L'isolamento dei leucociti di Human Interface materno-fetale

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i leucociti dalla decidua, dal baus e dalla decidua paral umana. Ciò si ottiene sezionando prima i tessuti di dee umano dalla placenta. Successivamente, il tessuto deciduale viene dissociato mediante disaggregazione meccanica e digestione enzimatica.

Quindi la sospensione cellulare viene filtrata utilizzando un colino cellulare da 100 micrometri lavato con un XPBS e fuge a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ottenere un pellet cellulare. Infine, la sospensione cellulare viene caricata sopra la soluzione di gradiente di densità e centrifugata e viene raccolta l'interfaccia contenente i leucociti. In definitiva, i leucociti isolati possono essere utilizzati per l'immunofenotipizzazione di colture cellulari e studi funzionali.

Il vantaggio cerebrale di questa tecnica o di metodi esistenti, come la dissociazione meccanica o la digestione enzimatica, è che combina la desegregazione meccanica dei tessuti con un associatore automatico di tessuti e la digestione tematica con Accutane e l'isolamento dei leucociti utilizzando un gradiente fecale. È stato dimostrato che questo protocollo preserva gli antigeni della superficie cellulare nella vitalità cellulare e le sue implicazioni si estendono verso la comprensione delle proprietà funzionali e fenotipiche dei leucociti infiltranti all'interfaccia fetale materna correlata alla patogenesi delle complicanze prenatali. La raccolta e l'utilizzo di campioni umani per scopi di ricerca sono stati approvati dai comitati di revisione istituzionali dell'Eunice Kennedy Shriver, dell'Istituto nazionale per la salute del bambino e lo sviluppo umano, degli Istituti nazionali di salute, del dipartimento della salute e dei servizi umani e della Wayne State University.

Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutte le donne in gravidanza prima della raccolta dei campioni di tessuto. Yay. Per cominciare, i deci basilis sezionano un pezzo della placca basale da una co-piombo della placenta. Posizionalo su un tagliere sterile con il vli placentare, che sarà rosso sangue con un aspetto peloso rivolto verso l'alto.

La placca basale è liscia e di colore rosso pallido, mantenendo il tessuto imbevuto di una XPBS utilizza forbici e pinze affilate e a punta fine per rimuovere il tessuto villoso e i vasi sanguigni. Raccogli due o tre pezzi e usa il PBS per sciacquarli accuratamente per rimuovere il sangue. Per isolare il deci paral, sezionare il pezzo quadrato di 10 centimetri per 10 centimetri.

Mettilo sulla tavola con il corion, che contiene coaguli di sangue e di solito è di colore giallo chiaro rivolto verso l'alto. Quindi, usa una pinza a punta fine per rimuovere il maggior numero possibile di coaguli di sangue. Quindi con uno sterile XPBS, sciacquare la membrana fino a quando il PBS non diventa chiaro.

Utilizzando un raschietto cellulare sterile usa e getta e mentre si posiziona il PBS sulla membrana, raschiare delicatamente lo strato deciduale. Raccogliere i tessuti deci e metterli in una provetta di plastica da 50 millilitri con PBS sterile per disaggregare meccanicamente il decidua Bali o il deci paral. Inizia usando un XPBS sterile per lavare il fazzoletto in una provetta da 50 millilitri.

Quindi centrifugare il fazzoletto a 300 G e temperatura ambiente per cinque minuti. Aspirare con cura il bocchettone senza disturbare il pellet. Quindi, dopo aver sospeso il tessuto e la soluzione di distacco secondo il protocollo di testo, trasferire i tessuti omogeneizzati in una provetta a C.

Posizionare la provetta nel dissociatore automatico ed eseguire il programma corrispondente dopo la dissociazione in una soluzione di distacco cellulare disponibile in commercio, come Accutane ai tessuti, incubare a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione per 45 minuti per digerirla. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di PBS alla miscela di digestione e passarla attraverso un colino cellulare da 100 micrometri in una provetta da 50 millilitri. A seconda della viscosità, potrebbero essere necessari diversi filtri per filtrare una digestione.

Utilizzare PBS per riempire la provetta e centrifugare a 300 G e temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere con cautela il surnatante S e utilizzare cinque millilitri di tampone fax ghiacciato per risospendere il pellet della cella. Per studiare i leucociti mononucleati, aggiungere cinque millilitri di terreno di gradiente di densità al 20% a un tubo di plastica da 15 millilitri.

Quindi sovrapporre lentamente la sospensione cellulare sulla parte superiore, facendo attenzione a non permettere agli strati di mescolarsi con una centrifuga a rotore oscillante a 500 G a quattro gradi Celsius e senza interruzioni per 30 minuti, i leucociti si troveranno nell'interfaccia tra il mezzo del gradiente di densità e il buffer fax. Quindi, pipettare con cura lo strato superiore che contiene il buffer fax e i detriti delle celle. L'interfaccia contiene le cellule mononucleate residue e una porzione dei leucociti polimorfonucleati.

Trasferire questo strato in un nuovo tubo da 15 millilitri. Aggiungere almeno tre volumi di tampone fax alla provetta, quindi centrifugare a 300 G per cinque minuti. Per la palatura delle cellule, aspirare il surnatante S e lavare le cellule con tampone fax una seconda volta prima di eseguire la coltura cellulare.

Smistamento e immunofenotipizzazione secondo il protocollo testuale, questa figura mostra una morfologia di macrofagi isolati raccolti dai paria decidua in una gravidanza a termine utilizzando il smistamento cellulare magnetico. I macrofagi isolati mantengono la capacità di rilasciare citochine dopo tre giorni di coltura. La resa delle cellule vitali isolate dal paral decidua, baus e decidua è stata determinata seguendo la separazione del gradiente di densità.

Utilizzando una vitalità fissabile come mostrato qui, era maggiore del 90% per ogni popolazione di deci cellule. Qui viene mostrata la strategia di gating per analizzare i leucociti polimorfonucleati e mononucleati all'interno del gating visibile, tra cui cellule T, neutrofili, macrofagi, cellule NK, cellule T NK e cellule B. A termine della gravidanza, questa figura mostra neutrofili, macrofagi, cellule T e cellule B da cellule residue isolate da una gravidanza a termine.

Infine, in questo set di grafici sono rappresentati i linfociti NKT NK e T provenienti da cellule residue isolate da una gravidanza a termine. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di pulire bene il tessuto, di evitare la contaminazione del sangue e di mantenere il tessuto e il cocktail di enzimi sugli occhi durante la procedura.