Name: O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a usar o implante DREAM para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre. Este sistema modular e econômico permite registrar atividade neuronal durante tarefas de realidade virtual.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Holandês de Pesquisa (NWO; Crossover Program 17619 "INTENSE", TS) e recebeu financiamento do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) ao abrigo do acordo de subvenção n.º 600925 (Neuroseeker, TS, FB, PT), bem como da Sociedade Max Planck.

Um sistema de implante de sonda versátil e econômico para eletrofisiologia em camundongos

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<li>Okun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+coupling+of+neurons+to+populations+in+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diverse coupling of neurons to populations in sensory cortex.</a> Nature. 521 (7553), 511-515 (2015).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).</li>
<li>Znamenskiy, P., Kim, M. -H., Muir, D. R., Iacaruso, M. F., Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+recurrent+inhibition+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of recurrent inhibition in visual cortex.</a> Neuron. 112 (6), 991-1000 (2024).</li>
<li>Rowland, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+activity+through+the+cortical+hierarchy+and+perception+are+determined+by+neural+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of activity through the cortical hierarchy and perception are determined by neural variability.</a> Nat Neurosci. 26 (9), 1584-1594 (2023).</li>
<li>Roth, M. M., Dahmen, J. C., Muir, D. R., Imhof, F., Martini, F. J., Hofer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+nuclei+convey+diverse+contextual+information+to+layer+1+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamic nuclei convey diverse contextual information to layer 1 of visual cortex.</a> Nat Neurosci. 19 (2), 299-307 (2016).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed%2C+cortex-wide+volumetric+recording+of+neuroactivity+at+cellular+resolution+using+light+beads+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed, cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy.</a> Nat Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents+EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).</li>
<li>Savya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+spatiotemporal+dynamics+of+astrocyte+reactivity+following+neural+electrode+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo spatiotemporal dynamics of astrocyte reactivity following neural electrode implantation.</a> Biomaterials. 289, 121784(2022).</li>
<li>Perge, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-day+signal+instabilities+affect+decoding+performance+in+an+intracortical+neural+interface+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system.</a> J Neural Eng. 10 (3), 036004(2013).</li>
<li>Pachitariu, M., Steinmetz, N., Kadir, S., Carandini, M., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilosort%3A+realtime+spike-sorting+for+extracellular+electrophysiology+with+hundreds+of+channels%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Kilosort: realtime spike-sorting for extracellular electrophysiology with hundreds of channels.</a> bioRxiv. , 061481(2016).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).</li>
<li>Kloosterman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+Drive+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication.</a> J Vis Exp. (26), e1094(2009).</li>
<li>Jacobs, T., Darch, H., Holtzman, T., De Zeeuw, C. I., Romano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+operating+protocol%3A+Implantation+of+Cambrige+NeuroTech+chronic+silicon+probe+and+mini-amp-64+digital+headstage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Standard operating protocol: Implantation of Cambrige NeuroTech chronic silicon probe and mini-amp-64 digital headstage in mice.</a> Protocol Exchange. , (2023).</li>
<li>Juavinett, A. L., Bekheet, G., Churchland, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable%2C+reusable%2C+and+light+implant+for+chronic+Neuropixels+probes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tissue+responses+to+neural+implants+impact+signal+sensitivity+and+intervention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies.</a> ACS Chem Neurosci. 6 (1), 48-67 (2015).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. (26), e1098(2009).</li>
<li>Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+loss+accompanies+the+brain+tissue+response+to+chronically+implanted+silicon+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays.</a> Exp Neurol. 195 (1), 115-126 (2005).</li>
<li>Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+microdrive+and+head+cap+system+for+silicon+probe+recovery+in+freely+moving+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent.</a> eLife. 10, e65859(2021).</li>
<li>IMEC Neuropixels 1.0 User Manual V1.0.8. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf">https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf</a> (2023).</li>
<li>Baranauskas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube+composite+coating+of+neural+microelectrodes+preferentially+improves+the+multiunit+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube composite coating of neural microelectrodes preferentially improves the multiunit signal-to-noise ratio.</a> J Neural Eng. 8 (6), 066013(2011).</li>
<li>Niell, C. M., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+visual+responses+by+behavioral+state+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of visual responses by behavioral state in mouse visual cortex.</a> Neuron. 65 (4), 472-479 (2010).</li>
<li>Okun, M., Carandini, M., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+immobile+silicon+probes+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+and+headgear+for+chronic+implant+and+recovery+of+optoelectronic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes.</a> Sci Rep. 7 (1), 2773(2017).</li>
<li>Bimbard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable%2C+reusable%2C+and+light+implant+for+chronic+Neuropixels+probes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive/">https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive/</a> (2024).</li>
<li>van Daal, R. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Neuropixels+probes+for+chronic+recording+of+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats.</a> Nat Protoc. 16 (7), 3322-3347 (2021).</li>
<li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS One. 9 (2), e88678(2014).</li>
<li>Groblewski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+head-fixation+system+for+performing+large-scale%2C+in+vivo+physiological+recordings+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice.</a> J Neurosci Methods. 346, 108922(2020).</li>
<li>Vasilev, D., Raposo, I., Totah, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brightness+illusions+evoke+pupil+constriction+preceded+by+a+primary+visual+cortex+response+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Brightness illusions evoke pupil constriction preceded by a primary visual cortex response in rats.</a> Cereb Cortex. 33 (12), 7952-7959 (2023).</li>
</ol>

TS, AN e MNH são co-fundadores da 3Dneuro BV, que fabrica os microdrives de código aberto e as coroas de Faraday usadas neste protocolo. FB e PT fazem parte do conselho consultivo científico da 33Dneuro B.V.. O FB e a PT não recebem qualquer compensação financeira por esta posição.

Este manuscrito apresenta um protocolo para a implantação rápida, segura e padronizada de sondas, que também permite a recuperação e reutilização da sonda ao final do experimento. A abordagem faz uso de um sistema modular de componentes de implante, especificamente um microdrive, que é compatível com todas as sondas de silício comuns e sistemas de gravação, uma placa de cabeça que pode ser usada para experimentos comportamentais fixos na cabeça e uma gaiola de Faraday vestível para proteger o implante. Essa constelação permite que os usuários adaptem de forma flexível seu implante a diferentes paradigmas experimentais, como comportamento de cabeça fixa versus comportamento de movimento livre ou miniaturização do implante (sem gaiola de Faraday) versus maior robustez de sinal de longo prazo (com gaiola de Faraday) - sem ter que sacrificar a padronização do implante no processo.
Essa abordagem torna os registros eletrofisiológicos crônicos mais padronizados (por meio de elementos pré-fabricados que não requerem montagem manual), menos dispendiosos (por meio da recuperação da sonda), menos demorados (simplificando as etapas da cirurgia) e mais facilmente compatíveis com o bem-estar e o comportamento animal (por meio da diminuição do tamanho do implante e da fixação da cabeça sem estresse). Como tal, este protocolo visa tornar os implantes eletrofisiológicos em roedores comportados acessíveis a uma gama mais ampla de pesquisadores além dos laboratórios pioneiros na vanguarda do campo.
Para atingir esse objetivo, o protocolo apresentado aqui minimiza o trade-off entre vários aspectos igualmente cruciais dos implantes de microdrive, ou seja, flexibilidade, modularidade, facilidade de implantação, estabilidade, custo geral, compatibilidade com o comportamento e reutilização da sonda. Atualmente, as abordagens disponíveis geralmente se destacam em alguns desses aspectos, mas a um custo alto para outros recursos. Por exemplo, para casos de uso que exigem estabilidade absoluta do implante por longos períodos de tempo, a melhor abordagem do implante pode ser cimentar diretamente a sonda no crânio25. No entanto, isso também evita a reutilização da sonda, bem como o reposicionamento dos locais de gravação em caso de má qualidade de gravação, e é incompatível com a colocação padronizada do implante. Da mesma forma, embora o acionamento AMIE forneça uma solução leve e de baixo custo para implantação recuperável de sondas, ele é limitado a sondas únicas e restrito na colocação das coordenadas alvo17. No extremo oposto do espectro, alguns nano-drives disponíveis comercialmente (ver Tabela 1 16,17,21,26,27,28,29,30) são extremamente pequenos, podem ser colocados livremente no crânio e maximizam o número de sondas que podem ser implantadas em um único animal 16. No entanto, eles são caros em comparação com outras soluções, exigem que os experimentadores sejam altamente qualificados para cirurgias de implantes bem-sucedidas e proíbem a reutilização da sonda. O microdrive desenvolvido por Vöröslakos et al.21, uma versão leve do qual também faz parte deste protocolo, sacrifica o tamanho pequeno do implante para melhor facilidade de uso, menor preço e reutilização da sonda
Tabela 1: Comparação de estratégias populares para implantes de sonda crônica em roedores. Disponibilidade: se o microdrive é de código aberto (para os pesquisadores construírem por conta própria), disponível comercialmente ou ambos. Modularidade: Os sistemas integrados consistem em um ou poucos componentes que estão em uma relação fixa entre si, enquanto os sistemas modulares permitem a colocação livre da sonda/microdrive em relação à proteção (engrenagem de cabeça/gaiola de Faraday) após a produção do implante (por exemplo, no momento da cirurgia). A modularidade foi determinada a partir de informações publicadas ou protocolos de implantação dos implantes listados. Fixação da cabeça: Sim: O implante possui mecanismos de fixação da cabeça integrados em seu design, X: O implante deixa o espaço para adicionar uma placa de cabeça extra para fixação sem grandes problemas, Não: O design do implante provavelmente cria problemas de espaço ou requer modificações substanciais no design para uso com a fixação da cabeça. Colocação da sonda: Restrito: A localização da sonda é limitada no estágio de projeto do implante. Flexível: A localização da sonda pode ser ajustada mesmo durante a cirurgia. Número de sondas: o número de sondas que podem ser implantadas. Observe que a implantação de sondas >2 em um camundongo representa um desafio significativo, independentemente do sistema de implante escolhido. Reutilização da sonda: sim, se as sondas puderem, em teoria, ser reutilizadas. Peso/tamanho: peso e volume do implante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Para criar um sistema que concilie mais facilmente estes diferentes requisitos, o implante DREAM foi concebido com base no implante Vöröslakos21, mas com várias modificações fundamentais. Primeiro, para reduzir o peso total do implante, o microdrive usado aqui é produzido em alumínio usinado em vez de aço inoxidável impresso em 3D, e a coroa de Faraday é miniaturizada, alcançando uma redução de peso geral de 1,2-1,4 g, dependendo da escolha do material da placa de cabeça (consulte a Tabela 2). Em segundo lugar, a placa de cabeça ao redor do microdrive foi projetada para permitir um mecanismo de fixação de cabeça integrado que permite uma fixação de cabeça rápida e sem estresse, ao mesmo tempo em que funciona como base para a gaiola de Faraday, dando acesso à maioria das áreas-alvo potenciais para gravações neuronais e adicionando apenas um peso mínimo ao implante. A forma plana do mecanismo de fixação e a falta de saliências também garantem um comprometimento mínimo do campo visual ou da locomoção dos animais (ver Figura 2A-C), uma clara melhoria em relação aos sistemas anteriores31,32. A coroa e o anel de Faraday fixados na placa de cabeça também foram substancialmente alterados em comparação com os designs anteriores. Eles agora não exigem nenhuma adaptação ad-hoc (por exemplo, em termos de colocação do conector) ou soldagem durante a cirurgia, removendo possíveis causas de danos ao implante e variação imprevisível na qualidade do implante. Em vez disso, o implante DREAM fornece várias variações padronizadas do anel coroa que permitem colocar cada conector em uma das quatro posições predefinidas, minimizando a variabilidade e o esforço durante a cirurgia. Finalmente, ao otimizar o sistema de implantes para recuperação de sondas, o implante DREAM permite que os experimentadores reduzam drasticamente o custo e o tempo de preparação por implante, uma vez que o microdrive e a sonda normalmente podem ser recuperados, limpos e reutilizados juntos.
Para uma visão geral mais exaustiva das compensações apresentadas por diferentes sistemas de implantes, consulte a Tabela 1. Embora a abordagem apresentada aqui geralmente não forneça desempenho máximo em comparação com todas as outras estratégias, por exemplo, em termos de tamanho, estabilidade ou custo, ela opera na faixa superior em todos esses parâmetros, tornando-a mais facilmente aplicável a uma ampla gama de experimentos.
Três aspectos do protocolo são particularmente cruciais para se adaptar a cada caso de uso específico: a constelação de terra e referência, a técnica para cimentar o microdrive e a validação do implante por meio de gravação neuronal. Primeiro, ao implantar os pinos de aterramento e referência, o objetivo era identificar o ponto ideal entre estabilidade mecânica/elétrica e invasividade. Embora, por exemplo, os fios de prata flutuantes embutidos em ágar sejam menos invasivos do que os parafusos ósseos33, eles provavelmente são mais propensos a se desalojar com o tempo. O uso de pinos, acoplado ao ágar, garante uma conexão elétrica estável, além de ter a vantagem de ser mais fácil de controlar durante a inserção, evitando traumas teciduais. É improvável que os pinos de aterramento cimentados no crânio se desloquem e, no caso de o fio se separar do pino, a recolocação geralmente é simples devido à maior área de superfície e estabilidade do pino implantado.
Tabela 2: Comparação dos pesos dos componentes entre o implante DREAM e o implante descrito por Vöröslakos et al.21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Em segundo lugar, a cimentação do microdrive geralmente deve ocorrer antes da inserção da sonda no cérebro. Isso evita o movimento lateral da sonda dentro do cérebro se o microdrive não estiver perfeitamente fixado no suporte estereotáxico durante a inserção. Para verificar o posicionamento da sonda antes de cimentar o microdrive no lugar, pode-se abaixar brevemente a ponta da haste da sonda para verificar onde ela entrará em contato com o cérebro, pois extrapolar a posição de pouso pode ser difícil devido ao deslocamento de paralaxe do microscópio. Uma vez estabelecida a posição do microdrive, pode-se opcionalmente proteger a craniotomia com elastômero de silicone antes de cimentar o microdrive para garantir que o cimento não entre em contato acidental com a craniotomia; No entanto, não é recomendado abaixar a sonda através do elastômero de silicone, pois os resíduos de elastômero de silicone podem ser puxados para o cérebro e causar inflamação e gliose.
Terceiro, dependendo do protocolo experimental utilizado, um registro de teste logo após a cirurgia pode ou não ser útil. Em grande parte, a atividade neuronal registrada logo após a inserção da sonda não será diretamente representativa da atividade registrada cronicamente, devido a fatores como inchaço cerebral transitório e movimento do tecido ao redor da sonda, o que significa que é improvável que tanto a profundidade de inserção quanto as formas de onda de pico se estabilizem diretamente. Como tal, as gravações imediatas podem servir principalmente para verificar a qualidade geral do sinal e a integridade do implante. Recomenda-se que o trenó móvel de microdrive seja utilizado nos dias subsequentes após a cirurgia, uma vez que o cérebro tenha se estabilizado para ajustar a posição. Isso também ajuda a evitar mover a sonda em mais de 1000 μm por dia, minimizando os danos ao local de gravação e, assim, melhorando a longevidade do local de gravação.
Finalmente, os usuários podem querer adaptar o sistema para gravar de mais de um local de destino. Como este sistema é modular, o usuário tem muita margem de manobra sobre como montar e colocar os componentes em relação uns aos outros (veja acima e a Figura Suplementar 3 e a Figura Suplementar 4). Isso inclui modificações que permitiriam que um vaivém estendido horizontalmente fosse montado no microdrive, permitindo que várias sondas ou grandes sondas de múltiplas hastes fossem implantadas, bem como a implantação de vários microdrives individuais (consulte a Figura Suplementar 3 e a Figura Suplementar 4). Tais modificações requerem apenas o uso de um anel de coroa adaptado, com um número maior de zonas de montagem para conectores/placas de interface/headstages. No entanto, as limitações de espaço desse design são ditadas pelo modelo animal, neste caso, o mouse, o que torna o empilhamento de várias sondas em um microdrive mais atraente em termos de pegada do que a implantação de vários microdrives independentemente uns dos outros. Os microdrives usados aqui podem suportar sondas empilhadas e, portanto, a única limitação real é o número de headstages ou conectores que podem se ajustar às restrições de espaço e peso definidas pelo modelo animal. Os espaçadores também podem ser usados para aumentar ainda mais os caminhos de montagem e inserção não verticais.
Em conclusão, este protocolo permite a implantação barata, leve e ajustável de uma sonda, com o benefício adicional de um design de microdrive que prioriza a recuperação da sonda. Isso aborda os problemas do custo proibitivo das sondas de uso único, a alta barreira das habilidades cirúrgicas e de implantação, bem como o fato de que as soluções comerciais para implantação crônica são muitas vezes difíceis de adaptar a casos de uso exclusivos. Essas questões representam um ponto problemático para os laboratórios que já usam eletrofisiologia aguda e um impedimento para aqueles que ainda não realizam experimentos de eletrofisiologia. Este sistema visa facilitar a aceitação mais ampla da pesquisa em eletrofisiologia crônica além dessas limitações.

<a href="https://app.jove.com/t/6665">This corrects</a> the article <a href="https://https://dx.doi.org/10.3791/66867">10.3791/66867</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66867">The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice

A eletrofisiologia com sondas de silício implantadas cronicamente emergiu como uma técnica poderosa para investigar a atividade neural e a conectividade em animais que se comportam, particularmente em camundongos, devido à sua tratabilidade genética e experimental1. As sondas laminares de silício, em particular, provaram ser uma ferramenta inestimável para identificar relações funcionais dentro das colunas corticais2 e para relacionar a dinâmica de grandes populações neuronais ao comportamento de uma forma que era impossível anteriormente3.
Duas abordagens complementares são os atuais padrões-ouro para registro da atividade neural in vivo: microscopia de dois fótons 4,5 e eletrofisiologia extracelular6. A escolha da metodologia de registro restringe a natureza das leituras que podem ser obtidas: a microscopia de dois fótons é particularmente adequada para estudos longitudinais de neurônios individualmente identificáveis em grandes populações ao longo do tempo, mas sofre de altos custos de equipamento e é limitada a camadas superficiais do córtex em cérebros intactos. Além disso, a resolução temporal típica de ~ 30 Hz limita sua capacidade de capturar a dinâmica neuronal em andamento 7,8.
Em contraste, os registros eletrofisiológicos oferecem alta resolução temporal (até 40 kHz) para rastrear a atividade neuronal momento a momento, podem ser aplicados amplamente em espécies, bem como em profundidades corticais, e têm configurações de custo relativamente baixo em comparação com a microscopia de dois fótons. No entanto, a identificação de neurônios individuais, bem como o rastreamento longitudinal de populações neuronais, são difíceis de alcançar. Isso se aplica especialmente a eletrodos de fio, por exemplo, tetrodos, e a inserções agudas de eletrodos. Além de não ter a capacidade de rastrear neurônios durante as sessões de gravação9, inserções agudas repetidas causam trauma local10 que monta uma resposta imune11, aumentando a chance de infecção e gliose. Em última análise, isso reduz a estabilidade da atividade neuronal registrada e a expectativa de vida dos animais experimentais, limitando o escopo dos estudos longitudinais com registros eletrofisiológicos agudos a apenas alguns dias12.
Os registros crônicos de sondas de silício de alta densidade visam combinar alguns dos melhores atributos da eletrofisiologia aguda e imagens de dois fótons. Eles podem rastrear a dinâmica da população neural em sessões com apenas uma capacidade um pouco reduzida de identificar neurônios individuais em comparação com imagens de dois fótons13. Essas gravações fornecem alta flexibilidade no posicionamento espacial e resolução temporal precisa dos sinais registrados, bem como maior longevidade e bem-estar dos animais experimentais em comparação com as gravações agudas14. Além disso, em contraste com os registros agudos, a eletrofisiologia crônica requer apenas um único evento de implantação, reduzindo efetivamente o risco de infecção e dano tecidual e minimizando o estresse nos animais15. Coletivamente, essas vantagens tornam a eletrofisiologia crônica uma ferramenta poderosa para investigar a organização e a função do sistema nervoso.
No entanto, as técnicas de implantação crônica comumente usadas para camundongos restringem os pesquisadores a fazer compensações significativas entre compatibilidade com registros comportamentais, peso do implante, replicabilidade dos implantes, custos financeiros e facilidade geral de uso. Muitos protocolos de implantes não são projetados para facilitar a reutilização de sondas16, aumentando drasticamente o custo efetivo de experimentos individuais e, portanto, dificultando financeiramente o uso de eletrofisiologia crônica por alguns laboratórios. Eles também costumam exigir um extenso trabalho interno de prototipagem e design, para o qual a experiência e os recursos podem não estar presentes.
Por outro lado, os sistemas integrados de implantes17 oferecem uma solução mais amplamente acessível para eletrofisiologia crônica em roedores. Esses sistemas são projetados para integrar um microdrive que segura a sonda com o restante do implante para simplificar o manuseio do implante e os procedimentos cirúrgicos. No entanto, uma vez implantados, esses sistemas podem ser pesados e limitar a capacidade do experimentador de adaptar de forma flexível um experimento a diferentes coordenadas-alvo. Muitas vezes, seu peso impede implantes em animais menores, potencialmente prejudica o movimento do animal e induz estresse18. Isso pode afetar desproporcionalmente a pesquisa em coortes juvenis e femininas, pois as limitações de peso têm maior probabilidade de afetar esses grupos.
Além disso, nem todos os sistemas integrados permitem o ajuste das posições dos eletrodos após o implante. Isso é relevante, pois gliose ou cicatrização devido à inserção da sonda19, especialmente nas 48 h iniciais após o implante20, podem reduzir a qualidade da atividade neuronal registrada. Microajustes na profundidade de inserção da sonda podem limitar esses efeitos negativos na integridade do sinal. Portanto, os mecanismos de microposicionamento, comumente chamados de microdrives, podem ser benéficos mesmo em sondas com um grande número de eletrodos distribuídos em seu comprimento.
Para superar essas compensações, apresentamos um novo sistema de implante de eletrofisiologia crônica para camundongos que aborda as limitações dos projetos anteriores, oferecendo uma solução leve, econômica e modular. O sistema de implantes DREAM foi concebido para pesar menos de 10% (~2,1 g) do peso corporal típico de um rato, garantindo o bem-estar animal e um impacto mínimo no comportamento. A validação do design do implante DREAM mostra um impacto mínimo nas principais métricas comportamentais, como a locomoção - que pode ser significativamente afetada em roedores quando as cargas são colocadas no crânio. Isso pode beneficiar paradigmas experimentais que utilizam animais que se movem livremente, bem como animais com a cabeça fixa, aumentando o bem-estar animal e permitindo experimentos mais etologicamente sólidos.
O sistema inclui um microdrive para ajuste flexível da profundidade de gravação de até 7 mm e pode ser adaptado a diferentes tipos de sondas e dispositivos de gravação, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta econômica e versátil para várias aplicações experimentais. O sistema é rotineiramente combinado com um microdrivemetálico 21, que oferece recuperação consistente da sonda em comparação com outros sistemas (taxa média de recuperação esperada: aprox. três reutilizações confiáveis por sonda) e reduz drasticamente o custo de experimentos individuais.
O design apresenta uma gaiola protetora de Faraday impressa em 3D, permitindo proteção barata e robusta contra ruídos eletrofisiológicos, impactos mecânicos e materiais infecciosos, permitindo gravações estáveis e sem ruído que sofrem com taxas mínimas de infecção. Esta gaiola implantável consiste na chamada 'coroa', projetada para proteção contra impactos e para fornecer estrutura para o revestimento de malha metálica condutora da gaiola de Faraday, e o anel da coroa, que serve como suporte para um amplificador implantável e/ou conector de sonda (ver Figura 1).
Finalmente, as placas de cabeça incluídas no sistema de implante modular são projetadas para serem compatíveis com um sistema de fixação de cabeça novo e eficiente sem adicionar volume extra ao implante. Ao contrário de outros sistemas existentes, não requer o aperto de pequenos parafusos próximos ao implante, acelerando a fixação de camundongos na configuração experimental e melhorando a relação experimentador-animal, bem como a aderência comportamental. Ao mesmo tempo, a placa de cabeça é utilizada como base para construir os outros módulos do sistema de eletrofisiologia crónica DREAM.
Os ficheiros de design para o implante DREAM são publicados como hardware de código aberto na https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/. Nas secções seguintes, será descrito o desenho e o fabrico do sistema de implantes DREAM, será demonstrada a sua implementação bem sucedida num modelo de ratinho e serão discutidas as suas potenciais aplicações e vantagens em comparação com os sistemas existentes.

<table><tbody><tr><td>Soquete de cauda de solda de 0,05"</td><td>Mill-Max</td><td>853-93-100-10-001000</td><td></td></tr><tr><td>1,1'-dioctadecil-3,3,3',3' - Perclorato tetrametilindocarbocianina reagente ('DiI'; DiIC18(3))</td><td>ThermoFisher</td><td>D282</td><td>Corante lipofílico usado para facilitar a verificação histológica da localização da sonda</td></tr><tr><td>Massa adesiva (Blu-Tack)</td><td>Bostik</td><td>308590110</td><td>Variações (por exemplo, da Pritt) devem estar disponíveis na sua papelaria</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td>Faça com soro para condutividade.</td></tr><tr><td>Amplificador (Miniamp-64)</td><td>Cambridge Neurotech</td><td></td><td>Amplificador e digitalizador miniatura e implantável. Uso alternativo de digitalizador implantável ou conector Omnetics implantável possível.</td></tr><tr><td>Creme Analgésico (EMLA Cream)</td><td>Aspen</td><td>39699/0088</td><td>Creme analgésico usado para dor operatória contendo prilocaína, lidocaína.</td></tr><tr><td>Espaçador Angulado</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Espaçador inclinado para montagem não perpendicular por acionamento... Open surce, também disponível no https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/</td></tr><tr><td>LED de cura de luz azul</td><td>B.A. Internacional</td><td>818223</td><td>Luz de cura para polimerização do primer. Comprimento de onda de 420-480 nm</td></tr><tr><td>Cera óssea</td><td>SMI</td><td>Z046</td><td>Cera para proteger craniotomia e sonda após a cirurgia.</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Elanco Europe LTD</td><td>401513</td><td>Solução injetável de buprenorfina (0,3 mg/mL)</td></tr><tr><td>Malha de cobre</td><td>Dexmet</td><td>3CU6-050FA</td><td>Malha de cobre usada para proteger eletricamente e fisicamente a sonda e a craniotomia.</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato (Loctita)</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td>Cola gel de cianoacrilato</td></tr><tr><td>Cimento Odontológico (SuperBond C& B)</td><td>Sun Medical</td><td>K058E</td><td>Cimento dentário (SuperBond)</td></tr><tr><td>Creme de Depilação (Veet)</td><td>Veet</td><td>310000091434</td><td>Creme depilatório para remoção de pelos ao redor do local cirúrgico.</td></tr><tr><td>Enrofloxacina (Baytril)</td><td>Elanco Europe LTD</td><td>00879/4117</td><td>Solução injetável de enrofloxacina (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>Coroa Faraday</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Gaiola protetora implantável impressa em 3D. Open surce, também disponível no https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/</td></tr><tr><td>Anel de Faraday</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Anel protetor implantável impresso em 3D para gaiola de Faraday. Open surce, também disponível no https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/</td></tr><tr><td>Esponja Hemostática</td><td>SMI</td><td>ZHG101010</td><td>Esponja hemostática de gelatina absorvível</td></tr><tr><td>Tubo termoretrátil</td><td>Hellermann Tyton</td><td>TA32-9/3 BK</td><td>Tubo termo-retrátil para fazer pinças de ponta macia</td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Braunol</td><td>9322507</td><td>Solução aquosa de povidona-iodo.</td></tr><tr><td>Metamizole (Novalgin)</td><td>Sanofi-Aventis Gmbh</td><td>4527098</td><td>Metamizol Injetável (500mg/mL)</td></tr><tr><td>Metamizole (Novalgin)</td><td>Sanofi-Aventis Gmbh</td><td>1553758</td><td>Solução de metamizole</td></tr><tr><td>Microdrive (R2Drive)</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Micro drive metálico recuperável com transporte móvel. Open surce, também disponível em https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/</td></tr><tr><td>Óleo Mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310-100ML</td><td>Óleo usado como solvente para criar gel protetor contra craniotomias.</td></tr><tr><td>Lenços Lenços Não Removentes (Kimtech)</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td>Lenços que não descascam de pelo</td></tr><tr><td>Introdução</td><td>Bisco</td><td>B-7202P</td><td>Adesivo universal para crânios que impede que a umidade deteriore o cimento e fornece uma base sólida para acumular cimento.</td></tr><tr><td>Suporte R2Drive</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Acessório estereotáxico para montar o R2Drive. Open surce, também disponível em https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/</td></tr><tr><td>Faixa autoaderente</td><td>3M</td><td>VB050</td><td>Faixa protetora para implante após a cirurgia</td></tr><tr><td>Sonda de silício (H2)</td><td>Cambridge Neurotech</td><td></td><td>Sonda linear de silício cronicamente implantável com 32 canais. Uso alternativo da Sonda possível.</td></tr><tr><td>Elastomero de silicone (Duragel)</td><td>Cambridge Neurotech</td><td></td><td>Elastômero de silicone</td></tr><tr><td>Reboco de silicone (Kwikcast)</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Epóxi condutor de prata</td><td>MG Chemicals</td><td>8331D-14G</td><td>Epóxi de prata</td></tr><tr><td>Pinça Dumont tamanho 5</td><td>FSTools</td><td>11251-10</td><td>Pinças pequenas para levantar o retalho ósseo.</td></tr><tr><td>Fio de aço inoxidável, revestido a Teflon</td><td>Produtos Científicos GmBH</td><td>SS-3T</td><td>Fio terra</td></tr><tr><td>Estereotaxe (tração traseira)</td><td>RWD</td><td>68803</td><td>Stereotax para procedimentos cirúrgicos em camundongos.</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Alconox</td><td>1304</td><td>Um possível limpador enzimático para limpar a sonda</td></tr><tr><td>Resina Epóxi de Endurecimento Rápido em Duas Partes</td><td>Gorilla</td><td>EP3</td><td>Epóxi para ligação permanente das partes do implante DREAM.</td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Vannas Cabo Redondo</td><td>FSTools</td><td>15403-08</td><td>Tesoura veterinária de rebote com mola de ponta reta de 0,075mm.</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato veterinário (Vetbond)</td><td>3M</td><td>70-0068-5256-3</td><td>Cola de cianoacrilato veterinária</td></tr></tbody></table>

o implante dream: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice

Registros eletrofisiológicos crônicos em roedores melhoraram significativamente nossa compreensão da dinâmica neuronal e sua relevância comportamental. No entanto, os métodos atuais para implantar sondas cronicamente apresentam grandes compensações entre custo, facilidade de uso, tamanho, adaptabilidade e estabilidade a longo prazo.
Este protocolo apresenta um novo sistema de implante de sonda crônica para camundongos chamado DREAM (Dynamic, Recoverable, Economical, Adaptable e Modular), projetado para superar as compensações associadas às opções atualmente disponíveis. O sistema fornece uma solução leve, modular e econômica com elementos de hardware padronizados que podem ser combinados e implantados em etapas simples e explantados com segurança para recuperação e reutilização múltipla de sondas, reduzindo significativamente os custos experimentais.
O sistema de implantes DREAM integra três módulos de hardware: (1) um microdrive que pode transportar todas as sondas de silício padrão, permitindo que os experimentadores ajustem a profundidade de gravação em uma distância de deslocamento de até 7 mm; (2) um design tridimensional (3D) imprimível e de código aberto para uma gaiola de Faraday vestível coberta com malha de cobre para blindagem elétrica, proteção contra impactos e colocação de conectores, e (3) um sistema de fixação de cabeça miniaturizado para melhorar o bem-estar animal e a facilidade de uso. O protocolo de cirurgia correspondente foi otimizado para velocidade (duração total: 2 h), segurança da sonda e bem-estar animal.
Os implantes tiveram impacto mínimo no repertório comportamental dos animais, foram facilmente aplicáveis em contextos de movimento livre e cabeça fixa e forneceram formas de onda de pico claramente identificáveis e respostas neuronais saudáveis por semanas de coleta de dados pós-implante. Infecções e outras complicações cirúrgicas foram extremamente raras.
Como tal, o sistema de implantes DREAM é uma solução versátil e económica para a electrofisiologia crónica em ratinhos, melhorando o bem-estar animal e permitindo experiências mais etologicamente sólidas. Seu design simplifica os procedimentos experimentais em várias necessidades de pesquisa, aumentando a acessibilidade da eletrofisiologia crônica em roedores a uma ampla gama de laboratórios de pesquisa.

Este protocolo apresenta um sistema de implantação crônica que permite aos pesquisadores implementar registros de eletrofisiologia crônica leves, econômicos e seguros em camundongos que se comportam (Figura 1). Os principais fatores que determinam a aplicação bem-sucedida dessa abordagem incluem: cobertura completa de cimento do crânio, uma craniotomia minimamente invasiva e devidamente protegida, fixação segura do microdrive e da fiação ao crânio e continuidade completa do material protetor de Faraday. Quando esses pontos são contabilizados, gravações de alta qualidade podem ser alcançadas de forma consistente. Aqui são mostrados resultados representativos relativos aos seguintes aspectos principais do sucesso da cirurgia:
1) O implante está interferindo no comportamento ou no bem-estar animal? 2) A qualidade do sinal é alta e os sinais podem ser mantidos por longos períodos de tempo? 3) As gravações podem ser combinadas facilmente com o desempenho da tarefa?
Para avaliar o impacto do implante no comportamento animal, analisamos padrões de locomoção rastreados em cinco animais implantados. A Figura 2A mostra um exemplo de um animal se movendo livremente dentro de uma gaiola de brincar por 10 minutos antes e 1 semana após o implante. Pode-se ver que os padrões de movimento permanecem inalterados. Esta observação é confirmada pela Figura 2B, C mostrando as distribuições das velocidades de movimento e direções da cabeça entre os animais. Tanto a velocidade de corrida quanto as direções da cabeça permaneceram praticamente inalteradas antes e depois da implantação e, no mínimo, as velocidades de corrida pareciam ligeiramente elevadas após a cirurgia. O Vídeo Suplementar 1 mostra uma pequena gravação de vídeo de um animal 6 dias após a cirurgia de implantação. Comportamentos típicos de gaiolas domésticas, como locomoção, higiene, criação e forrageamento no ambiente doméstico, são visíveis e indicam uma recuperação bem-sucedida da cirurgia, bem como a saúde geral. O baixo impacto comportamental do implante é provavelmente devido ao seu baixo peso e altura gerenciável.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig02.jpg"> Figura 2: Locomoção antes e após a cirurgia. (A) Exemplo de locomoção de um animal antes (painel esquerdo) e após a implantação (painel direito). As coordenadas x/y estão em centímetros, os pontos mostram a posição do animal em cada ponto de tempo durante um período de 10 min. (B) Distribuição das velocidades de movimento em cm/s por 5 sessões antes e 3 sessões após a implantação em 5 animais. (C) Densidade de kernel para probabilidade de movimento em diferentes direções, para as mesmas sessões analisadas em (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em seguida, a qualidade do sinal no Potencial de Campo Local (LFP) e a atividade de pico nos locais de gravação são avaliadas. Aqui, mostramos dados representativos de gravações corticais no córtex visual primário (V1). Para validação, a atividade putativa de unidade única foi extraída de sinais neuronais de banda larga registrados em V1 de um camundongo acordado usando Kilosort 3 (ver Figura 3). A Figura 3A mostra a localização das unidades únicas extraídas na haste da sonda, a Figura 3B mostra as formas de onda de pico correspondentes e a Figura 3C mostra as respostas de pico dos mesmos neurônios a um protocolo de densidade de fonte de corrente (CSD). Nesse paradigma, flashes de campo amplo foram apresentados com uma duração de 300 ms a uma frequência de 1 Hz (ou seja, 300 ms ligado, 700 ms desligado) em 200 tentativas. Finalmente, a Figura 3D mostra as respostas das mesmas unidades a um protocolo de mapeamento de campo receptivo visual, consistindo em 2000 quadros de quadrados pretos e brancos selecionados aleatoriamente em um fundo cinza, e cada um apresentado por 16,6 ms. Os quadrados cobriam 12 graus de ângulo visual cada e foram selecionados a partir de um campo de 15 x 5 locais possíveis para que o paradigma de mapeamento cobrisse um espaço visual de -90 a +90 graus de azimute e -30 a +40 graus de elevação no total. As respostas da taxa de disparo a cada quadro de estímulo foram extraídas analisando a taxa máxima de disparo em uma janela de 16,6 ms, sujeita a um atraso entre 40-140 ms, identificada como ideal por canal com base na atividade máxima em cada janela. Esse tipo de registro pode ser usado para orientar o ajuste da profundidade de inserção de cada eletrodo e avaliar a qualidade do sinal após a cirurgia de implante.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig03.jpg"> Figura 3: Sinais neuronais registrados. (A) Localização inferida de unidades únicas classificadas pelo pacote de classificação de pico Kilosort 3 ao longo dos contatos do eletrodo da sonda. (B) Formas de onda de pico para as mesmas unidades mostradas em A em 5 ms de tempo. Linhas finas: Formas de onda de pico individuais. Linhas grossas: Forma de onda média de pico. (C) Gráfico raster de picos em resposta a um paradigma de densidade de fonte de corrente (CSD) apresentando flashes de campo amplo de 300 ms seguidos por uma tela preta de 700 ms. As respostas são mostradas para as mesmas unidades que em A e B. Linhas coloridas sobrepostas representam histogramas de tempo peri-estímulo (PSTHs) das mesmas respostas. As taxas de disparo para os PSTHs foram calculadas em compartimentos de 10 ms e depois normalizadas pela taxa máxima de disparo em todo o PSTH. O tempo 0 é centrado em torno do estímulo do flash de campo amplo. (D) Campos receptivos estimados das mesmas unidades que em AC, medidos por um paradigma de Mapeamento de Campo Receptivo de Ruído Esparso. Cada gráfico mostra a atividade média da taxa de disparo em uma janela de análise de 16,6 ms em resposta ao início (painel esquerdo) ou deslocamento (painel direito) de estímulos quadrados brancos e pretos. Os estímulos foram apresentados com duração de 16,6 ms, localizados aleatoriamente em uma grade quadrada de 5 x 15 abrangendo 180 graus de ângulo visual horizontalmente e 70 graus de ângulo visual verticalmente. A atividade da taxa de disparo foi marcada em z em toda a grade do campo receptivo (veja a barra de cores). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A qualidade da gravação permaneceu alta em gravações repetidas por semanas a meses. A Figura 4A mostra registros longitudinais de LFP de um animal ao longo de 15 semanas. LFPs foram registrados em resposta ao paradigma CSD descrito acima (ver Figura 3A-C). A Figura 4A mostra as respostas LFP médias de 500 ms após o início do flash. Neste exemplo, usamos uma sonda linear com 32 canais, com uma distância entre eletrodos de 25 μm. Observe que, no dia 18, a profundidade da sonda foi ajustada, deslocando-a para baixo em 600 μm. Antes e depois desse ajuste, os sinais LFP permaneceram estáveis ao longo dos dias de gravação.
Consistente com isso, formas de onda de pico de unidades únicas putativas eram discerníveis em muitas gravações. A Figura 4B mostra exemplos representativos de formas de onda de pico de três sessões de gravação ao longo de um mês de gravações, demonstrando que a atividade de uma única unidade pode ser identificada com sucesso ao longo do tempo. A Figura 4C mostra o número total de unidades individuais putativas extraídas de registros crônicos em seis animais, abrangendo uma janela de até 100 dias. As unidades individuais foram definidas de acordo com os critérios padrão do kilosort 3.0 (ver Tabela Suplementar 1). Como se pode ver, o número de unidades únicas claramente definidas normalmente chegava a ~ 40 na primeira semana após o implante e, em seguida, caiu gradualmente, movendo-se em direção a uma assíntota aparentemente estável de ~ 20 unidades. Dado que essas gravações foram conduzidas usando sondas lineares de 32 canais, isso equivale a um rendimento esperado de cerca de 1,25 unidades únicas por eletrodo diretamente após o implante, diminuindo para aprox. 0,65 unidades únicas por eletrodo em gravações de longo prazo. A conexão repetida ao amplificador/conector do implante durante as sessões não pareceu afetar a qualidade da gravação ou a estabilidade do implante, uma vez que a coroa de Faraday que segura o amplificador/conector pode suportar forças repetidas de mais de 10 Newton, uma ordem de magnitude maior do que até mesmo as forças máximas de acoplamento exigidas pelos conectores padrão (consulte o Vídeo Suplementar 2).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig04.jpg"> Figura 4: Estabilidade das gravações neuronais ao longo do tempo. (A) Atividade média de LFP em resposta a um estímulo CSD flash de campo amplo, mostrado em todos os 32 canais de uma sonda cronicamente implantada de 3 a 110 dias após o implante. A linha vertical vermelha denota a sonda sendo abaixada para um novo local devido à gravação dos canais 0-8 de fora do cérebro no dia 18 após a cirurgia. (B) Formas de onda de pico de três unidades de exemplo do mesmo implante crônico registradas repetidamente ao longo de quatro semanas. Linhas finas: Formas de onda de pico individuais. Linha sobreposta grossa: forma de onda média de pico. (C) O número de unidades individuais putativas detectadas pelo Kilosort 3 ao longo dos dias de registro para 6 animais (ver legenda inserida). O quadrado vermelho denota os dias em que a sonda foi movida. A linha pontilhada denota o número de eletrodos por implante usados nessas gravações (32). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Finalmente, ao fornecer um sistema modular, incluindo um microdrive, bem como uma gaiola de Faraday vestível e uma placa de cabeça que funciona como uma base de implante e um dispositivo para fixação da cabeça, este protocolo permite a integração da eletrofisiologia crônica com o comportamento de fixação da cabeça. Aqui, são mostrados dados de exemplo de mouses atravessando um ambiente virtual em uma esteira esférica. A Figura 5A mostra a atividade de pico relacionada à corrida de 20 unidades em um teste de exemplo. A Figura 5B mostra as relações diversas, mas robustas, entre a velocidade de corrida e a atividade de pico de unidades individuais classificadas por picos, bem como uma média populacional para o mesmo efeito na Figura 5C, confirmando o efeito bem estabelecido da atividade locomotora na atividade neuronal em roedores V124.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig05.jpg"> Figura 5: Respostas neuronais durante o comportamento de cabeça fixa. (A) Gráfico raster de respostas de unidade única em um teste de exemplo, com velocidade de corrida (linha roxa) e taxas médias de disparo em todas as unidades únicas (linha azul clara) sobrepostas. (B) Atividade de unidade única durante diferentes categorias de velocidade de corrida, mostrada para seis unidades de exemplo. (C) Atividade média de pico em todas as unidades individuais em uma sessão de exemplo, plotada nos cinco quintis da distribuição de velocidade de corrida. As velocidades de corrida nesta sessão variaram de 0 a 0,88 metros/segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela suplementar 1: Tabela mostrando os parâmetros padrão usados pelo Kilosort 3 ao identificar unidades únicas nas gravações mostradas na Figura 3, Figura 4 e Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo Suplementar 1: Vídeo mostrando a atividade locomotora animal pós-implante. O vídeo feito após 5 dias de fase de recuperação está completo, mostrando o comportamento locomotor normal, bem como a adaptação ao tamanho e peso do implante. O animal pode ser visto normalmente explorando uma gaiola de brincar contendo enriquecimento ambiental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20video%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Vídeo suplementar 2: Vídeo mostrando a força sendo aplicada na coroa de Faraday montada. As forças suportadas pela coroa de Faraday são aproximadamente uma ordem de magnitude maior do que a força de conexão necessária para conectores padrão, como conectores nano polarizados de 4 pinos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Video%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 1: Figura mostrando imagens do suporte da unidade. Os arquivos de design imprimíveis podem ser encontrados no repositório Github correspondente (https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 2: Modelo para malha de cobre. Imprima o modelo com a escala original e use o estêncil para cortar a malha de cobre (etapa 2.12). Use a barra de escala para verificar e, se necessário, ajustar a escala da impressão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 3 suplementar: Série de fotos mostrando as etapas de montagem do implante durante a cirurgia. Dois microdrives, bem como dois amplificadores, estão instalados neste caso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 4: Desenho do crânio do rato com exemplo de colocação de unidades, craniotomias (em verde) e pino GND/REF (em vermelho). A localização do pino é sugerida devido à colocação no cerebelo, o que provavelmente não interfere nos registros corticais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui, apresentamos um sistema de implante de sonda leve e econômico para eletrofisiologia crônica em roedores otimizado para facilidade de uso, recuperação de sonda, versatilidade experimental e compatibilidade com o comportamento.

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

Chronic electrophysiological recordings in rodents have significantly improved our understanding of neuronal dynamics and their behavioral relevance. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Compreender os substratos neurais do comportamento requer gravação de conjunto de circuitos cerebrais. Devido à sua tratabilidade genética, o camundongo oferece um modelo para dissecção de circuitos e mimetismo de doenças. Aqui, é descrito um método de projetar e fabricar sondas miniaturizadas que é adequado para atingir a estrutura cerebral profunda do mouse.

Projeto e fabricação de Ultraleve Peso, ajustável Sondas Multi-eletrodo para gravações eletrofisiológicas em Ratos

Aqui, descrevemos um projeto de micro-unidade, procedimento de implante cirúrgico e estratégia de recuperação pós-cirurgia que permitem gravações crônicas de campo e unidade única de várias regiões cerebrais simultaneamente em camundongos jovens e adolescentes através de uma janela crítica de desenvolvimento do dia pós-natal 20 (p20) ao dia pós-natal 60 (p60) e além.

Um implante de acionamento leve para gravações crônicas de tetrodo em camundongos juvenis

Aqui, apresentamos um implante exclusivo e imprimível em 3D para ratos, denominado TD Drive, capaz de gravações bilaterais simétricas de eletrodos de fio, atualmente em até dez áreas cerebrais distribuídas simultaneamente.

O TD Drive: um implante paramétrico de código aberto para registros eletrofisiológicos de várias áreas em ratos que se comportam e dormem

Este protocolo foi desenvolvido para criar um sistema confiável e de fácil acesso para registrar EEG de roedores em movimento livre.

Um protocolo econômico e minimamente invasivo para gravação crônica de eletroencefalografia em vários locais em camundongos que se movem livremente

Nós apresentamos um método de baixo custo para projetar e construir uma luz headstage sistema de pré-amplificador com a gravação simultânea e capacidade neural estimulação. Este dispositivo pode ser impermeabilizado para uso em animais de natação.

Concepção e Construção de um Headstage Custo Efetivo de Estimulação Neural Simultânea e Gravação no labirinto aquático

Controle Neural e processos cognitivos podem ser estudados por meio de movimentos oculares. O software VisualEyes permite que um operador para programar estímulos em duas telas de computador usando de forma independente uma linguagem simples, scripts personalizados. O sistema pode estimular os movimentos oculares em tandem (saccades e exercício suave) ou movimentos oculares opostas (vergence) ou qualquer combinação.

VisualEyes: Um sistema de software modular para Experimentação Oculomotor

Descrevemos o projeto e montagem de fones de ouvido miniaturizados adequados para a substituição de um feedback do Songbird auditiva natural com um sinal acústico manipulado. Hardware de processamento on-line de som é usado para manipular a saída música, introduzir em tempo real erros no feedback auditivo através dos fones de ouvido, e dirigir a aprendizagem motora vocal.

Um leve, sistema de fones baseado para manipular feedback auditivo em Songbirds

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Modelos animais de implantes cocleares podem avançar o conhecimento das bases tecnológicas de tratamento de perda de audição neurossensorial permanente com estimulação elétrica. Este estudo apresenta um protocolo cirúrgico para agudo ensurdecedor e implante coclear de uma matriz de eletrodo em ratos, bem como a avaliação funcional com auditivo de tronco encefálico.

Cirurgia de implante coclear e gravações de resposta eletricamente evocado auditivo do tronco encefálico em camundongos C57BL/6

O protocolo apresentado produz um persistente conflito sensorial para experimentos vista estudar aprendizagem a longo prazo. Permanentemente usando um dispositivo fixo em suas cabeças, ratos são continuamente expostos à incompatibilidade sensorial entre visuais e vestibulares entradas ao mover-se livremente em jaulas em casa.

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Aprenda a usar o implante DREAM para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre. Este sistema modular e econômico permite registrar atividade neuronal durante tarefas de realidade virtual.

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre (Vídeo) | JoVE Journal

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

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