Déterminer l'activité phagocytaire des échantillons d'anticorps cliniques

L’objectif de l’expérience suivante est de déterminer l’activité phagocytaire des anticorps spécifiques de l’antigène dans des échantillons cliniques à haut débit. Ceci est réalisé en enrobant d’abord les billes fluorescentes avec un antigène de choix pour permettre la capture de la fraction spécifique de l’antigène de l’anticorps présente dans des échantillons d’anticorps cliniques complexes. Dans un second temps, les cellules phagocytaires de TP sont incubées avec les billes fluorescentes ionisées, qui phagocytent ensuite les billes en fonction du nombre et des caractéristiques du domaine FC des anticorps liés.

Ensuite, l’intensité de fluorescence des cellules THP one est déterminée par cytométrie en flux sur plaque à haut débit afin de quantifier l’activité phagocytaire des anticorps présents dans l’échantillon. En fin de compte, la capacité des anticorps spécifiques de l’antigène dans l’échantillon à induire une phagocytose basée sur l’absorption différentielle des billes fluorescentes opsonisantes due soit à un titre d’anticorps variable, soit à une reconnaissance variable par les récepteurs d’anticorps exprimés sur les cellules phagocytaires, peut être évaluée. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que celles utilisant des cellules phagocytaires primaires est que le débit est augmenté et que la standardisation est améliorée.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’immunologie de base de la réponse immunitaire adaptative, par exemple si différents schémas vaccinaux ont induit des anticorps ayant des activités différentes. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies infectieuses, car les anticorps contribuent de manière majeure à la mise en place d’une réponse immunitaire protectrice efficace. Bien que nous ayons utilisé cette méthode pour mieux comprendre l’activité des anticorps dans l’infection progressive par le VIH et la vaccination, elle peut également être appliquée à d’autres états pathologiques tels que la grippe, l’auto-immunité et la dengue, où les anticorps anti-frago peuvent exacerber la maladie D plutôt que de fournir une protection.

Commencez par diluer l’antigène dans un tampon qui ne contient pas d’amines primaires. Dissoudre ensuite le sulfamide NHS lc, réactif de biotine dans l’eau. Ensuite, ajoutez immédiatement le réactif hydraté à l’antigène et laissez la réaction se poursuivre pendant une heure à température ambiante pendant le mélange.

De temps en temps, lorsque la réaction est terminée, ajoutez l’échantillon dans la chambre supérieure d’une unité de concentration centrifuge pour éliminer tout excès de biotine non conjuguée par échange de tampon. Ajoutez maintenant du PBS pour porter le volume total à la ligne de remplissage de 15 millilitres. Enfin, centrifugez l’échantillon à 4 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que le volume soit ramené à environ 1,5 millilitre.

Répétez cette étape trois fois pour obtenir une élimination quasi quantitative de la biotine libre. Après avoir fait tourner 100 microlitres de billes d’eut tradin fluorescentes d’un micron dans une micro-centrifugeuse à 13 000 fois G pendant cinq minutes, remettre en suspension et laver les billes dans un millilitre de 0,1 % P-B-S-B-S-A en suivant la même procédure de centrifugation. Ensuite, après Resus, en suspendant les billes lavées dans 100 microlitres de P-B-S-B-S-A, à nouveau eloqua les billes dans 10 tubes micro fued.

Ensuite, combinez 10 microlitres de suspension de billes lavées avec des concentrations variables d’antigène biotinylé dans des étapes de pliage. Ensuite, incubez les suspensions de billes et d’antigènes pendant une nuit à quatre degrés Celsius dans un microtube de centrifugation sur un rotateur. Le lendemain.

Éliminez tout antigène non lié en lavant les suspensions deux fois avec un millilitre de P-B-S-B-S-A et centrifugez les échantillons à grande vitesse comme auparavant jusqu’à ce que les billes soient granulées. Enfin, Reese suspend les billes enrobées d’antigène dans un volume final d’un millilitre de P-B-S-B-S-A après avoir purifié les échantillons d’anticorps cliniques du plasma à l’aide d’un kit de purification IgG en gel de melon. Selon les instructions du fabricant, déterminer la concentration des anticorps purifiés par absorbance à deux 80.

Ensuite, diluez les anticorps à un milligramme par millilitre dans du PBS, en réservant des échantillons pour les anticorps de contrôle monoclonaux positifs et négatifs. Ensuite, réanimez, suspendez la solution de billes saturée d’antigène par vortex, puis transférez 10 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque à fond rond de 96 puits, assurez-vous d’agiter continuellement la suspension de billes pour vous assurer qu’un nombre égal de billes fluorescentes sont ajoutées à chacun des puits. Créez une courbe dose-réponse pour chaque anticorps témoin en ajoutant à chacun des concentrations variables d’anticorps d’intérêt dans des volumes ne dépassant pas 20 microlitres.

Maintenant, incubez les échantillons de billes et d’anticorps pendant deux heures à 37 degrés Celsius pour permettre aux anticorps de se lier aux billes juste avant que les billes ne soient terminées. Incubation diluer un échantillon de THP à 2,5 fois 10 à cinq cellules par millilitre dans le milieu. Ajoutez ensuite 200 microlitres de cellules à chacune.

Enfin, incubez les cellules avec les billes enrobées d’anticorps pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur fixe, permettant aux cellules et aux billes de se déposer par gravité. Le lendemain, retirez 100 microlitres de supinate de chaque puits en faisant attention de ne pas déranger la pastille cellulaire. Fixez les cellules dans 100 de para formaldéhyde à 4 %, puis pipetez pour remettre en suspension et mélanger les cellules.

Chargez maintenant la plaque sur le lecteur de plaques HTS d’un cytomètre en flux à haut débit, permettant une collecte automatisée des données. L’intensité de fluorescence de la cellule HTHP est capturée et enregistrée. Cette intensité de fluorescence est ensuite utilisée pour déterminer le nombre de billes phagocytaires par chaque cellule, ce qui définit l’activité phagocytaire de l’échantillon d’anticorps testé.

Il doit y avoir une différenciation claire entre les échantillons d’anticorps et ceux des sujets non affectés. Dans cette figure. L’histogramme des faits d’un échantillon d’anticorps provenant d’un sujet séronégatif représenté par la trace noire et d’un sujet séropositif représenté par la trace grise, démontre l’augmentation de la phagocytose due à la présence d’anticorps spécifiques de l’antigène.

La sensibilité optimale de ce test dépend de la saturation des billes avec l’antigène biotinylé, comme on le voit ici. On a déterminé que la concentration saturante de cet antigène était de deux microgrammes par microlitre de billes. Cette courbe dose-réponse démontre la capacité différentielle des échantillons d’anticorps du sujet à induire une phagocytose sur une plage de concentration d’anticorps de 0,05 à cinq microgrammes par millilitre.

Cette phagocytose différentielle peut être due à des différences de titre ou de propriétés du domaine FC telles que la sous-classe des IgG ou l’état de glycosylation. Lorsque les cellules TP one sont imagées par microscopie fluorescente, il y a des signes clairs de phagocytose des billes. Cette image fixe de cellules TP 1 après incubation avec des billes d’opsonisation d’anticorps en vert et des billes inisées non opsonisées en rouge démontre l’absence d’absorption phagocytaire en l’absence d’anticorps, car seules les billes vertes ont été cyto par les cellules TP 1.

Lorsque la microscopie time-lapse est effectuée, l’absorption phagocytaire spécifique des anticorps par les billes fluorescentes est encore plus frappante. Les billes fluorescentes vertes que l’on voit ici sont ionisées par anticorps. Les billes fluorescentes rouges fournissent le contrôle négatif Après cette procédure, d’autres tests de la fonction des anticorps peuvent être effectués afin de répondre à des questions supplémentaires sur les caractéristiques de la réponse des anticorps à l’infection ou à la vaccination.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer l’activité phagocytaire d’échantillons d’anticorps à l’aide de la cytométrie en flux à débit oculaire. N’oubliez pas que travailler avec des échantillons de sang et de plasma cliniques peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une protection individuelle appropriée et le respect de procédures de manipulation sûres doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.