Encyclopedia of Experiments: Biology
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- खारे समाधान में निश्चित अंडाशय से परिपक्व ओसाइट्स के साथ शुरू करें। परिपक्व ओसाइट्स एक बाहरी कोरियन और आंतरिक विटेललाइन झिल्ली से मिलकर अंडे के गोले सहन करते हैं।
कोरियोन और विटेललाइन झिल्ली को यांत्रिक रूप से हटाने के लिए, दो पूर्व-उपचारित स्लाइडों के पाले से ओसाइट्स के बीच ओसाइट्स रखें। oocytes को रोल करने वाले घर्षण बनाने के लिए सीधे पीछे-पीछे की गति में शीर्ष स्लाइड को स्थानांतरित करें।
अब, एक मामूली कोण पर शीर्ष स्लाइड ले जाएं ताकि ओसाइट्स को दूसरी दिशा में रोल किया जा सके। परिपत्र गति से बचें, इस कोण को कम वेतन वृद्धि में बढ़ाएं जब तक कि शीर्ष स्लाइड नीचे की स्लाइड तक लंबवत न हो जाए। यह आंदोलन यांत्रिक रूप से कोरियोन और विटेललाइन झिल्ली को हटा देता है, जिससे ओसाइट में जांच या दाग-धब्बे तक पहुंच होती है।
कोरियोन्स के बिना Oocytes लंबे और पतले दिखाई देगा, और विटेललाइन झिल्ली के बिना उन बिंदुओं की ओर इशारा किया जाएगा । आसपास के मलबे से मंजूरी दे दी oocytes अलग करने के लिए, एक ट्यूब के लिए नमूना मिश्रण हस्तांतरण, और oocytes नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति है, जबकि मलबे शीर्ष पर तैरता है और हटाया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल में, हम परिपक्व ड्रोसोफिला ओसाइट्स से कोरियोन और विटेललाइन झिल्ली को हटा देंगे।
- देर से चरण oocytes को अलग करने के लिए, सबसे पहले, एक उथले विच्छेदन पकवान में PBSBTx के 1 मिलीलीटर जोड़ें। फिर, एक BSA-लेपित टिप के साथ एक P200 का उपयोग करें ताकि स्थिर अंडाशय को उथले पकवान में स्थानांतरित किया जा सके। कम परिपक्व ऊसाइट से परिपक्व ऊसाइट को उखाड़ फेंकने के लिए अंडाशय को ऊपर और नीचे।
जब देर से चरण oocytes पर्याप्त रूप से अलग हो रहे हैं, एक ५००-माइक्रोलिटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए सभी ऊतकों को स्थानांतरित । एक खींचा पाश्चुर पिपेट के साथ अतिरिक्त तरल निकालें, ट्यूब में लगभग १५० से २०० माइक्रोलीटर छोड़ ।
ओसाइट रोलिंग की तैयारी के लिए, PBSBTx के 200 माइक्रोलीटर के साथ एक गहरी अच्छी डिश को प्री-वेट करें। डिश को कवर करें और इसे अलग रख दें।
तीन पाले से ओढ़लिया ग्लास स्लाइड प्राप्त करें और स्लाइड तीन को अलग करें। इसके बाद, स्लाइड एक और दो के पाले से ओढ़े हुए ग्लास क्षेत्रों को धीरे-धीरे रगड़ें। किसी भी ग्लास शार्ड्स को हटाने और डिस्पोजेबल पोंछ के साथ सूखने के लिए उन्हें डियोनाइज्ड पानी में कुल्ला करें। PBSBTx के 50 माइक्रोलीटर जोड़कर पीबीएसबीटीएक्स के साथ स्लाइडएंचों के पाले से फ्रॉस्टेड क्षेत्रों को कोट करें और दूसरी स्लाइड के साथ इस क्षेत्र को रगड़ें। डिस्पोजेबल पोंछे के साथ तरल को हटाएं और स्लाइड के पाले वाले क्षेत्रों को स्लाइड के साथ रखें और दो स्लाइड के साथ संपर्क में दो स्लाइड स्लाइड के साथ संपर्क में ।
ओसाइट्स को रोल करने के लिए सबसे पहले पीबीएसबीटीएक्स में पी200 पिपेट टिप को प्री-वेट करें और माइक्रोफ्यूज ट्यूब में ओसाइट्स को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फैलाएं। oocytes युक्त तरल के 50 माइक्रोलीटर को स्लाइड एक के पाले से ओढ़लिया ग्लास भाग के केंद्र में स्थानांतरित करें। ऐसा करने के लिए स्लाइड दो को उठाएं।
धीरे-धीरे दो स्लाइड कम करें जब तक कि तरल की सतह तनाव दो पाले से ओढ़ लिया ग्लास क्षेत्रों के बीच एक सील बनाता है। पाले से ओढ़े हुए क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त तरल होना चाहिए, लेकिन किसी को भी बाहर नहीं निकलना चाहिए। फिर, एक हाथ से एक जगह में नीचे की स्लाइड को पकड़ें और दूसरे हाथ का उपयोग एक क्षैतिज दिशा में दो आगे और पीछे शीर्ष स्लाइड को स्थानांतरित करने के लिए करें, स्लाइड दो स्तर को ध्यान में रखते हुए और स्लाइड तीन पर समर्थित।
ओसाइट आंदोलनों और प्रगति के आसान दृश्य के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे प्रदर्शन करें। क्षैतिज दिशा में कुछ आंदोलनों के बाद, आंदोलन के कोण को थोड़ा बदल दें। कई वेतन वृद्धि में, धीरे-धीरे इस कोण को 90 डिग्री तक बढ़ाएं जब तक कि शीर्ष स्लाइड दो का आंदोलन प्रारंभिक दिशा तक लंबवत न हो जाए। ध्यान दें कि खाली कोरशन तरल में दिखाई देगा, और ऊसाइट्स कमी के तार लंबे और पतले दिखाई देंगे।
- ओसाइट्स को रोल करते समय, सुनिश्चित करें कि रोलिंग की दिशा हमेशा एक सीधी रेखा में होती है और कभी भी गोलाकार गति नहीं होती है।
- जब तक समाधान थोड़ा बादल न हो जाए तब तक रोलिंग को लगभग 7 से 10 बार दोहराएं। जब अधिकांश ओसाइट्स अपनी विटेलाइन झिल्ली खो देते हैं तो रोलिंग बंद कर दें।
धीरे-धीरे शीर्ष स्लाइड दो उठाएं, अपने कोनों में से एक को नीचे की स्लाइड में पाले से ओढ़े हुए क्षेत्र के केंद्र में खींच लें ताकि लुढ़का हुआ ओसाइट्स पाले से ओसाइट्स पाले से ओसाइट्स को पाले से ओसाइट्स को पीबीएसबीटीएक्स युक्त गहरे-अच्छी तरह से पकवान में सोखें।
साफ स्लाइड एक और दो अल्ट्रापुरे पानी के साथ। डिस्पोजेबल वाइप और रीसेट के साथ सूखी। इन चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि एक ही जीनोटाइप के सभी ओसाइट्स को रोल नहीं किया गया हो । इसके लिए आमतौर पर प्रति जीनोटाइप रोलिंग के तीन से चार राउंड की आवश्यकता होती है ।
रोलिंग के बाद मलबे को हटाने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 1 मिलीलीटर PBSBTx जोड़ें । ट्यूब के किनारों को कोट करने के लिए तरल को चक्कर लगाता है। PBSBTx-लेपित P1000 पिपेट टिप का उपयोग करके, डीप-वेल डिश से लुढ़का हुआ ओसाइट्स को 1 मिलीलीटर PBSBTx में शंकु नली में स्थानांतरित करें। oocytes युक्त शंकु ट्यूब में PBSBTx के अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें।
एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ शंकु नली पकड़ो अपारदर्शी oocytes देखने के रूप में वे सिंक । oocytes नीचे करने के लिए व्यवस्थित देने के बाद, मलबे और त्यागने युक्त समाधान के शीर्ष 2 मिलीलीटर को हटाने के लिए एक P1000 का उपयोग करें ।
मलबे को हटाने के कुल तीन दौर के लिए कदम दोहराने के बाद, एक PBSBTx-लेपित P1000 पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए मूल ५०० माइक्रोलिटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब को वापस oocytes हस्तांतरण । 20 से 25 महिलाओं को लुढ़का परिपक्व oocytes के लगभग ५० माइक्रोलीटर उपज चाहिए ।
