofisiologiche. Una volta che la fetta si trova nella camera di registrazione, dimostriamo come eseguire a cellula intera registrazioni clamp di tensione. Abbiamo poi progetto stimoli visivi sul fotorecettori nella fetta di suscitare luce evocata attuali risposte. Durante la registrazione abbiamo profumato la fetta con agenti farmacologici, per cui un sistema a 8 canali perfusione ci permette di passare velocemente tra diversi agenti. La preparazione fetta della retina è ampiamente usato per le registrazioni di patch clamp nella retina, in particolare per studiare amacrine e cellule bipolari, che non sono accessibili in un tutto-mount preparazione.
Protocol
Soluzioni Soluzione intracellulare di cellule gangliari (in mm): 100 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM solforodamina B (per la colorazione), portato a pH = 7,4 con KOH Soluzione intracellulare di cellule bipolari (in mm): 90 K-gluconato, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 Bapta, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0,5, 90 mM solforodamina B (per la colorazione), portato a pH = 7,4 con KOH Ringer extracellulare della soluzione (in mm): 112 NaCl, 5 Glucosio, 5 HEP…
Discussion
Vantaggi:
Tutti i tipi di cellule sono accessibili
Facile identificazione dei tipi di cellule, in particolare se un colorante fluorescente viene aggiunto alla soluzione elettrodo
Agenti farmacologici possono facilmente raggiungere le cellule bersaglio
La tecnica di patch clamp consente di indagare il ruolo dei canali ionici diversi nei calcoli della retina. Le stesse informazioni non possono essere ottenute attraverso le registrazioni extracellulare picco o registrazioni con elett…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Multiclamp 700A
Patch Clamp Amplifier
Molecular Devices
SZX9
Dissection Micropscope
Olympus
BX50WI
Upright Microscope
Olympus
Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp
Werner, B., Cook, P. B., Passaglia, C. L. Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice. J. Vis. Exp. (17), e771, doi:10.3791/771 (2008).