Bearbetning av insektsben för fluorescensmikroskopi: En metod för att bevara neuromuskulära strukturer för avbildning

- Till att börja med, dränk bedövade insekter i 70% etanollösning för att minska nagelbandets hydrofobi.

Ta sedan bort huvudet och buken från bröstkorgen. Använd tång för att applicera försiktigt tryck på coxa-thorax-korsningen och lossa benet.

Ta sedan bort fixeringslösningen och tvätta vävnaden flera gånger med fosfatbuffrad saltlösning som innehåller tvättmedel.

Slutligen montera benen i en droppe monteringsmedium. Använd en distans mellan mikroskoprutschbanan och täckglaset för att förhindra att provet skadas och säkra fästet med nagellack.

I följande exempel kommer vi att se dissekering, fixering och montering av Drosophila melanogaster ben.

- Börja med att fylla lämpligt antal brunnar i en multiwellplatta i glas med 70% etanol. Använd en borste för att tillsätta 15 till 20 koldioxidbedövade flugor i alla åldrar eller kön till varje brunn och doppa försiktigt flugorna i etanolen tills de är helt nedsänkta.

Efter högst en minut- skölj flugorna tre gånger med 0,3% nonionic tensid tvättmedel lösning i fosfat-buffrad saltlösning i minst 10 minuter per tvätt. Efter den sista tvätten, använd tång för att ta bort huvudet och buken på varje fluga utan att skada bröstsegmentet eller benen, och använd spetsen på ett par fina tång för att försiktigt men bestämt applicera tryck på coxa-thorax-korsningen för att lossa ett ben från bröstsegmentet.

Placera benen i en brunn på en ny multiwellplatta, som innehåller nylagad 4% paraformaldehyd på is, för en inkubation över natten vid 4 grader Celsius.

- Det är viktigt att trycka benen försiktigt in i fixeringsbufferten utan att låta dem flyta för att få välfixerade ben.

- Tvätta benen fem gånger nästa dag i färsk 0,3% nonionic tensid tvättmedel lösning i 20 minuter per tvätt. Efter den sista tvätten, byt ut tvättmedlet mot monteringsmedium och håll benen i monteringsmediet i minst 24 timmar.

Nästa dag, tillsätt cirka 20 mikroliter 70% glycerol bredvid den belagda änden av glasmikroskopet glida och täck glycerolen med en 22 med 22 millimeters täckglas. Nästa, lägg i ca 10-mikroliterlinje av monteringsmedium till höger om täckglaset och applicera en andra 30-mikroskoplinje av monteringsmedium till höger om 10-mikroliterlinjen.

Använd fina tångar, överför ett ben från multiwellplattan i en droppe medium till 10-mikroliterremsan av monteringsmediet i en yttre sida upp eller ner orientering. Upprepa tills sex till åtta ben har monterats och justerats och placera ett andra locklip över benen så att det andra täcket vilar något på det första täcket.