双整装原位杂交技术在早期鸡胚

Summary

本视频演示了原位杂交的方法，其中2个不同的基因的时空表达模式可以在年轻的鸡胚显示2色整装。这种方法最初是由大卫威尔金森，多明戈斯恩里克，菲尔英厄姆和大卫ISH – Horowicz。

Abstract

鸡胚是一个有价值的工具，在早期胚胎发育的研究。其透明度，可获得性和易于操纵，使其用于研究基因表达在脑，神经管，体节和心脏原基形成的理想工具。本视频演示了不同的步骤，在2色整装原位杂交;首先，胚胎从卵解剖和多聚甲醛固定。二，预杂交胚胎处理。具有两种不同的探针，再加上挖一个，并再加以FITC标记的杂交胚胎。杂交过夜后，胚胎培养与辛加上抗体。辛基板颜色反应的进行，和感兴趣的区域显示为蓝色。胚胎，然后加上与FITC标记抗体孵育。胚胎处理颜色用FITC反应，和感兴趣的区域显示为红色。最后，胚胎是固定的，为phtograph处理和切片。还介绍了故障排除指南。

Protocol

第1部分：固定的胚胎填充与冰冷的DEPC – PBS清扫菜。置于冰上。打开用镊子轻敲壳蛋和删除壳件。 用镊子取出厚厚的白蛋白。卵黄囊倾斜粗钳，使胚胎朝上。 用剪刀，切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。 使用勺子，取出胚胎从卵黄和冰冷的DEPC – PBS。 在显微镜下，删除膜和蛋黄，并转移到固定菜。 牵制，除去DEPC – PBS。 DEPC – PBS在4％煤灰更换和修复…

Discussion

2色整装原位杂交方法是用来确定空间和时间的基因表达模式，使用一个或两个基因的兴趣。应用领域包括新基因的基因表达模式的^评估 （如1,2，以及以下侮辱基因^表达的变化（3 ^胚胎操作 ，珠4，RNA ^或DNA电构造5）。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Eggs	Animal	Charles River	Premium Fertile
Stereomicroscope	Microscope	Leica Microsystems	MZ9.5
Marsh Automatic Incubator	Tool	Lyon	RX
Hybridization Incubator	Tool	Hybaid	Micro-4
Adams Nutator orbital mixer	Tool	Fisher	14-062
Curved Forceps (1)	Tool	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Fine scissors	Tool	Fine Science Tools	14161-10
Spoon	Tool	Fine Science Tools	10370-18
Pasteur Capillary Pipette		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Microcapillary tube		Sigma	P1049-1PAK	Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife		Fine Science Tools	10056-12	Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam		Fine Science Tools	26002-20	Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base	Reagent	Dow Corning	0001986475	Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)	Reagent	Acros Organics	10025025	Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA	Reagent	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Reagent	Sigma	P1379-100ML
Proteinase K		Sigma	P2308-5MG	Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized	Reagent	Ambion	9342
Yeast tRNA-25 mg	Reagent	Invitrogen	15401-011	Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt	Reagent	Sigma	H4784-250MG	Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5	Reagent	Fisher	PR-V4261
EDTA (0.5M)	PR-V4231	Fisher
SDS	Reagent	Fisher	BP166-100
Maleic acid	Reagent	Fluka	63189
Boehringer Blocking Reagent	Reagent	Roche Applied Sciences	11096176001	Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum	Reagent	Jackson Immuno	013-000-121	Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Reagent	Roche Applied Sciences	11093274910
NBT/BCIP stock solution	Reagent	Roche Applied Sciences	11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments	Reagent	Roche Applied Sciences	11426338910
2M Tris	BP1759-500	Fisher
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit	Reagent	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene	Reagent	Sigma	429325-100ML	Under hood