Medindo a eficiência fagocítica de macrófagos com primaquina e terapia fotodinâmica

Comece com uma placa de vários poços contendo macrófagos murinos aderidos - ou células imunes fagocíticas.

Introduzir uma suspensão de células fúngicas de Cryptococcus, interagindo com receptores de macrófagos e internalizando via fagocitose.

O fagossomo se funde com o lisossomo, formando um fagolisossomo. O ambiente ácido do fagolisossomo favorece a sobrevivência e multiplicação dos fungos.

Introduza uma alta concentração de primaquina - um fotossensibilizador, nos poços de teste, enquanto o controle não possui o fotossensibilizador. Incubar para facilitar a absorção de primaquina pelos macrófagos.

Exponha a placa à luz ultravioleta para tratamento fotodinâmico ou PDT.

No poço de teste, a primaquina forma cátions radicais que interagem com o oxigênio molecular, produzindo espécies reativas de oxigênio, ou ROS.

As EROs induzem a morte fúngica, enquanto as enzimas antioxidantes dos macrófagos neutralizam as EROs, prevenindo danos celulares.

Permeabilize os macrófagos, liberando células fúngicas.

Espalhe o conteúdo celular diluído em placas de ágar seletivas, produzindo colônias fúngicas distintas.

Menos colônias na placa de teste em comparação com o controle indicam a eficiência fagocítica aprimorada dos macrófagos devido ao tratamento fotodinâmico com primaquina.

Comece com uma suspensão de uma linha celular de macrófagos murinos em meio RPMI 1640 completo, conforme mencionado no protocolo de texto. Dispense 100 microlitros desta suspensão celular nos poços de uma placa de cultura estéril de fundo plano de 96 poços. Incube a placa durante a noite em uma incubadora.

No dia seguinte, retire a placa da incubadora. Substitua o meio gasto por 100 microlitros de meio RPMI-1640 novo. Em seguida, dispense 100 microlitros de suspensão de células criptocócicas na placa de cultura contendo macrófagos semeados.

Para estudar o efeito fotodinâmico, prepare as concentrações de trabalho desejadas do fotossensibilizador. Adicione 100 microlitros de solução de trabalho à placa pré-semeada com macrófagos e células criptocócicas.

Incube a placa no escuro para que as células reajam com a droga. Após a incubação, exponha as placas à luz ultravioleta por dois minutos.

Após iniciar o tratamento fotodinâmico, incubar as placas de cultura durante 18 horas. Após a incubação, remova o sobrenadante e lave as células com 200 microlitros de solução tampão fosfato.

Adicione 300 microlitros de Triton X-100 a 0,1% aos poços e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.

Aspire o conteúdo de cada poço e distribua-o em tubos de plástico estéreis individuais de 1,5 mililitro. Dilua as células 10 vezes com água destilada e pipete 50 microlitros da diluição em placas individuais de ágar de extrato de levedura-malte.

Use um método de placa espalhada para criar um gramado confluente de células na superfície da placa de ágar. Incube as placas por 48 horas. Conte as unidades formadoras de colônias nas placas de ágar.