이 비디오는 현장 하이브리드화, 2 개의 다른 유전자의 공간과 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 배아에서 시각 될 수있는 방법 2 색 전체 마운트를 보여줍니다. 이 방법은 원래 데이비드 윌킨슨, 도밍고스 헨리크, 필 잉엄 데이비드 이쉬 – Horowicz에 의해 도입되었다.
Abstract
여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브, 체절과 심장 primordia 형성에 유전자 발현을 연구를위한 이상적인 도구가합니다. 이 비디오는 현장 하이브리드화 2 색 전체 마운트에있는 다른 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 배아는 prehybridization에 대한 처리됩니다. 배아는 다음 두 가지 프로브, 팔 결합 하나와 FITC에 결합하여 하나 hybridized입니다. 하룻밤 하이브리드화 다음, 배 (胚)가 발굴 결합 항체와 incubated입니다. 발굴 기판에 대한 컬러 반응이 수행하고, 관심 지역은 파란색으로 나타납니다. 배아는 다음 FITC 항체와 결합 incubated입니다. 배아는 FITC와 색상 반응을 처리하고, 관심 지역은 빨간색으로 나타납니다. 마지막으로, 배아는 고정 및 처리 phtograph과 sectioning입니다. 문제 해결 가이드도 제공됩니다.
Protocol
1 부 : 배아를 고정 얼음 추위 depc – PBS로 해부 접시를 채우십시오. 얼음 계속. 포셉로 껍질을 감청하여 계란을 열고 조개 조각을 제거합니다. 포셉과 알부민 두꺼운 제거합니다. 그 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉과 난황을 기울이기. 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락 사용, 얼음 추위 depc – PBS에 노른자와 장소에서 배아를 제?…
Discussion
현장 하이브리드화 방식의 2 색 전체 마운트는 관심 중 하나 또는 두 개의 유전자를 사용하여 유전자 발현의 공간 및 시간적 패턴 모두를 결정하는 데 사용됩니다. 응용 프로그램은 새로운 유전자의 유전자 발현 패턴의 평가 (예 : 1,2,뿐만 아니라 유전자 발현 다음과 모욕의 변화 (배아 조작 3, 구슬 4 및 RNA 또는 DNA의 electroporation 5 구성)을 포함합니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Animal
Charles River
Premium Fertile
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5
Marsh Automatic Incubator
Tool
Lyon
RX
Hybridization Incubator
Tool
Hybaid
Micro-4
Adams Nutator orbital mixer
Tool
Fisher
14-062
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Spoon
Tool
Fine Science Tools
10370-18
Pasteur Capillary Pipette
Electron Microscopy Sciences
70950-12
Microcapillary tube
Sigma
P1049-1PAK
Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife
Fine Science Tools
10056-12
Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam
Fine Science Tools
26002-20
Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc)
Reagent
Acros Organics
10025025
Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
Tween-20
Reagent
Sigma
P1379-100ML
Proteinase K
Sigma
P2308-5MG
Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized
Reagent
Ambion
9342
Yeast tRNA-25 mg
Reagent
Invitrogen
15401-011
Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt
Reagent
Sigma
H4784-250MG
Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5
Reagent
Fisher
PR-V4261
EDTA (0.5M)
PR-V4231
Fisher
SDS
Reagent
Fisher
BP166-100
Maleic acid
Reagent
Fluka
63189
Boehringer Blocking Reagent
Reagent
Roche Applied Sciences
11096176001
Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum
Reagent
Jackson Immuno
013-000-121
Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.